Revista de Salud Animal

UPDATE AND PERSPECTIVES ON THE DIAGNOSIS OF AVIAN INFLUENZA VIRUS

El virus de la influenza aviar provoca infección, enfermedad y muerte en diferentes especies de aves, además ha adquirido la capacidad de propagarse del hospedador aviar a humanos y otros mamíferos, provocando una enfermedad grave. Por ese motivo, existe una gran preocupación a nivel internacional en la detección del virus de la influenza aviar y las estrategias de diagnóstico. A pesar que los métodos de laboratorios convencionales son ampliamente usados para el aislamiento e identificación de los virus y para la detección de anticuerpos específicos en todo el mundo, nuevas tecnologías han sido rápidamente desarrolladas. Con el empleo de las herramientas moleculares se puede realizar en un mismo día de la detección, patotipificación y caracterización filogenética de los virus de influenza obtenidos a partir muestras clínicas.

Avian influenza virus causes infection, disease and death on different bird species and has also acquired the capability of transmiting from avian species to humans and other mammals causing severe diseases. For that reason, there is a great international concern on avian influenza virus detection and diagnostic strategies. Although conventional laboratory methods used for isolation and identification of the virus and for detection of specific antibodies continued to be widely applied, new technologies have been rapidly developed. With the use of molecular tools detection, pathotyping, and phylogenetic characterization of influenza A viruses obtained from clinical specimens can be done on the some day.

ANIMAL PRODUCTION AND AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGIES: NEW CHALLENGE

La «revolución ganadera» a través del rápido crecimiento de la demanda de productos pecuarios, ha creado oportunidades para aumentar el bienestar de una parte de los casi 1 000 millones de personas pobres del mundo, cuyos medios de vida dependen de la ganadería. Las innovaciones tecnológicas han conducido a cambios sociales y económicos y han desempeñado una función fundamental en el aumento de la calidad de vida y de la seguridad de animales y de seres humanos. En las cuatro décadas pasadas ha habido una oleada sin precedente en el desarrollo de la biotecnología en la producción animal y la salud. Una gran mayoría de estas tecnologías se han desarrollado y utilizado en países desarrollados; sin embargo tienen el potencial para aliviar la pobreza y hambre, reducir las amenazas de enfermedades y asegurar continuidad ambiental en países en vías de desarrollo. En este artículo intentaremos abordar una serie de interrogantes sobre el uso de las biotecnologías ganaderas en los países en desarrollo, relacionadas con cuán extendido está el uso de las mismas en estos países, cuáles son las principales razones para el éxito o el fracaso de su aplicación en esas condiciones, qué opciones tienen los países en desarrollo para tomar decisiones sobre la implementación de las tecnologías apropiadas que permitan el incremento de seguridad alimentaria, entre otras.

The «livestock revolution» through the fast growth of the cattle products demand, has created opportunities for increasing the well-fare of part of almost 1 000 million poor people in the world, whose livelihood depend on livestock. Technological innovations have led to social and economic change. They have played a pivotal role in enhancing the quality of life and safety of animals and humans. In the last four decades there has been an unprecedented surge in the development of biotechnology in animal production and health. Although vast majority of these technologies has been developed and used in developed countries, they have the potential to alleviate poverty and hunger, to reduce the threats of diseases and ensure environmental sustainability in developing countries. In this article we will try to approach a series of questions about the use of the livestock biotechnologies in the developing countries, related to how extended is the use of them in these countries, which are the main reasons for the success or failure of their application in those conditions, which options have the developing countries to make decisions on the implementation from the appropriate technologies that allow the increase of nourishing security, among others.

**ANALYSIS OF Anaplasma marginale STRAINS USING THE REPEATED SEQUENCES OF MAJOR SURFACE PROTEIN 1a (MSP1a)**

Anaplasma marginale es un patógeno del ganado bovino, que causa severas pérdidas económicas en las regiones tropicales y subtropicales. Las proteínas principales de superficie de los cuerpos iniciales de este hemoparásito están involucradas en las interacciones patógeno-hospedero y garrapata-patógeno y han sido utilizadas como marcadores para la caracterización genética de cepas de Anaplasma marginale y estudios filogenéticos. La proteína MSP1a varía entre cepas de regiones geográficas diferentes en el número y secuencias de las regiones repetidas en tandem en la región amino-terminal. En el presente estudio caracterizamos 24 cepas de Anaplasma marginale utilizando la secuencia descrita para la proteína MSP1a. Estos resultados corroboran la heterogeneidad de cepas de Anaplasma marginale en regiones endémicas y que el análisis filogenético de las secuencias repetidas en tandem de esta proteína MSP1a no resulta en clusters relacionados con el origen geográfico de las cepas, pero contribuye a entender la diversidad genética y la evolución de A. marginale.

Anaplasma marginale is a pathogen for cattle, causing severe economic losses in tropical and subtropical regions. The major surface proteins of initial bodies are involved in pathogen-host and tick-pathogen interactions and have been used as markers for the genetic characterization of Anaplasma marginale strains and for phylogenetic studies. MSP1a protein varies between strains of different geographical regions in the number and sequence of tandem repeated sequences in the amino-terminal region. In this study, 24 Anaplasma marginale strains were characterized using the sequence described for MSP1a protein. These results support the heterogeneity of Anaplasma marginale strains in endemic regions and that the phylogenetic analysis of tandem repeated sequences of this MSP1a protein does not result in clusters related to the geographical origin of strains, but helps to understand the genetic diversity and evolution of Anaplasma marginale.

**DETECTION OF Anaplasma marginale IN BOVINE, USING THE msp5 GENE AMPLIFICATION BY PCR**

Anaplasma marginale es una rickettsia del genogrupo II de las Ehrlichias, que parasita los eritrocitos maduros del ganado bovino. Hasta el momento no se cuenta con un método de control eficaz contra la enfermedad, por lo que resulta de gran importancia desarrollar un inmunógeno capaz de prevenir la infección con este patógeno. A esto se le agrega la necesidad de contar con técnicas de diagnóstico más sensibles para ser utilizadas en el movimiento internacional de ganado hacia zonas libres de la enfermedad, que permitan la detección de animales portadores, así como para conocer la prevalencia de la enfermedad en las regiones tropicales y subtropicales. El gen msp5 está representado en el genoma como una simple copia, altamente conservado entre todas las especies de Anaplasma y todas las cepas de A. marginale, por lo que resulta un importante candidato para ser utilizado en el diagnóstico. En el presente trabajo se realizó la amplificación por PCR de dicho gen para la detección de Anaplasma marginale en 113 animales sin síntomas clínicos de la enfermedad, de los cuales 96 resultaron positivos para Anaplasma marginale, resultando el ensayo altamente sensible y específico.

Anaplasma marginale is a rickettsia of Ehrlichias genogroup II. It parasites mature erythrocytes in bovines. There is not still an effective control method against the disease; thus it is of great importance to develop an immunogene able to prevent infection by this pathogen. There is also a need of having more sensitive diagnostic techniques which allow the detection of carrier animals in order to be used in cattle international movement towards areas free of the disease; as well as to know the prevalence of the disease in tropical and subtropical regions. Gene msp5 is represented in the genome as a simple copy; it is highly preserved among all Anaplasma species and all A. marginale strains; thus it is an important candidate for being used in diagnostic. In this paper, the amplification by PCR of such gene was carried out for the detection of Anaplasma marginale in 113 animals without clinical symptoms, from which 96 were positive to this microorganism, being the assay highly sensitive and specific.

In vitro EXPRESSION IN Escherichia coli OF THE vlhA.5.02 GENE FRAGMENT, A MEMBER OF THE MAJOR HEMAGLUTININ FAMILY OF Mycoplasma gallisepticum

Mycoplasma gallisepticum es el agente etiológico fundamental del síndrome respiratorio crónico de los pollos; constituye el micoplasma más importante desde el punto de vista económico para la avicultura. Un fragmento de ADN de aproximadamente 800pb de este microorganismo, amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir del plásmido pTTQ18 recombinante, se clonó en el vector de expresión pQE-32. El polipéptido se expresó fusionado a una secuencia de seis histidinas, por lo que la talla final fue de 31kDa, y se detectó mediante inmunotransferencia con un antisuero policlonal contra M. gallisepticum y con un anticuerpo monoclonal contra histidina. El polipéptido se purificó mediante cromatografía de afinidad con quelatos metálicos níquel-ácido nitrilotriacético, lográndose aproximadamente un 90% de pureza.

Mycoplasma gallisepticum, the causal agent of the chronic respiratory disease of chickens, is the most economically significant for poultry industry. An 800pb DNA fragment of Mycoplasma gallisepticum which was amplified from the recombinant vector pTTQ18 was cloned into the expression vector pQE-32. The polypeptide was expressed as a fusion protein to 6X-histidine tag; hence its final size was 31kDa. It was detected by Western blott being recognized by a polyclonal antiserum to M. gallisepticum, as well as by a monoclonal antibody to histidine. The polypeptide was purified by nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) metal-affinity cromatography yielding a final product of nearly 90% of purity.

**ISOLATION AND IDENTIFICATION OF Ornithobacteriun rhinotracheale FROM LAYING HENS IN FARMS OF LA HABANA PROVINCE**

Respiratory infection is the most serious disease affecting poultry and causing great economic losses to the poultry industry worldwide. In avian host, several microorganisms of the genus Pasteurella (P. multocida, P. gallinarum and P. anatipestifer), Bordetella (B. avium) and Avibacterium paragallinarum) were involved in respiratory diseases complex. Ornithobacterium rhinotracheale is a recently discovered bacterium, of worldwide distribution in commercial poultry, in which it is associated to respiratory diseases and it is also found in wild birds. Airsacculitis and pneumonia are the most common symptoms of infection with O. rhinotracheale. Isolation and identification of pathogenic bacteria associated to respiratory diseases were carried out from a total of 80 samples of animals collected in four different periods from 4 farms in the western region in Cuba. In total 16(20%), 15(18%), 9(11%) and 4(5%), isolates were identified as P. multocida, E.coli, M.haemolytic and O. rhinotracheale. The O. rhinotracheale strains were isolated from infraorbital sinus exudates of animal with clinical symptoms and these strains were identified by biochemical test and by amplification of a fragment of 16S rRNA which was analysed by enzymatic restriction, the fragments with the expected size were obtained. This work is the first report of the presence of O.rhinotrachelae by culture and molecular method in layer hens in farms from the Western region in Cuba.

Las enfermedades respiratorias en las aves son de gran importancia por su impacto económico en la conversión alimenticia, disminución en la producción de huevos, incremento en el costo de medicamentos. En hospederos aviares varios microorganismos de los géneros Pasteurella (P. multocida, P. gallinarum and P. anatipestifer), Bordetella (B. avium) and Avibacterium paragallinarum) están asociados al complejo respiratorio. Ornithobacterium rhinotracheale es una bacteria de reciente descubrimiento, de amplia distribución mundial, asociada con enfermedades respiratorias, también está presente en aves salvajes. La aerosaculitis y neumonía son los síntomas más comunes de la infección por O.rhinotracheale. El objetivo de este trabajo es la identificación de bacterias asociadas a procesos respiratorios en aves ponedoras específicamente en 80 muestras de animales procedentes de 4 granjas de la región occidental. Del total de muestras 16(20%), 15(18%), 9(11%) y 4(5%) correspondieron a P. multocida, E.coli, M.haemolytic and O. rhinotracheale. Las cepas de O. rhinotracheale se identificaron por pruebas bioquímicas, se confirmaron, análisis de restricción por amplificación de un fragmento del RNAr16s. Se obtuvieron los tamaños esperados. Este trabajo constituye el primer reporte de la identificación y presencia de O.rhinotracheale por cultivo y métodos moleculares en gallinas ponedoras en granjas de la región occidental.

EVALUATION OF Brucella abortus S19 STRAIN FOR THE CONTROL OF BOVINE BRUCELOSIS IN ACTOPAN MUNICIPALITY, STATE OF VERACRUZ, MEXICO

Para evaluar la eficacia de la cepa S19 de Brucella abortus en hatos bovinos del municipio de Actopan, Veracruz que presentan una prevalencia baja de brucelosis, se emplearon 162 hembras procedentes de tres hatos, con prácticas de manejo y alimentación similares; estas fueron seleccionadas de manera aleatoria y divididas en dos grupos de 81 animales cada uno. Al primer grupo se les administró 2 mL de cepa S19 de Brucella abortus, con dosis clásica (5 X 10(10) Unidades Formadoras de Colonias) a las becerras de tres a seis meses de edad y con dosis reducida (3 X 10(8) a 3 X 10(9) Unidades Formadoras de Colonias), a las hembras de más de seis meses, incluso gestantes. El otro grupo se manejó como grupo control sin vacunar. Todos los animales fueron muestreados para serología cada tres meses durante 18 meses. Los sueros se procesaron por la prueba de tarjeta como tamiz y los reactores fueron confirmados por la de Rivanol según la NOM041ZOO1995. Los resultados se analizaron con Chi-cuadrado (X²) y riesgo relativo (RR). La prevalencia inicial fue de 0% para ambos grupos. En el primer muestreo post vacunación, cinco animales pertenecientes al grupo vacunado, resultaron positivos a la prueba de Rivanol, para una prevalencia de 3.3% y aunque en el resto de los muestreos, la seroconversión disminuyó, dos hembras del grupo vacunado se mantuvieron como positivas para una prevalencia final de 2%. El grupo control mantuvo en 0% la prevalencia durante todo el estudio. Se concluye que la cepa S19 de Brucella abortus no es recomendable en hatos con prevalencia baja debido a que induce la producción de anticuerpos postvacunales que se conservan hasta por más de 18 meses, lo que interfiere con el diagnóstico oficial de la brucelosis.

For evaluating the efficacy of Brucella abortus S19 strain in bovine herds with a low brucellosis prevalence, 162 females were randomly selected from three herds with similar management conditions and feeding in Actopan, Ver. and then divided into two groups of 81 each. The first group was vaccinated with 2 ml of S19 Brucella abortus strain suspension with 3 X 10(8) to 3 X 10(9) colony forming units (CFU) dose for females older than six months including pregnant and those between three and six months with 5 X 10(10) CFU. The other one was used as unvaccinated control group. All selected animals were blooded every three months for 18 months. Collected serum was processed by card test (CT) as screening assay and reactors were confirmed by Rivanol test (RIV) in agreement with NOM 041 ZOO 1995. Results were analyzed by chi square (Xi²) and relative risk (RR). Initial prevalence was 0% for both groups. At first sampling after vaccination, RIV identified five positive animals from the vaccinated group for 3.3% prevalence; nevertheless, serum conversion decreased to 2% for the next sampling. Thus, two females from the vaccinated group remained as positives during the remaining samplings, so final prevalence was 2%. The control group kept 0% prevalence during all study. It was concluded that to vaccinate low prevalence herds with Brucella abortus strain S19 is not useful due to serum conversion inducing antibodies than could remain over 18 months, thus interfering with official diagnosis procedures for brucellosis.

MATERNAL DERIVED ANTIBODIES AGAINST CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS IN PIGLETS FROM SOWS IMMUNIZED WITH A VACCINE CANDIDATE OF SUBUNIT PROTEIN (E2)

Con el objetivo de determinar la duración de la inmunidad pasiva en cerdos procedentes de madres inmunizadas con un candidato vacunal de subunidad proteica E2 contra el virus de la peste porcina clásica (VPPC) y con la vacuna viva atenuada de la cepa China (LABIOFAM), se inmunizaron seis cochinatas seronegativas al VPPC con el candidato vacunal de subunidad proteica E2 y seis cerdas con antecedentes de tres inmunizaciones como mínimo con la vacuna viva atenuada de la Cepa China lapinizada y tiempo máximo de 6 meses transcurridos desde la última aplicación con la propia vacuna viva atenuada de la Cepa China. La primera dosis del candidato vacunal se aplicó después de la detección del celo y la segunda dosis 21 días después, mientras que se aplicó una dosis de la vacuna viva atenuada de la Cepa China una semana antes de la cubrición. Se conformaron dos grupos con los cerdos procedentes de las madres inmunizadas con una y otra vacuna respectivamente. Se determinaron los títulos de anticuerpos maternos neutralizantes desde la segunda hasta la octava semana de edad. Los cerdos procedentes de madres inmunizadas con el candidato vacunal de subunidad proteica E2 mostraron títulos de anticuerpos maternos significativamente superiores durante el periodo evaluado con duración de los títulos protectivos hasta las 8 semanas de edad. En los cerdos procedentes de madres inmunizadas con la vacuna viva atenuada se observaron títulos de anticuerpos maternos protectivos hasta la segunda semana de edad.

To determine the duration of maternal neutralizing antibodies in their offspring, six gilts seronegative to classical swine fever virus (CSFV) were immunized with the subunit vaccine candidate against CSFV based on glycoprotein E2. A first dose of the vaccine candidate was applied after detection of estrus, and a second dose 21 days later. Six sows with at least three previous immunizations with the live modified vaccines based on the Chinese lapinised strain and maximum of 6 months since the last application of the vaccination were immunized with one dose of live modified vaccine based on the Chinese lapinised strain (LABIOFAM) a week before detection of estrus. Two groups were conformed with offspring from both groups of sows. The maternal derived antibodies titers from 2 weeks to 8 weeks old were determined. The maternal derived antibodies titers of subunit vaccine candidate E2 were significantly higher during the period evaluated with a duration of protective titers until 8 weeks of age. In offspring from mothers vaccinated with the live attenuated vaccine protective maternal derived antibodies titers until the second week of age were observed.

COMPARISON OF MANUAL AND MECHANICAL MILKING: PREVALENCE OF SUBCLINICAL MASTITIS AND MICROORGANISMS ASSOCIATED WITH MASTITIS, IN PERNAMBUCO, BRAZIL

Se estudiaron 11 propiedades productoras de leche bovina del estado de Pernambuco, Brasil; seis con ordeño manual y cinco con ordeño mecánico. Los rebaños estaban constituidos por animales de varias razas, edades y periodos de lactación. Se tomaron muestras de 185 vacas, resultando en 708 cuartos muestreados. Antes de colectar se realizó la prueba de California (CMT), con independencia de este resultado fueron colectadas muestras para cultivo microbiológico y conteo de células somáticas (CCS) y composición. Se obtuvieron prevalencias de 39,3% y 54,8% (CMT), 57,2% y 63,3% (diagnóstico microbiológico), 33,4% y 49,4% (CCS), para ordeño manual y mecánico respectivamente. Se aislaron microorganismos patógenos en el 61% de las muestras con mayor prevalencia para Corynebacterium sp. (45,0%), Staphylococcus sp. (29,6%) y Streptococcus sp. (14,6%) en ordeño manual; Staphylococcus sp. (36,4%), Corynebacterium sp. (27,6%), Micrococcus sp. (15,6%) y Streptococcus sp. (12,9%) en ordeño mecánico. Los rebaños ordeñados mecánicamente tuvieron mayor prevalencia de mastitis subclínica, tanto para el diagnóstico por CMT, como para CCS y cultivo bacteriológico; con diferencias significativas en CMT y CCS. El patrón de sensibilidad de los patógenos hallados indicó mayor susceptibilidad hacia la combinación Neomicina-Bacitracina-Tetraciclina (NBT), Florfenicol (FLF), Cefquinome (CEQ) y Enroflorxacina (ENO) en ese orden; la Oxacilina (OXA) resultó ser el antimicrobiano con menor porciento de sensibilidad entre los patógenos.

Eleven dairy properties from Pernambuco State in Brasil were studied; six with hand milking and five with machine milking. The herds were constituted by animals of several races, ages and lactation periods. 185 cows were studied, resulting in 708 quarters sampled. Before sampling, the California Mastitis Test (CMT) was carried out independently of this result samples were collected for microbiologic cultures and Somatic Cells Counts (SCC) and milk composition. Prevalencies of 39,3% and 54,8% (CMT); 57,2% and 63,3% (microbiologic culture); 33,4% and 49,4% (SCC) were obtained for hand and machine milking respectively. Pathogens were isolated in 61% of the samples with higher prevalence for Corynebacterium sp. (45.0%), Staphylococcus sp. (29.6%) and Streptococcus sp. (14.6%) in hand milking; Staphylococcus sp. (36.4%), Corynebacterium sp. (27.6%), Micrococcus sp. (15.6%) and Streptococcus sp. (12.9%) in machine milking. Mechanically milked herds had higher prevalence of subclinical mastitis, both for diagnosis by CMT, as for CCS and bacteriological culture with significant differences in CMT and CCS. The sensibility pattern of the pathogens indicated bigger susceptibility for the combination Neomicine-Bacitracine-Tetracicline (NBT), Florfenicol (FLF), Cefquinome (CEQ) and Enroflorxacine (ENO) in that order; Oxaciline (OXA) was the antimicrobial with smaller percent of sensibility among the pathogens.

EFFECT OF STABILAK^® ON THE DETERMINATION OF BETALACTAM ANTIBIOTICS USING THE SNAP TEST (SNAP^® BETA-LACTAM TEST KIT) IN RAW MILK

El STABILAK® es un producto cubano, basado en la activación del sistema lactoperoxidasa, que posibilita conservar la leche cruda sin refrigeración. Fue objetivo de este trabajo determinar si el uso del STABILAK afecta la detección de penicilina mediante la prueba SNAP. Su empleo no interfirió en la determinación de penicilina (5-10 ng/mL) a través de dicha prueba, en leche activada y reactivada.

STABILAK® is a cuban product, based on the activation of lactoperoxidase system that allows to conserve raw milk without refrigeration. The aim of this work was to determine if the use of STABILAK affects the detection of penicillin using the SNAP test. Its use didn't interfere in this method, in activated and reactivated milk.

DETECTION OF Anaplasma marginale AND Babesia bovis BY nPCR IN BUFFALOS FROM THE WESTERN REGION OF CUBA

IDENTIFICATION IN BIRDS OF THE Stenotrophomonas maltophilia PROVINCE OF HAVANA, CUBA