Revista de Protección Vegetal

**Potentialities of associated diazotrophic bacteria in plant growth promotion and biocontrol of Pyricularia oryzae (Sacc.) in rice (Oryza sativa L.)**

Este trabajo tuvo como objetivos abordar las potencialidades de uso de bacterias diazotróficas asociativas en la producción sostenible del cultivo del arroz (Oryza sativa L.), tratando temas como la fertilización nitrogenada y su relación con la incidencia en la piriculariosis, añublo o quemazón, así como sus perspectivas de uso en la promoción del crecimiento y control de Pyricularia oryzae Sacc. Al aplicar bacterias diazotróficas asociativas se logran aportes de nitrógeno atmosférico a la planta que permiten disminuir el uso de productos químicos nitrogenados y con ello limitar el crecimiento de P. oryzae. Estas bacterias, además, liberan metabolitos en la rizosfera que disminuyen la concentración de la plaga y la severidad de la enfermedad, lo que trae consigo reducciones en la aplicación de productos químicos y menor incidencia de la piriculariosis en condiciones de campo. Cepas autóctonas cubanas tienen la capacidad de controlar in vitro a P. oryzae, lo que sugiere que las bacterias diazotróficas asociativas que estimulan el crecimiento vegetal, pudieran disminuir los efectos nocivos ocasionados por esta plaga en el cultivo del arroz.

This work was aimed at approaching the potentialities of associated diazotrophic bacteria for the sustainable production of rice (Oryza sativa L.). Relevant topics such as nitrogen fertilization, its relationships with rice blast incidence, and the perspectives of use of associated diazotrophic bacteria for plant growth promotion and biocontrol of Pyricularia oryzae in this important crop are discussed. Associated diazotrophic bacteria have been shown to contribute with fixed atmospheric nitrogen to the rice crop making possible to reduce the application of nitrogen fertilizers, limiting with it the growth of Pyricularia oryzae. In addition, the metabolites released by these bacteria in the rhizosphere make the plague concentration and the disease severity decrease leading to the reduction of chemical product applications and a lower incidence of rice blast under field conditions. Cuban autochthonous strains have the ability to control Pyricularia oryzae in vitro, which confirms the fact that associated diazotrophic bacteria stimulate plant growth and mitigate the deleterious effects caused by this disease in rice.

**Microbial antagonists to manage black pod rot in Theobroma cacao L: Their present status and perspective use in Cuba**

Este trabajo tuvo como objetivo valorar las perspectivas de empleo de antagonistas microbianos en el manejo integrado de la pudrición negra del fruto del cacao (Theobroma cacao L.), provocada por especies del género Phytophthora. Se resumen los principales componentes de manejo de la pudrición negra del fruto, tales como control químico, métodos culturales, resistencia genética y control biológico, profundizando en el uso y perspectivas de hongos y bacterias antagonistas. Los antagonistas microbianos constituyen una alternativa a utilizar dentro del manejo integrado del cultivo, ya que pueden mitigar los efectos deletéreos ocasionados por Phytophthora spp. Dentro de los principales mecanismos que utilizan estos antagonistas para su acción se encuentran: parasitismo, competencia y producción de metabolitos antifúngicos. Las cepas autóctonas cubanas de bacterias promotoras del crecimiento vegetal presentan actividad antagonista in vitro e in vivo ante Phytophthora palmivora (Butl) Butl, lo que sugiere sus potencialidades para el manejo de la pudrición negra del fruto de cacao.

This work was aimed to demonstrate the perspective use of microbial antagonists in the integrated management of Black pod rot in T. cacao. Some of the main management strategies of Black pod rot are summarized, making emphasis on the use and perspectives of microbial antagonists for the control of Phytophthora spp. Microbial antagonists are suggested as an alternative in cacao pest management since they could mitigate the deleterious effects caused by Phytophthora spp. Microbial antagonists exert their action mainly through parasitism, competence, and production of antifungal metabolites. Native Cuban strains have antagonistic activity in vitro and in vivo against P. palmivora, which suggests their potentialities for the production of efficient bioproducts as one of the alternatives for the integrated management of cacao.

Gene overexpression in two cultivars of Solanum phureja Juz. et. Buk. in interaction with Spongospora subterranean (Wallr.) Lagerh

Con el fin de contribuir a un mejor conocimiento de los mecanismos que rigen la interacción entre Solanum phureja Juz. et. Buk. y Spongospora subterranea (Wallr.) Lagerh, agente causal de la sarna polvosa de la papa, se realizó en esta investigación el análisis del transcriptoma de dos cultivares: Criolla Colombia (susceptible) y Criolla Latina (tolerante), mediante pirosecuenciación 454. Los resultados indicaron diferencias entre los genes sobreexpresados en cada cultivar ante la infección con el patógeno. En el cultivar susceptible, la respuesta ocurre a partir de la activación transcripcional de genes asociados a la integridad de la pared celular, transducción de señales y genes involucrados en la respuesta a diferentes tipos de estrés. Los genes que codifican para metalotioneína (3297 veces), fosfatasa 2C (2128 veces) y un inhibidor de pectinmetilesterasa (2127 veces) fueron los más sobreexpresados en este cultivar. Por su parte, en el cultivar tolerante los niveles de sobreexpresión de genes fueron moderados, con sólo dos genes (un gen putativo y a-Galactosidasa) siendo transcritos más de 1000 veces, con respecto a las plantas sin inocular. Estos resultados sugieren que la tolerancia a S. subterranea de este cultivar, incluye también mecanismos de defensa constitutivos. Finalmente, mediante ensayos de qRT-PCR se confirmó la sobreexpresión de tres de los genes identificados en el transcriptoma del cultivar Criolla Latina.

For a better understanding of the molecular mechanisms involved in the interaction between Solanum phureja Juz. et. Buk. and Spongospora subterranean (Wallr.) Lagerh, the causal agent of powdery scab disease, a 454 transcriptome analysis was carried out using one susceptible (Criolla Colombia) and one tolerant (Criolla Latina) potato cultivars. The results revealed a marked difference in the overexpression pattern for each cultivar. In the susceptible cultivar, the response was based on the activation of genes associated with cell-wall integrity, signal transduction and stress-related genes. The most overexpressed genes were those coding for methalothionein (3297 times), phosphatase 2C (2128 times) and a pectin methylesterase inhibitor (2127 times). Overexpression in the tolerant cultivar was moderate with only two genes (a putative gene and a-Galactosidase) being transcribed more than 1000 times compared with the non-inoculated control suggesting an important constitutive defense response. Overexpression of three genes in the Criolla Latina transcriptome was confirmed by qRT-PCR.

Effect of different culture media on Phytophthora nicotianae Breda de Haan develop

El objetivo del estudio fue determinar el efecto de diferentes medios de cultivo sobre el crecimiento, esporulación y secreción de enzimas hidrolíticas de Phytophthora nicotianae Breda de Haan. Para ello se emplearon los medios en estado sólido y líquido: Papa Dextrosa Agar (PDA), jugo de verduras (V8) y extracto de tabaco, combinados entre ellos y con suplemento de asparagina y carbonato de calcio. El mayor crecimiento del microorganismo se produjo en medio sólido con extracto de tabaco, pues alcanzó en menor tiempo el extremo de la placa; sin embargo, su crecimiento fue poco ramificado, a diferencia de los que contenían V8. Se comprobó que la biomasa producida fue mayor en los medios líquidos que contenían V8. El número de zoosporas estimadas en el momento en que el micelio alcanzó el borde de la placa fue significativamente mayor en el tratamiento que combinaba PDA con V8 y el menor valor se obtuvo al emplearse el extracto de tabaco. Al utilizarse la combinación del extracto de tabaco con V8, se obtuvieron las mayores actividades poligalacturonasa y xilanasa. Los resultados evidenciaron que los medios que favorecen la expresión de enzimas hidrolíticas, así como el crecimiento y esporulación de P. nicotianae, tienen V8 entre sus componentes, elemento de gran importancia, pues se disminuye el tiempo requerido para los ensayos y con ello el riesgo de contaminación de los experimentos.

The effect of different culture media on Phytophthora nicotianae growth, sporulation, and hydrolytic enzymes secretion was studied. The liquid and solid culture media used were potato dextrose agar (PDA), vegetable juice (V8), and tobacco extract. They were combined one another and supplemented with asparagine and calcium carbonate. Phytophthora nicotianae growing on solid media containing only tobacco extract reached the plate edge in the shortest time; however, the mycelium was little branched, unlike the mycelium in the media containing V8. A greater biomass production was observed in liquid culture with V8. The zoospore number was significantly higher in the treatment combining PDA only with V8; the lowest number was obtained with tobacco extract. Polygalacturonase and xylanase activities were the highest when the liquid media contained the combination of tobacco extract and V8 juice. The culture medium V8 was shown to be useful to determine the enzymatic activity of the hydrolytic enzymes and the parameters of growth and sporulation of P. nicotianae; itreduced the time required for the trials and, consequently, the risk of contamination.

**Genetic diversity determined by its-aflp analysis of Trichoderma spp. in Venezuela**

Se estudió la diversidad genética entre 68 aislados de Trichoderma procedentes de diferentes cultivos, sustratos y localidades, mediante los análisis ITS-AFLP. Se secuenció la región ITS1-5.8S-ITS2 del ADN ribosomal amplificada con los cebadores ITS1 e ITS4 y en el caso de los AFLP se utilizaron cuatro combinaciones de oligonucleótidos. Las relaciones genéticas entre los aislados se analizaron mediante el uso combinado del Análisis de Coordenadas Principales, el Análisis de Conglomerados y el ajuste de un Biplot Logístico Externo sobre datos de disimilitud, utilizando los coeficientes de Jaccard, Emparejamiento simple, Dice y Rogers y Tanimoto. Se identificaron nueve especies y las más abundantes fueron Hypocrea lixii (anamorfoTrichoderma harzianum) y T. koningiopsis representadas por 22 y 20 aislados, respectivamente. Le siguen Hypocrea virens (anamorfo T. virens), Trichoderma ghanense; Trichoderma asperellum y Trichoderma brevicompactum con 7, 6, 4 y 4 aislados respectivamente. Las especies menos frecuentes fueron Trichoderma erinaceum con dos aislados y Trichoderma spirale y Trichoderma longibrachiatum con un aislado cada una. Los AFLP formaron cuatro grupos, correspondiendo uno de ellos al 99,52 % de los aislados de Trichoderma asperellum, otros dos agruparon al 85,54 y 50% de H virens y H. lixii, respectivamente. Las otras seis especies se ubicaron el cuarto grupo, y no pudieron ser diferenciadas entre si. El iniciador con mayor contenido de Información Polimórfica fue AG+CAG, que además permitió separar la especie H. lixii del resto. La combinación AG+CAG separó a T. asperellum de las otras especies.

The genetic diversity among 68 Trichoderma isolates from different cultivars, substrates and localities was established by ITS-AFLP analysis. The ribosomal DNA region ITS1-5.8S-ITS2 was sequenced and amplified with the primers ITS1 and ITS4. In the case of AFLP, four oligonucleotide combinations were used. The genetic relationships between isolates were analyzed by the combined use of Principal Component Analysis, Cluster analysis, and the adjustment of an External Logistic Biplot over dissimilarity data using Jaccard, simple coupling, Dice and Rogers, and Tanimoto coefficients. Nine species were identified, and the most abundant were Hypocrea lixii (anamorf Trichoderma harzianum) and T. koningiopsis, with 22 and 20 isolates respectively. They were followed by Hypocrea virens (anamorf T. virens), Trichoderma ghanense; Trichoderma asperellum and Trichoderma brevicompactum, with 7, 6, 4 and 4 isolates, respectively. The least frequent species were Trichoderma erinaceum, Trichoderma spirale and Trichoderma longibrachiatum (2, 1 and 1 isolates, respectively). All the isolates clustered in four AFLP groups, with one containing 99,52% of T. asperellum, and the others with 85,54% and 50% of H. virens and H. lixii, respectively. The other six species grouped together in the four group, and were indistinguishable from one another. The most informative initiator was AG+CAG showing the greatest content of polymorphic information, and which additionally allowed discriminating H. lixii from the other isolates. AG+CAG combination clearly separated T. asperellum from the other species.

**Insects in Morus alba L. and Moringa oleifora Lamark**

Se realizaron muestreos en plantas de Morus alba L. y Moringa oleifora Lamark ubicadas en zonas de la provincia La Habana (Cuba), entre los meses de febrero y octubre del 2012. Los insectos colectados se identificaron con el auxilio de claves taxonómicas. Se hallaron cuatro especies de larvas desfoliadoras pertenecientes al orden Lepidoptera, cuyos ciclos culminaron en el laboratorio. Las especies identificadas fueron, Stigmene acraea (Drury), Glyphodes sybillalis Walker, Maenas jussiaeae (Poey) y Spodoptera latisfacia. Estos insectos constituyen nuevos hallazgos para estas plantas arbustivas en Cuba.

Four species of defoliating larvae belonging to the order Lepidoptera were observed in plants of Morus alba L. and Moringa oleifora Lamark in Havana province between February and October 2012.The larvae completed their cycles at the laboratory. The species identified were Stigmene acraea (Drury), Glyphodes sybillalis Walker, Maenas jussiaeae (Poey) and Spodoptera latisfacia. These insects are new findings for these bushy plants in Cuba.

Molecular diversity of begomoviruses in the pepper crop in Cuba

El objetivo de este trabajo fue determinar la diversidad molecular de begomovirus asociados al cultivo del pimiento en Cuba. Para ello, en el periodo 2006- 2010 se realizó una prospección de begomovirus en las principales áreas de producción de pimiento en Cuba. Se colectaron 600 muestras foliares de plantas que mostraron síntomas típicos de enfermedades virales y de estas se seleccionaron al azar 50 por región para su evaluación. El ADN total extraído se evaluó mediante una PCR con cebadores universales a begomovirus (Palv1978/PARc496). A partir de muestras positivas se amplificó su ADN genómico circular completo mediante la amplificación en círculo rodante. Los productos se caracterizaron mediante análisis de restricción, utilizando las enzimas Sac I, BamH I, Hind III, Cla I, Kpn I, Sal I, Pst I. Se detectó infección por begomovirus en el 100% de las muestras evaluadas mediante PCR con cebadores universales, sugiriendo la presencia de estos virus en áreas de este cultivo de las tres regiones del país. Los enzimas Sac I, Bamh I, Sal I y Pst I produjeron un corte en sitios únicos en los ADN circulares obtenidos, liberando un único fragmento lineal de la talla esperada (2.6-2.7 Kb) en estas muestras. Los resultados obtenidos muestran la posible presencia de diferentes especies de begomovirus circulando en el cultivo, la ocurrencia de recombinantes virales de los informados previamente o la presencia de los dos componentes genómicos en estas muestras. Se evidenció diversidad molecular de estas especies en el cultivo del pimiento en Cuba.

The main areas for pepper production in Cuba were surveyed during 2006-2010 to determine the molecular diversity of the begomoviruses in this crop. Six hundred leaf samples with typical symptoms of viral diseases were collected, and from them, 50 samples per region were randomly selected for their evaluation. The total DNA extracted from each sample was previously tested by conventional PCR using begomovirus universal primers (Palv 1978/PARc496). The positive samples were used as a template for the full-length circular genome amplification by Rolling Circle Amplification. The amplified products were characterized by restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) with the enzymes Sac I, BamH I, Hind III, Cla I, Kpn I, Sal I, Pst I.Begomovirus infection was detected in 100% of the samples evaluated by conventional PCR, suggesting the presence of these viruses in all the regions of the country. The enzymes Sac I, Bamh I, Sal I and Pst I produced unique cuts in unique sites in the isolated genomes liberating a unique fragment with the expected length (2.6-2,7kb), and detecting four polymorphic profiles in these samples. The obtained results show the possible presence of different begomoviruses species circulating in the crop, the occurrence of viral recombinants of previously informed or the presence of the two viral components in these samples. These results could also be associated with the presence of the two viral components in these samples. It was made evident the molecular diversity in these species of begomoviruses in the pepper crop in Cuba.

Effect of four essential oils on phytopathogenic fungi associated with spotted rains i n rice

Este trabajo tuvo como objetivo determinar la actividad antifúngica in vitro de cuatro aceites esenciales sobre tres patógenos causantes del manchado del grano en arroz (Curvularia lunata (Wakker) Boedijn, Sarocladium oryzae (Sawada) W. Gams & D. Hawksworth y Bipolaris oryzae (Breda de Haan) Shoemaker). El bioensayo se realizó según un diseño completamente aleatorizado, se utilizó el método de discos de papel de filtro inoculados con los aceites, colocados en contacto directo con los discos de los hongos fitopatógenos. Se evaluó el crecimiento radial de los hongos diariamente hasta las 96 horas. Los aceite de Piper auritum Kunth (caisimón de anís) y Piper aduncum subsp. ossanum (C. DC.) Saralegui (platanillo de Cuba) produjeron inhibición total del crecimiento en los tres aislados. De igual modo, el de Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake (melaleuca) afectó el crecimiento de S. oryzae y B. oryzae; mientras que, el de Citrus sinensis (L.) Osbeck (naranjo dulce) solo inhibió a B. oryzae. Los aceites de P. aduncum y P. auritum, resultaron ser los más destacados. Se sugiere continuar investigando en el empleo de estos como fungicidas.

This study was aimed to determine the in vitro antifungal activity of four essential oils on three pathogens causing spotted grains in rice Curvularia lunata (Wakker) Boedijn, Sarocladium oryzae (Sawada) W. Gams & D. Hawksworth and Bipolaris oryzae (Breda de Haan) Shoemaker. The bioassay was performed as a completely randomized design; the method used consisted of filter paper disks soaked with the oils and placed in direct contact with the phytopathogenic fungi. The radial growth was evaluated daily for 96 hours. The oils of Piper auritum Kunth (Caisimón anise) and Piper aduncum subsp. ossanum (C. DC.) Saralegui (Platanilllo of Cuba) produced complete growth inhibition of the three isolates. Similarly, the oil of Melaleuca quinquenervia (Cav) ST Blake (melaleuca) affected the growth of S. oryzae and B. oryzae, while that of Citrus sinensis (L.) Osbeck (sweet orange) inhibited only B. oryzae growth. The oils of P. aduncum and P. auritum were the most prominent; further research on their use as fungicides is suggested.

In vitro **antagonism of bacterial strains against Macrophomina phaseolina Tassi (Goid)**

Se evaluó el control in vitro de Burkholderia cepacia (cepa CCIBP-E-556), Serratia plymuthica (cepa ATCC 1270) y Bacillus subtilis (cepa ATCC 6051), sobre Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid, utilizando el método de cultivo dual.Se midió el radio de la colonia del hongo y se determinó el porcentaje de inhibición del crecimiento radial. B. cepacia produjo el mayor efecto sobre el aislado de M. phaseolina, provocando un porcentaje de inhibición del 43,5%, y ocasionando cambios en la apariencia del micelio, que se observaron en la zona de inhibición con el uso del microscópico óptico. Por su parte, S. plymuthica y B. subtilis provocaron valores de inhibición del crecimiento micelial en M. phaseolina por debajo del 10%, lo que indica que dichas cepas no poseen potencial como agentes de control biológico de este fitopatógeno. Se deben efectuar estudios posteriores con la cepa de B. cepacia a nivel de casa de cultivo y campo, para determinar su utilidad en el control biológico del fitopatógeno.

The in vitro control of strains of Burkholderia cepacia, Bacillus subtilis and Serratia plymuthica against Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid was evaluated by the dual culture method. The radius of the fungal colony was measured, and the inhibition percentage of the radial growth determined. The B. cepacia strain showed the strongest inhibitory effect on the M. phaseolina isolate with a 43.5% of inhibition, also causing changes in the mycelium appearance on the inhibition zone, which were observed with the optical microscope. S. plymuthica and B. subtilis showed values of mycelia growth inhibition lower than 10% indicating that these strains were not useful as biological controls of this pathogen. Greenhouse and field studies on the B. cepacia strain are required to determine its potential use as a biological control agent of the pathogen.

**Molecular characterization of sexual mating type in Cubans Mycosphaerella fijiensis Morelet isolates**

Los hongos poseen grupos de apareamiento sexual que controlan la especificidad de su reproducción. En Mycosphaerella fijiensis Morelet, existen dos grupos MAT 1-1-1 y MAT 1-2-1. El objetivo del presente trabajo, consistió en caracterizar molecularmente aislados cubanos de M. fijiensis a partir de la información disponible de las secuencias de sus ideomorfos. Se utilizaron nueve aislados de M. fijiensis, obtenidos a partir de hojas necrosadas de Grande naine, procedentes de plantaciones de cinco localidades de Cuba (Ciego de Ávila, Santa Clara, Santo Domingo, Remedios y Vueltas). Los oligonucleótidos (MfMAT1-2-1 y MfMAT1-1-1) fueron diseñados a partir de la información disponible de las secuencias de los ideomorfos correspondientes a los genes MAT1-1-1 y MAT1-2-1 de M. fijiensis.Se lograron amplificar fragmentos de ADN de 307 y 546 pares de bases mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), correspondientes con los grupos de apareamiento mat 1-1 en cinco aislados (CCIBP-Pf34, CCIBP-Pf39, CCIBP-Pf57, CCIBP-Pf66, CCIBP-Pf80) y cuatro pertenecientes al mat 1-2 (CCIBP-Pf54, CCIBP-Pf64, CCIBP-Pf110, CCIBP-Pf83).Se demostró molecularmente la presencia de ambos grupos de apareamiento sexual en aislados cubanos de M. fijiensis y se ratificó el carácter heterotálico de esta especie. Este resultado facilitará la obtención in vitro y en casa de cultivo del estado sexual de M. fijiensis, al disponer de aislados compatibles sexualmente.

Fungi have sexual mating types that control the specificity of their reproduction. In Mycosphaerella fijiensis, the sexual reproduction is determined by two groups of sexual mating (MAT1-1-1 and MAT 1-2-1). The aim of this study was the molecular characterization of Cuban isolates of M. fijiensis from the available information of their idiomorph sequences. Nine isolates of M. fijiensis were obtained from necrosed leaves of Grande naine in five Cuban localities (Ciego de Ávila, Santa Clara, Santo Domingo, Remedios and Vueltas). The oligonucleotides MfMAT1-1-1 and MfMAT1-2-1 were designed from the information available of the sequences of the gene ideomorphs MAT1-1-1 and MAT1-2-1 of M. fijiensis. DNA fragments of 307 and 546 base pairs were amplified using the polymerase chain reaction technique (PCR). Five M.fijiensis isolates (CCIBP-Pf34, CCIBP-PF39, Pf57-CCIBP, CCIBP-Pf66, CCIBP-PF80) corresponded with the mating groups MAT1-1-1 and four isolates (CCIBP-Pf54, CCIBP-Pf64, CCIBP-Pf110, CCIBP-Pf83) matched with MAT1-2-1. Both sexual mating types were demonstrated to be present in the Cuban isolates of M.fijiensis, and the heterothallic character of this species was ratified. This result will also facilitate the easily obtaining of the sexual state of M.fijiensis in vitro and in the greenhouse in making use of sexually comp6atible isolates.

**Report of gummy stem blight (Didymella bryoniae (Fuckel) Rehm) symptomatology on watermelon fruits (Citrillus lunatus (Thumb) Matsum and Nakai) in the isle of youth, Cuba**

**Contribution to the management of Steneotarsonemus spinki (Smiley) (Acari: Tarsonemidae) by evaluating rice (Oryza sativa L.) cultivars in the Republic of Panama**

Revista de Protección Vegetal

Potentialities of associated diazotrophic bacteria in plant growth promotion and biocontrol of Pyricularia oryzae (Sacc.) in rice (Oryza sativa L.)

Microbial antagonists to manage black pod rot in Theobroma cacao L: Their present status and perspective use in Cuba

Gene overexpression in two cultivars of Solanum phureja Juz. et. Buk. in interaction with Spongospora subterranean (Wallr.) Lagerh

Effect of different culture media on Phytophthora nicotianae Breda de Haan develop

Genetic diversity determined by its-aflp analysis of Trichoderma spp. in Venezuela

Insects in Morus alba L. and Moringa oleifora Lamark