Vaccimonitor

Determination of the accumulated Fo during saturated steam sterilization cycles in a fermentor used for vaccine production

Se realizó una revisión acerca de la esterilidad y de los procesos de esterilización en equipos empleados a escala de producción. Se describe el concepto de Fo y su empleo en la evaluación de la efectividad de un proceso de esterilización. Se estudió el perfil de temperatura en diferentes secciones del fermentador durante los ciclos de esterilización, encontrándose algunas secciones en las cuales el tiempo equivalente no era suficiente por lo que se propusieron modificaciones, que luego de ejecutadas permitieron obtener resultados satisfactorios.

Technical literature related to sterilization processes in industrial equipment was reviewed. The Fo concept was described and its application for evaluating the efficiency of the sterilization process in a fermentor. The temperature profile in different sections of the fermentor was studied during the sterilization cycles. After the application of some modifications, a reliable SAL was obtained in all sections of the fermentor.

ELISA Cut off Level for Quantitation of Antibodies Elicited by the Meningococcal Vaccine VA-MENGOC-BC

Para medir el grado de protección inducido por vacunas antimeningocócicas se ha establecido el Ensayo Bactericida en Suero (EBS) y se perfeccionan otros ensayos inmunobiológicos, sin embargo, es necesario contar con pruebas sencillas como el ELISA, capaz de evaluar un gran número de muestras. Se estimó el nivel de corte de los ELISAs para la cuantificación de IgG humana contra los antígenos de VA-MENGOC-BC, vacuna antimeningocócica compuesta por vesículas proteicas de membrana externa de meningococo B y polisacárido capsular de meningococo C, con respecto a un panel de muestras de suero de lactantes, caracterizado por Ensayo Bactericida en Sangre Total (EBST). Los valores correspondientes a la máxima sensibilidad y especificidad fueron respectivamente; 2 μg/mL y 12 μg/mL para antipolisacárido C, y 1000 U/mL y 7000 U/mL para antiproteínas de membrana externa. La mayor coincidencia se obtuvo con 6 μg/mL y 2500 U/mL. Se evaluó otro panel de muestras de suero de adolescentes entre 14 y 18 años, por ELISA y EBS para Neisseria meningitidis serogrupos B y C, alcanzándose una buena concordancia. Doce años después de la inmunización con VA-MENGOC-BC persiste una importante concentración de anticuerpos contra los antígenos vacunales en los sueros estudiados.

The Serum Bactericidal Assay (SBA) has been used to measure the protection elicited by meningococcal vaccines. Other immunobiological assays are being improved, however simple assays as ELISA, which are useful to test many samples are necessary. The cut off levels in the ELISAs for quantitation of human IgG against the antigens in VA-MENGOC-BC vaccine, prepared from outer membrane proteins of meningococcus B and capsular polysaccharide of meningococcus C, were assessed with a panel of serum samples from infants, previously characterized by Whole-Blood Assay (WBA). The cut off levels corresponding with the greatest sensitivity and specificity were respectively 2 μg/mL and 12 μg/mL for polysaccharide C antibodies, and 1000 U/mL and 7000 U/mL for outer membrane protein antibodies. The highest coincidence was obtained with 6 μg/mL, and 2500 U/mL. Another panel of serum samples from teenagers between 14 and 18 years old was tested by ELISA and SBA against Neisseria meningitidis serogroups B and C; a good concordance was reached. A high concentration of specific antibodies persists twelve years after vaccination with VA-MENGOC-BC.

Serological and Protection Study in Mice using different vaccination schemes and Doses of VA-MENGOC-BC® Vaccine

La alta incidencia mundial de meningitis meningocócica por Neisseria meningitidis serogrupo B (N. meningitidis) movilizó los recursos de la ciencia hacia su enfrentamiento en un período corto de tiempo. Para el estudio de esta enfermedad fue imprescindible desarrollar modelos experimentales que posibilitaran caracterizar no sólo la capacidad inmunogénica y protectora de los candidatos vacunales, sino también la toxigenicidad del producto. El estudio basado en el modelo ratón Balb/c con la utilización de factores estimulantes de la virulencia, posibilitó el desarrollo experimental de la enfermedad. Consistió en la aplicación de diferentes esquemas de dosis y diluciones de la vacuna (1/2, 1/4, 1/8, 1/16) en solución salina fisiológica 0,85%. Se conformaron 15 grupos de ocho animales cada uno que previamente recibieron Dextrana Férrica (IMEFA) y mucina gástrica de cerdo 8% en un volumen total de 0,4 mL, y un grupo control al que le fue administrada la vacuna pura. Se empleó para el reto la cepa 385 de N. meningitidis con una concentración del inóculo de 107 UFC/mL. El esquema de vacunación contempló grupos vacunados con 1, 2, y 3 dosis a los 0,15 y 30 días. Se administraron 0,2 mL del inóculo de N. meningitidis por vía intraperitoneal. Se determinó la dosis letal media (DL50), anticuerpos bactericidas, respuesta serológica por el método de ELISA y se calculó la protección conferida. Se aplicó el método de Log rank para la comparación de los tiempos de sobrevivencia y para el ensayo de ELISA se aplicó el método de superficie ajustada por SPLINE. Hemos demostrado la utilidad del biomodelo ratón Balb/c para comprobar la eficacia de la vacuna VA-MENGOC-BC®. Quedó demostrada la correlación entre los niveles de anticuerpos y la protección conferida por la vacuna, comprobándose además por los ensayos de reto. Se logró obtener una aproximación con respecto a los límites de eficacia de VA-MENGOC-BC® mediante diluciones consecutivas del producto en la línea de ratones Balb/c.

The elevated world incidence of meningococcal meningitis due to Neisseria meningitidis B (N. meningitidis) has mobilized scientists in the search for a speedy solution to this problem. In order to study this disease, it is indispensable to develop experimental models which will enable the characterization of, not only the immunogenic and protective capability of vaccine candidates, but also the possible toxicity of the preparation. Consequently, a Balb/c mouse model was used, together with virulence stimulating factors, in order to achieve the experimental development of the disease. Different vaccine dose schedules and dilutions were used (1/2,1/4,1/8,1/16) in 0,85% physiologic saline solution. Fifteen groups of 8 animals each, which had previously received Ferric Dextran (IMEFA) and swine gastric mucin (8%) in a total volume of 0,4 mL and a control group which received the pure vaccine were formed. N. meningitidis Strain 385, was used for the challenge, with an inoculum concentration of 107 UFC/mL. The following vaccination schedule was observed: the groups of animals were vaccinated with 1, 2 and 3 doses on days: 0, 15 and 30. A total of 0,2 mL of the N. meningitidis inoculum was administered intraperitoneally. The half lethal dose (LD 50), bactericidal antibodies and serological response using an ELISA assay were determined and the protection conferred by the prepartions were calculated. The Log rank method was used for comparing survival time. The SPLINE surface adjustment method was used in the case of the ELISA assay. The usefulness of the Balb/c mouse biomodel for comparing the efficacy of the VA-MENGOC-BC® vaccine was demonstrated. The correlation between the different levels of antibodies and the protection conferred by the vaccine was demonstrated and verified by challenge assays. An approximation of the efficacy limit of VA-MENGOC-BC® was obtained by means of consecutive dilutions of the product in the Balb/c mouse line.

Viral Inactivation by pH and Temperature in Intaglobin preparations

Se utilizó la Encefalomiocarditis (EMC) porcina como virus modelo en el estudio de inactivación viral en el proceso de producción de un preparado de inmunoglobulina humana para uso intravenoso, para lo que se escogieron dos variables a tener en cuenta: el pH y la temperatura; preparándose cuatro grupos experimentales: pH ácido (4,3) y temperatura 5 °C, pH ácido (4,3) y temperatura 28 °C, pH básico (7,0) y temperatura 5 °C y por último pH básico (7,0) y temperatura 28 °C. Para cada caso se tomaron muestras a diferentes tiempos para conocer el grado de inactivación viral. Los mejores resultados en cuanto a la disminución de la infectividad, se obtuvieron para las muestras tratadas con pH 4,3 y temperatura 28 °C, mostrándose la total inactivación del virus, a partir de las 8 h. En las muestras tratadas bajo las otras condiciones, solo se observó la completa inactivación viral a partir de las cinco semanas. Verificamos que las características organolépticas y químicas del producto se mantuvieran inalterables durante el transcurso de las ocho semanas que duró el experimento.Llegamos a conclusiones acerca de que el pH ácido y las altas temperaturas, así como el tiempo de incubación, son variables importantes en la cinética de inactivación viral.

Swine encephalomyocarditis (SE) was used as a model virus to study viral inactivation in the production process of a human immunoglobulin preparation for intravenous use. Two variables were selected for this: ph and temperature. Four experimental groups were prepared: acid pH (4,3) and 5 °C temperature, acid pH (4,3) and 28 °C temperature, basic pH (7,0) and 5 °C temperature and basic pH (7,0) and 28 °C temperature. In each case, to determine the rate of viral inactivation, samples were taken at different times. The best results with respect to decreasing infectivity were obtained for the samples treated with 4,3 pH and 28 °C temperature, with a total inactivation of the virus after 8 hours. In the samples treated under the other conditions, complete viral inactivation was only observed after 5 weeks. We checked that the chemical and organoleptic characteristics of the product remained unchanged during the 8 weeks the experiment lasted. We concluded that acid pH and high temperatures, as well as the incubation time are important variables in the viral inactivation kinetics.

Evaluation of Different Chromatographic Matrixes for Molecular Size Determination of the Neisseria meningitidis Polysaccharide C by HPLC

Las propiedades inmunológicas del polisacárido C de Neisseria meningitidis se correlacionan con su tamaño molecular, parámetro físico-químico que se determina mediante cromatografìa convencional en filtración en gel, según lo recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Sin embargo, la determinación del coeficiente de distribución (Kd) mediante este método, consume mucho tiempo y requiere relativamente grandes cantidades de muestra del producto. La Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) es más eficiente y podría sustituir el método convencional. Para ello en el presente trabajo se evaluaron diferentes columnas cromatográficas y condiciones de corrida. En todos los casos se determinó el volumen muerto y el volumen total, así como el factor de capacidad, la eficiencia, la asimetría del pico y la repetibilidad. Se empleó como fase móvil NaCl 0,2 mol/L. La columna de Sepharose CL 4B (Pharmacia, Suecia) resultó ser la escogida para la determinación de Kd del polisacárido C mediante HPLC ya que fue la de mayor capacidad para retener la muestra; aunque resultó menos eficiente que la TSK G3000PW (Tosohaas, Japón), mostró igual asimetría del pico, mejor repetibilidad, y menor costo. Se estudiaron diferentes velocidades de flujo, concentraciones y volúmenes de muestra con el fin de determinar las mejores condiciones para el análisis, que resultaron ser las siguientes: Una inyección de 100 μl de muestra (0,1 mg) a 0,3 mL/min de flujo.

The immunological properties of N. meningitidis Polysacharide C are closely related to its molecular size, a physicochemical parameter determined by conventional Gel filtration chromatography (GFC) as recommended by the World Health Organization (WHO). Nevertheless, the distribution coefficient (Kd) determination by this method is timeconsuming and requires a relatively large quantity of sample. The High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is more efficient, so it could substitute the conventional method. For that purpose, we evaluated different chromatographic columns and run conditions to determine Kd by (GFC) HPLC. In all cases the void and the total volumes, and also the capacity factor, the column efficiency, the peak asymmetry and the repeatability were determined. The mobile phase was 0,2 mol/L NaCl. The Sepharose CL 4B (Pharmacia, Sweden) resulted the best choice, because it had more capacity to retain the sample; although it was less efficient than the TSK G3000PW (Tosohaas, Japan) column, it showed the same peak asymmetry, the best repeatability and it was cheaper. Different flow rates, sample concentrations and sample volumes were studied to determine the best analysis conditions, which resulted in: an injections of 100 μl of sample (0,1 mg) with a 0,3 mL/min of flow.