Vaccimonitor

Obtaining Vibrio cholerae 01 outer membrane extracts with different detergents

En la actualidad existen dos variantes principales de vacunas orales contra el cólera: una basada en células inactivadas de diferentes biotipos y serotipos y otra basada en la administración de cepas vivas genéticamente atenuadas. Una vacuna por subunidades pudiera ser una variante muy atractiva. Este trabajo describe la purificación parcial y caracterización preliminar de extractos de proteínas de membrana externa-lipopolisacárido (PME-LPS), obtenidos a partir de Vibrio cholerae O1, con el interés de seleccionar un proteoliposoma que posteriormente será estructurado en forma de cocleatos para su uso por vía oral en humanos. Las preparaciones fueron obtenidas a través del uso de diferentes detergentes. La cantidad de LPS en cada preparación fue estimada mediante la determinación de las unidades endotóxicas en el ensayo del Limulus (LAL). La composición de cada muestra fue evaluada mediante SDS-PAGE y Dot Blot. La inoculación intranasal (IN) en ratones Balb/c se utilizó para la evaluación de la inmunogenicidad de las preparaciones, y la respuesta inmune fue determinada por ELISA y el título de anticuerpos vibriocidas. El tamaño molecular de la preparación con mejores resultados en inmunogenicidad se estimó mediante la cromatografía en Sephacryl S-1000. Se obtuvieron diferentes perfiles electroforéticos de acuerdo con el tipo de detergente utilizado. El LPS fue identificado en todas las preparaciones y aquella obtenida con el SDS al 15% mostró la más baja relación proteínas/LPS y los mejores resultados en los ensayos de inmunogenicidad. Adicionalmente se comprobó que su tamaño molecular es similar al observado en el proteoliposoma de VAMENGOC- BC. La preparación obtenida con el SDS al 15% constituye un proteoliposoma, con capacidad para estimular altos niveles de anticuerpos IgG anti-LPS y altos títulos de anticuerpos vibriocidas, luego de su administración por vía intranasal en ratones. Estos resultados constituyen un importante paso en las investigaciones dirigidas a la obtención de una vacuna por subunidades, como alternativa preventiva contra el cólera.

Two oral vaccine variants have been developed to prevent cholera infection: one from genetically attenuated strains, and the other one from inactivated whole cells. A subunit vaccine could be another very attractive alternative. In this report, we describe the partial purification and preliminary characterization of V. cholerae O1 Outer Membrane Protein-Lipopolysaccharide (OMP-LPS) complexes, to select a proteoliposome that could be administered orally in humans as a cochleate. Preparations were obtained using different detergents. The quantity of LPS was estimated by determination of endotoxic units using Limulus test (LAL). The composition of the samples was visualized by SDS-PAGE and dot blot assay. Balb/c mice were inoculated intranasally (IN) and the immune response was evaluated using ELISA and vibriocidal antibody titer assay. The molecular size of the preparation giving the best results for immunogenicity assays was estimated by chromatography on Sephacryl S- 1000. Different electrophoretic profiles were obtained according to the type of detergent used. LPS was identified in all the preparations evaluated. The preparation obtained with 15% SDS showed the lowest OMP/LPS relation, the best results for the immunogenicity assay and a similar molecular size when compared to VA-MENGOC-BC proteoliposome. These results are very stimulating and constitute a very important step for research to obtain a subunit vaccine as a preventive alternative against cholera.

Phenotypic characterization of invasive strains of Neisseria meningitidis isolated in Cuba during 20 years

Se investigaron los marcadores epidemiológicos (serogrupos, serotipos, subtipos, inmunotipos) de 429 cepas invasivas, aisladas en Cuba durante 20 años (1982-2002). Basándonos en el comportamiento de la incidencia de la Enfermedad Meningocócica (EM) en el período investigado, las cepas se distribuyeron en dos etapas: epidémica y postepidémica. La epidémica, comprendió 279 cepas aisladas entre 1982-1992 y la ostepidémica, incluyó 150 aislamientos pertenecientes al período comprendido entre 1993-2002. Todas se cultivaron en Agar Mueller Hinton con suero fetal bovino (5%) y se incubaron 24-48 horas, 37 0C, en atmósfera húmeda con 5% de C02. La identificación de género, especie y serogrupo, se realizó mediante métodos convencionales; para la caracterización de los sero/subtipos e inmunotipos, se utilizó el ensayo inmunoenzimático (ELISA) de células enteras con anticuerpos monoclonales. En ambas etapas predominó el serogrupo B (97,90%): epidémica (96,77%) y postepidémica (100%). Sin embargo, el serogrupo C (1,43%) y cepas no agrupables (1,8%), sólo se observaron en aislamientos de la etapa epidémica. Los otros marcadores prevalentes fueron: serotipo 4 (86,48%), subtipo P1.19,15 (78,32%), inmunotipo L3,7,9 (90,2% ), todos mostraron cifras similares en ambos períodos.Predominó el fenotipo B:4:P1.19,15:L3,7,9 (69,69%), aunque, en la etapa postepidémica (77,34%), el porcentaje fue superior al de la etapa epidémica (65,66%) (p<0,05); además, en las cepas de este período, se observó una mayor diversidad de asociaciones fenotípicas. Los resultados obtenidos de esta caracterización fenotípica de las cepas de Neisseria meningitidis aisladas de enfermos aporta datos valiosos al estudio, prevención y control exitoso de la EM en Cuba.

The epidemiological markers (sero-groups, sero-types, sub-types, immuno-types) of 429 invasive strains isolated in Cuba during 20 years (1982- 2002) were investigated. Based on the behavior of the Meningococcal Disease (MD) incidence in the investigated period, the strains were distributed in two stages: epidemic and post-epidemic. The epidemic stage involved 279 strains isolated between 1982 and 1992 and the postepidemic one included 150 isolations carried out between 1993 and 2002. All of them were seeded in Mueller Hinton Agar with fetal bovine serum (5%) and incubated for 24-48 hours, 37 0C, in humid atmosphere with 5% of C02. The identification of sex, species and sero-group was performed using conventional methods; characterization of sero/sub-types and immuno-types was carried out using the immuno-enzimatic test (ELISA) of whole cells with monoclonal antibodies. Serogroup B (97,90%) prevailed in both stages: epidemic (96.77%) and post-epidemic (100%). However, sero-group C (1.43%) and non-grouping strains (1,8%) were only observed in the isolations of the epidemic stage. The other prevailing markers were: serotype 4 (86.48%), subtype P1.19,15 (78.32%), immuno-type L3,7,9 (90.2%) which showed similar figures in both periods. Phenotype B:4:P1.19,15: L3,7,9 (69,69%) prevailed, although, in the post-epidemic stage (77.34%), the percentage was higher than that of the epidemic one (65.66%) (p<0.05). A higher diversity of phenotypic associations was also observed in the strains of this period. Results obtained from this phenotypic characterization of Neisseria meningitidis strains isolated from ill persons provide valuable data to the study, prevention and succesful control of the MD in Cuba.

In vitro gene transfer using cationic polymers

La transferencia de genes representa una importante herramienta para el estudio, prevención y tratamiento de enfermedades genéticas y adquiridas así como para estudios relacionados con la función de proteínas de interés. El uso de moléculas catiónicas está ampliamente difundido, ya que su eficiencia en la transfección las convierte en un fuerte rival de otros métodos de transferencia de genes. En este trabajo se transfectaron las líneas celulares COS-7 y BHK-21 con el plásmido psnEGFP que usó los polímeros catiónicos polietilenimina (PEI) y DEAE dextrana. Al medir la eficiencia de transfección se observó que la línea celular BHK-21 deviene en una excelente opción para la transfección con el método de la PEI y que los mejores resultados se obtienen al disolver PEI en NaCl 150 mM. Al centrifugar las placas después de añadidos los complejos ADN-PEI se obtiene cerca del 100% de células transfectadas con bajas concentraciones de ADN.

Gene transfer represents an important tool for the study, prevention and treatment of genetic and acquired diseases, as well as for protein function studies. Because of their efficiency, the use of cationic molecules has become a strong competitor to other gene transfer methods. In this study, COS-7 and BHK-21 cell lines were transfected with the plasmid psnEGFP using the cationic polymers polyethylene imine (PEI) and DEAE-dextran. When transfection efficiency was measured, it was observed that the cell line BHK-21 is an excellent option for transfection with the PEI method. The best results were obtained when PEI was dissolved in NaCl 150 mM. When plates were centrifuged after addition of the PEI-DNA complexes, nearly 100% of transfected cells with low DNA concentrations were obtained.

Identifying Vaccine Candidates from the Sequence of a Bacterial Genome

Cada día hay más secuencias genómicas completas de un gran número de patógenos humanos. La disponibilidad de estas secuencias ha cambiado completamente el panorama para el desarrollo de vacunas, introduciendo una nueva línea de pensamiento en este proceso. Esta metodología comienza por la secuencia genómica y mediante un análisis computacional se predicen aquellos antígenos más probables a ser candidatos vacunales. Por ejemplo, con el uso de herramientas bioinformáticas se puede hacer un pesquisaje in silico de aquellas proteínas expuestas en la superficie bacteriana, con vistas a identificar antígenos candidatos vacunales. La confirmación in vitro de estos resultados de localización celular y el uso de modelos animales para evaluar la inmunogenicidad de los candidatos acota finalmente el número de candidatos definidos por la computadora. A este proceso, aplicado por primera vez a Neisseria meningitidis serogrupo B, se le denomina vacunología inversa. La genómica también brinda información sobre la biología y la virulencia de especies patogénicas mediante la genómica comparativa. En este trabajo de revisión, describimos cómo la genómica puede ser usada en la identificación de nuevos candidatos vacunales

Whole genome sequence data are increasingly available for a wide range of human pathogens. The availability of these sequences has changed our approach to vaccine development entirely and introduced a new way of thinking in this process. This approach starts from the genomic sequence and, by computer analysis, predicts those antigens that are most likely to be vaccine candidates. The use of bioinformatic tools allows the comprehensive in silico screening of genome data for surface-expressed proteins, in order to identify candidate vaccine antigens. In vitro confirmation of surface location and the use of animal models to test immunogenicity further refine the list of proteins likely to be of use as vaccine antigens. This process, first applied to serogroup B Neisseria meningitidis, has been termed as reverse vaccinology. Genomics also enables valuable information concerning the biology and virulence of the pathogenic species to be extracted by comparative genomics. In this review, we describe how genomic approaches can be used to identify novel vaccine candidates.