Vaccimonitor

Acknowledgment to the reviewers of VacciMonitor, Volume 23, 2014

Preclinical biomodels for Vibrio cholerae vaccines

Obtaining of a rapid diagnostic test for Cholera, based on latex particles coupled with a monoclonal antibody against Vibrio cholerae O1 lipopolysaccharide

El cólera es una enfermedad infecto-contagiosa intestinal aguda, causada por la ingestión de alimentos o agua contaminada con los serotipos O1 y O139 de la bacteria Vibrio cholerae. Se caracteriza por diarrea secretora abundante que llevan rápidamente a la deshidratación. Sin tratamiento adecuado produce la muerte en horas, por lo que el diagnostico precoz es muy importante sobre todo porque al inicio es difícil diferenciarla de otras enfermedades diarreicas agudas. La prueba diagnóstico de oro es el coprocultivo; sin embargo, no garantiza una detección rápida de la enfermedad. Recientemente se desarrollaron ensayos rápidos, se basan en tiras reactivas y aglutinación con partículas de látex, muy efectivos, pero difíciles de adquirir por sus altos precios. El objetivo de este trabajo fue obtener un diagnosticador rápido basado en partículas de látex acopladas a un anticuerpo monoclonal (AcM) contra el lipopolisacárido de V. cholerae O1, el cual se obtuvo en el Instituto Finlay. Se usaron partículas de látex de 0,8 µm en una suspensión al 10% a las que se acopló durante 2 h a 37°C el AcM a 0,25 mg/mL. Se evaluó la sensibilidad, especificidad y el desempeño en 84 muestras de heces de pacientes con diagnóstico presuntivo de cólera. El diagnosticador que se obtuvo no evidenció reactividad cruzada frente a cepas no-O1, ni contra otros enteropatógenos. El diagnosticador látex presentó valores de sensibilidad, especificidad y eficacia de 97,87; 97,29 y 97,6 % respectivamente, muy similares al diagnosticador comercial CTK-Biotech. El diagnosticador látex que se obtuvo se puede utilizar en el diagnóstico rápido de la enfermedad.

Cholera is an acute contagious intestinal disease caused by ingestion of food or water contaminated with O1 and O139 serotypes of the bacterium Vibrio cholerae . Cholera is characterized by abundant secretory diarrhea leading to dehydration. Death occurs within hours without treatment, so early diagnosis is very important, especially at the beginning of the disease, because it is difficult to differentiate from other acute diarrheal diseases. The diagnostic golden test is the stool culture; however, it does not guarantee a rapid detection of the disease. Rapid tests have been recently developed; they are based on test strips and agglutination with latex particles, which are very effective, but difficult to acquire for their high prices. The objective of this research was to obtain a quick assay based on latex particles coupled with a monoclonal antibody (mAb) against V. cholerae O1 lipopolysaccharide obtained in Finlay Institute. Latex particles of 0.8 µm were used in a 10% suspension, and they were coupled to the mAb (0.25 mg/ml) for 2 hours at 37°C. The sensitivity, specificity and performance were evaluated in 84 stool samples from patients with presumptive diagnosis of cholera. The diagnostic test obtained showed no cross-reactivity against no-O1 strains and other enteropathogens. Latex diagnostic test showed values of sensitivity, specificity and efficacy of 97.87; 97.29 and 97.6% respectively, very similar to the commercial diagnostic test CTK-Biotech. The latex reagent obtained can be used in the rapid diagnosis of the disease.

Validation and application of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against Salmonella Typhi Vi capsular polysaccharide

Como parte de las etapas de investigación y desarrollo de un candidato vacunal conjugado contra Salmonella Typhi, se desarrolló un ELISA indirecto para la cuantificación de anticuerpos IgG contra el polisacárido Vi de esta bacteria. En este trabajo se presentan los resultados del proceso de validación, en el que se determinaron el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la exactitud, la especificidad, el límite de detección y la robustez. La curva de calibración, generada con un suero estándar interno, presentó un buen ajuste a una función polinómica y un intervalo entre las diluciones 1/100 y 1/3200. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión y robustez y los porcentajes de recobrado estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (=10%, =20% y 90-110% respectivamente). El ensayo presentó una especificidad óptima, obteniéndose señales de DO superiores a 1,3 para sueros positivos contra Vi y bajas para sueros contra antígenos no relacionados. Los resultados avalan el empleo de este ELISA cuantitativo en ensayos de inmunogenicidad para la liberación de lotes de conjugados de Vi. Igualmente, sustentan su uso para la evaluación de la inmunogenicidad de formulaciones de polisacárido Vi y conjugados de polisacárido Vi a proteínas en fases de investigación y desarrollo.

An indirect ELISA for the quantification of IgG antibodies against the Vi polysaccharide of this bacteria was developed as a part of the stages of Research and Development of a conjugate vaccinal candidate against Salmonella Typhi. The results of the validation process are presented in this paper, in which the interval and linearity of the curve, the intra- and inter-assay precision, accuracy, specificity, limit of detection and robustness were determined. The calibration curve generated with an internal standard serum provided a good fit to a polynomial function and an interval between 1/100 and 1/3200 dilutions. The coefficients of variation in the precision and robustness tests and the percentages of recovery were in intervals established for each one (=10%, =20% and 90-110%, respectively). The assay presented an optimal specificity, obtaining OD signals above 1.3 for positive sera against Vi and low for sera against unrelated antigens. The results support the use of this quantitative ELISA in immunogenicity assays for batch release of Vi conjugates. Likewise, they support their use for the immunogenicity evaluation of Vi polysaccharide formulations and Vi polysaccharide conjugates to proteins in phases of research and development.

Application of Neesler reagent in the ammonium quantification used in the fermentations of biotechnology product

Las sales de amonio se utilizan en las fermentaciones para suplementar las cantidades deficitarias de nitrógeno y estabilizar el pH del medio de cultivo. El ion amonio en exceso, ejerce un efecto perjudicial en el proceso fermentativo ya que inhibe el crecimiento microbiano. Con el objetivo de monitorear y controlar la concentración de amonio durante el proceso de fermentación, se desarrolló un método con el reactivo de Neesler, para la cuantificación de dicho analito. El ensayo se estandarizó mediante: selección del equipo de medición; tiempo de reacción del ensayo y comparación de las sales estándares de amonio. El método se caracterizó con la evaluación de los parámetros: especificidad; linealidad y rango del sistema, límite de cuantificación, exactitud y precisión. El método demostró ser específico. Se establecieron dos sistemas con curvas que fueron lineales en los rangos de cloruro de amonio (2 a 20 µg/mL) y sulfato de amonio (5 a 30 µg/mL). Los límites de cuantificación fueron los puntos inferiores de cada rango de trabajo. El método resultó ser preciso y exacto. Este ensayo se aplicó a muestras de cultivos de levadura y bacterias del género Saccharomyces y Escherichia. coli respectivamente. Se desarrolló un método novedoso en microplaca para la cuantificación y control analítico del amonio. Mediante este método se controla este componente químico fundamental en las fermentaciones, para optimizar el medio de cultivo. Se logra una adecuada expresión de proteínas recombinantes y la obtención de candidatos vacunales para uso clínico. Las sales de amonio se utilizan en las fermentaciones para suplementar las cantidades deficitarias de nitrógeno y estabilizar el pH del medio de cultivo. El ion amonio en exceso, ejerce un efecto perjudicial en el proceso fermentativo ya que inhibe el crecimiento microbiano. Con el objetivo de monitorear y controlar la concentración de amonio durante el proceso de fermentación, se desarrolló un método con el reactivo de Neesler, para la cuantificación de dicho analito. El ensayo se estandarizó mediante: selección del equipo de medición; tiempo de reacción del ensayo y comparación de las sales estándares de amonio. El método se caracterizó con la evaluación de los parámetros: especificidad; linealidad y rango del sistema, límite de cuantificación, exactitud y precisión. El método demostró ser específico. Se establecieron dos sistemas con curvas que fueron lineales en los rangos de cloruro de amonio (2 a 20 µg/mL) y sulfato de amonio (5 a 30 µg/mL). Los límites de cuantificación fueron los puntos inferiores de cada rango de trabajo. El método resultó ser preciso y exacto. Este ensayo se aplicó a muestras de cultivos de levadura y bacterias del género The ammonium salts are used in fermentations to supplement the deficient amounts of nitrogen and stabilize the pH of the culture medium. The excess ammonium ion exerts a detrimental effect on the fermentation process inhibiting microbial growth. An analytical method based on Neesler reagent was developed for monitoring and controlling the concentration of ammonium during the fermentation process. The test was standardized, by means of the selection of measuring equipment, and the reaction time as well as comparing standards of ammonium salts. The method was characterized with the evaluation of the next parameters: Specificity, Linearity and Range, Quantification Limit, Accuracy and Precision. The method proved to be specific. Two linear curves were defined in the ranges of concentrations of ammonium chloride salt (2-20 µg/ml) and ammonium sulfate salt (5-30 µg/ml). The limits of quantification were the lowest points of each one. The method proved to be accurate and precise. This assay was applied to samples of the yeast culture and bacteria of the genus Saccharomyces and E. coli respectively . A novel method in micro plate for quantification and analytical control of ammonia was developed. T his method is used to control this fundamental chemical component in the fermentations , to optimize the culture medium. Thus, an appropriate expression of recombinant proteins and proper vaccine candidates for clinical use are achieved. The ammonium salts are used in fermentations to supplement the deficient amounts of nitrogen and stabilize the pH of the culture medium. The excess ammonium ion exerts a detrimental effect on the fermentation process inhibiting microbial growth. An analytical method based on Neesler reagent was developed for monitoring and controlling the concentration of ammonium during the fermentation process. The test was standardized, by means of the selection of measuring equipment, and the reaction time as well as comparing standards of ammonium salts. The method was characterized with the evaluation of the next parameters: Specificity, Linearity and Range, Quantification Limit, Accuracy and Precision. The method proved to be specific. Two linear curves were defined in the ranges of concentrations of ammonium chloride salt (2-20 µg/ml) and ammonium sulfate salt (5-30 µg/ml). The limits of quantification were the lowest points of each one. The method proved to be accurate and precise. This assay was applied to samples of the yeast culture and bacteria of the genus

Implementation of tissue microarrays technique for cancer research in Cuba

La técnica de micromatrices de tejidos (TMA), basada en la toma de ponches cilíndricos de bloques de parafina donantes y su transferencia a un solo bloque receptor, revolucionó el campo de la patología, por la posibilidad de evaluar múltiples muestras en una sola lámina. En Cuba no existen antecedentes del tema, por lo que el objetivo de este trabajo fue implementar la técnica de TMA. Para ello, se evaluó la concordancia de los resultados que se obtienen por sección completa y por TMA, en la evaluación de los receptores de estrógeno (RE), progesterona (RP) y del factor de crecimiento epidérmico tipo 2 (HER2) en muestras de cáncer de mama. Se estudiaron 45 muestras parafinadas de mujeres con esta enfermedad que se atendieron en el Instituto de Oncología en el año 2012. Se construyeron dos bloques de TMA y posteriormente se determinó, mediante inmunohistoquímica, la expresión de los marcadores RE, RP y HER2, en la sección completa de tejido y en el TMA. Para el análisis de concordancia se empleó el índice Kappa. Se obtuvo una buena concordancia para los tres marcadores (RE k=0,8272; RP k=0,793 y HER2 k=0,716). Este trabajo constituye el primer reporte sobre la técnica de TMA en Cuba y demuestra que es una herramienta valiosa, por lo que se sugiere su potencial uso en la investigación traslacional y en los ensayos clínicos de vacunas. La técnica de micromatrices de tejidos (TMA), basada en la toma de ponches cilíndricos de bloques de parafina donantes y su transferencia a un solo bloque receptor, revolucionó el campo de la patología, por la posibilidad de evaluar múltiples muestras en una sola lámina. En Cuba no existen antecedentes del tema, por lo que el objetivo de este trabajo fue implementar la técnica de TMA. Para ello, se evaluó la concordancia de los resultados que se obtienen por sección completa y por TMA, en la evaluación de los receptores de estrógeno (RE), progesterona (RP) y del factor de crecimiento epidérmico tipo 2 (HER2) en muestras de cáncer de mama. Se estudiaron 45 muestras parafinadas de mujeres con esta enfermedad que se atendieron en el Instituto de Oncología en el año 2012. Se construyeron dos bloques de TMA y posteriormente se determinó, mediante inmunohistoquímica, la expresión de los marcadores RE, RP y HER2, en la sección completa de tejido y en el TMA. Para el análisis de concordancia se empleó el índice Kappa. Se obtuvo una buena concordancia para los tres marcadores (RE k=0,8272; RP k=0,793 y HER2 k=0,716). Este trabajo constituye el primer reporte sobre la técnica de TMA en Cuba y demuestra que es una herramienta valiosa, por lo que se sugiere su potencial uso en la investigación traslacional y en los ensayos clínicos de vacunas. The tissue microarray (TMA) technique is based on making cylindrical cores from paraffin donor blocks and transfer to a single recipient block. The TMA has revolutionized the field of pathology for the possibility to evaluate multiple samples in one slide. There is no precedent of this subject in Cuba, so the objective of this research was to implement the TMA technique. The concordance of the results obtained by complete section and the TMA were evaluated for this purpose, in the evaluation of the estrogen receptors (ER), progesterone (PR) and epidermal growth factor type 2 (HER2) in samples of breast cancer. Forty-five paraffin-embedded samples from women diagnosed with breast cancer at the Institute of Oncology in 2012 were studied. Two TMA blocks were constructed, and subsequently the expression of markers ER, PR and HER2 was determined by immunohistochemistry, in the complete section of tissue and in the TMA. Kappa index was used for concordance analysis. A good concordance was obtained for all three markers (ER k=0.8272; PR k=0.793 and HER2 k=0.716). This study constitutes the first report on the TMA technique in Cuba and shows that it is a valuable tool, suggesting its potential use in translational research and clinical trials on vaccines. The tissue microarray (TMA) technique is based on making cylindrical cores from paraffin donor blocks and transfer to a single recipient block. The TMA has revolutionized the field of pathology for the possibility to evaluate multiple samples in one slide. There is no precedent of this subject in Cuba, so the objective of this research was to implement the TMA technique. The concordance of the results obtained by complete section and the TMA were evaluated for this purpose, in the evaluation of the estrogen receptors (ER), progesterone (PR) and epidermal growth factor type 2 (HER2) in samples of breast cancer. Forty-five paraffin-embedded samples from women diagnosed with breast cancer at the Institute of Oncology in 2012 were studied. Two TMA blocks were constructed, and subsequently the expression of markers ER, PR and HER2 was determined by immunohistochemistry, in the complete section of tissue and in the TMA. Kappa index was used for concordance analysis. A good concordance was obtained for all three markers (ER k=0.8272; PR k=0.793 and HER2 k=0.716). This study constitutes the first report on the TMA technique in Cuba and shows that it is a valuable tool, suggesting its potential use in translational research and clinical trials on vaccines.

Plasma as alternatively sample to quantify tetanus antitoxin

En los bancos de sangre de Cuba se cuantifica antitoxina tetánica, a partir del suero de donantes inmunizados, para producir una gammaglobulina humana específica. Se emplea un ensayo inmunoenzimático heterogéneo de tipo indirecto, que utiliza el suero como muestra analítica. En este trabajo se evalúo el posible empleo del plasma obtenido de la plasmaféresis como muestra alternativa, para minimizar el volumen de sangre total extraído a los donantes. Se seleccionó por muestreo aleatorio simple, 100 donantes de plasma que acudieron a donar entre octubre y noviembre del 2013. Para la obtención de suero se realizó una extracción de 5 mL de sangre por punción venosa, depositada en tubo de ensayo de cristal seco. La muestra de 1,5 mL de plasma se obtuvo al final de la donación, colectada en un tubo plástico con tapa. Se realizó la comparación de la diferencia de medias de ambos grupos, utilizando el programa estadístico informático SPSS para Windows. Los valores de antitoxina tetánica en suero fueron mayores que los del plasma. La media de las diferencias entre ambos grupos resultó estadísticamente significativa (p=0,00). No se recomienda usar el plasma que se obtiene de la plasmaféresis como muestra analítica para este ensayo. En los bancos de sangre de Cuba se cuantifica antitoxina tetánica, a partir del suero de donantes inmunizados, para producir una gammaglobulina humana específica. Se emplea un ensayo inmunoenzimático heterogéneo de tipo indirecto, que utiliza el suero como muestra analítica. En este trabajo se evalúo el posible empleo del plasma obtenido de la plasmaféresis como muestra alternativa, para minimizar el volumen de sangre total extraído a los donantes. Se seleccionó por muestreo aleatorio simple, 100 donantes de plasma que acudieron a donar entre octubre y noviembre del 2013. Para la obtención de suero se realizó una extracción de 5 mL de sangre por punción venosa, depositada en tubo de ensayo de cristal seco. La muestra de 1,5 mL de plasma se obtuvo al final de la donación, colectada en un tubo plástico con tapa. Se realizó la comparación de la diferencia de medias de ambos grupos, utilizando el programa estadístico informático SPSS para Windows. Los valores de antitoxina tetánica en suero fueron mayores que los del plasma. La media de las diferencias entre ambos grupos resultó estadísticamente significativa (p=0,00). No se recomienda usar el plasma que se obtiene de la plasmaféresis como muestra analítica para este ensayo. Tetanus antitoxin is quantified in Cuba at blood banks, from the serum of immunized donors, to produce a specific human gamma globulin. A heterogeneous indirect immunoenzymatic assay is used, using the serum as analytical sample. The possible use of plasma obtained from plasmapheresis as alternative sample was evaluated in this research, to minimize the volume of total blood extracted to the donors. One hundred plasma donors who came to donate between October and November 2013 were selected by simple random sampling. Serum sample was obtained for extraction of 5 mL of blood, deposited in dry glass tube. While the other sample took 1.5 mL of plasma in a plastic tube with cover, at the end of the donation directly of the unit of plasma collected. Comparison of the difference between the means of both groups was done using SPSS for Windows. It was found that the values obtained in serum were bigger than those obtained in plasma. Difference between the means of both groups was statistically significant (p 0.00). It is not advisable to use the obtained plasma of the plasmapheresis as analytic sample in this assay. Tetanus antitoxin is quantified in Cuba at blood banks, from the serum of immunized donors, to produce a specific human gamma globulin. A heterogeneous indirect immunoenzymatic assay is used, using the serum as analytical sample. The possible use of plasma obtained from plasmapheresis as alternative sample was evaluated in this research, to minimize the volume of total blood extracted to the donors. One hundred plasma donors who came to donate between October and November 2013 were selected by simple random sampling. Serum sample was obtained for extraction of 5 mL of blood, deposited in dry glass tube. While the other sample took 1.5 mL of plasma in a plastic tube with cover, at the end of the donation directly of the unit of plasma collected. Comparison of the difference between the means of both groups was done using SPSS for Windows. It was found that the values obtained in serum were bigger than those obtained in plasma. Difference between the means of both groups was statistically significant (p 0.00). It is not advisable to use the obtained plasma of the plasmapheresis as analytic sample in this assay.