Vaccimonitor

Production of anti-canine parvovirus IgY polyclonal antibodies and evaluation of a latex agglutination system

La parvovirosis canina es una de las principales infecciones que provoca gastroenteritis, fundamentalmente en cachorros, con altos índices de morbiletalidad. Los diagnosticadores más utilizados se basan en la detección de partículas virales excretadas durante la fase aguda de la enfermedad. Algunos requieren equipos especializados, lo que aumenta los costos y el tiempo de diagnóstico. Por esto, la simplificación de estos métodos con alta sensibilidad y especificidad es prioritaria. En Cuba solo se logra un diagnóstico presuntivo sin la completa confirmación de la enfermedad, principalmente por la escasez o ausencia de un medio diagnóstico en toda la red de consultorios y clínicas veterinarias, rápido, eficaz y ajustable a nuestras condiciones. Este trabajo tuvo como objetivo obtener anticuerpos policlonales IgY a partir de yema de huevo de gallina y evaluarlos mediante un sistema de látex-aglutinación, para su posible uso como terapia y principalmente en el diagnóstico. Se inmunizaron por vía intramuscular dos gallinas de raza Leghorn con una cepa atenuada de parvovirus canino (PVC) tipo 2. Se aplicaron 8 inoculaciones por ave cada 15 días. Se cosecharon los huevos y se purificaron los anticuerpos por el método de sulfato de dextrana/sulfato de sodio. Se determinó el título de IgY anti-PVC por el método de Inhibición de la Hemoaglutinación (IH) y con antígeno de PVC acoplado a partículas de látex de poliestireno. Por IH se obtuvo un título de IgY anti-PVC de 1:1024. Las mezclas de anticuerpos con títulos alto y medio de ambas gallinas aglutinaron con los reactivos preparados con 230 y 460 µg/mL de antígeno. La mayor intensidad de la reacción y la mejor detectabilidad correspondieron a los reactivos elaborados con los anticuerpos de mayor título.

The canine parvovirosis is fundamentally one of the main infections causing gastroenteritis in puppies, with high morbilethality rates. The most used diagnostic tests are based on the detection of viral particles excreted during the acute phase of the disease. Some tests require specialized teams, which increases the costs and the time of diagnosis. For this reason, the simplification of these methods with high sensitivity and specificity has a priority. A presumptive diagnosis is only achieved in Cuba, without the complete confirmation of the disease, mainly for the shortage or absence of a diagnostic kit in the whole net of doctor’s offices and veterinary clinics, quick, effective and adjustable to our conditions. This study aimed at obtaining IgY polyclonal antibodies from chicken egg yolk for its possible use in therapies and a latex agglutination diagnostic system. Two leghorn hens were intramuscularly hyper immunized with an attenuated strain of type 2 canine parvovirus (CPV). Eight inoculations were applied per bird every 15 days. The eggs were harvested and the antibodies were purified by the method of dextran sulfate/sodium sulfate. The titer of anti-CPV IgY was determined by the method of Hemagglutination Inhibition (HI) and with canine parvovirus antigen coupled to polystyrene latex particles. A title of IgY anti-CPV of 1:1024 was obtained by HI. Mixtures of antibodies with medium and high titers of both hens agglutinated with the reagents prepared with 230 and 460 µg/mL of antigen. The greatest intensity of the reaction and the best detectability corresponded to reagents prepared with the antibodies of higher titer.

Antigenic and molecular characterization of influenza A (H3N2) virus strains circulating in Cuba and their relation with vaccine strains (1995-98)

Los cambios antigénicos continuos que ocurren en las glicoproteínas de envoltura (hemaglutinina y neuraminidasa) de los virus influenza, se deben a las mutaciones puntuales y a las promovidas por la selección positiva del sistema inmune, que dan origen a las epidemias anuales y reordenamientos de segmentos genómicos, causa de las temidas pandemias. Los intentos para controlar la influenza mediante la vacunación tienen hasta ahora un éxito limitado y son obstaculizados por estos cambios. En Cuba, país subtropical, las infecciones respiratorias agudas constituyen la primera causa de asistencia médica entre las enfermedades infecciosas y la cuarta causa de muerte asociada con la neumonía. La vigilancia para la influenza, en este país, se monitorea por el Laboratorio de Referencia Nacional de Influenza del Instituto de Medicina Tropical ¨Pedro Kouri¨. Este trabajo tiene el objetivo de caracterizar antigénica y genómicamente a 21 cepas de influenza aisladas durante 1995-96 hasta 1997-98, y conocer su similitud con las de circulación internacional, incluidas en las vacunas antigripales de igual periodo. La caracterización antigénica y genómica se realizó mediante las técnicas de inhibición de la hemaglutinación, la inmunoperoxidasa y un sistema de reverso transcripción-reacción en cadena de la polimerasa, respectivamente. Mediante las tres técnicas, el 100% de los aislamientos pertenecieron al tipo A y subtipo H3N2 y permitió clasificarlos como similares a las cepas de circulación internacional recomendadas en la composición de la vacuna antigripal correspondiente a esas temporadas.

The continuous antigenic changes in the influenza viruses occurring primarily on the envelope glycoproteins (hemagglutinin and neuraminidase) are due to specific mutations and to those promoted by the positive selection of the immune system originating the yearly epidemics and the rearrangements of genomic segments, cause of the feared pandemics. The attempts to control the influenza by means of vaccination have so far a limited success and they are obstructed by these changes. The acute respiratory infections are the first cause of medical assistance among the infectious diseases in Cuba, a subtropical country and the fourth cause of death associated with pneumonia. The surveillance for the influenza in this country is monitored by the National Center of Influenza from "Pedro Kourí" Tropical Medicine Institute. The present paper has the objective to characterize 21 strains of influenza isolated from 1995 to 1998 and to know the antigenic and genomic similarity with those of the international circulation included in anti-flu of the same period. The antigenic and genomic characterization was carried out by means of the inhibition techniques of hemagglutination, immunoperoxidase, and a reverse system of transcription-polymerase chain reaction, respectively. Using these three techniques 100% of the isolations were of the type A and the subtype H3N2. It allowed to classify them as similar to the circulating strains of international circulation recommended in the composition of the flu vaccine corresponding to those season.

Molecular characterization of a Cuban isolation of canine parvovirus

El parvovirus canino tipo 2 (VPC-2) es el agente causal de una enfermedad infecto-contagiosa que produce gastroenteritis aguda hemorrágica que afecta a caninos jóvenes. El VPC-2 es un virus con genoma ADN, pequeño, desnudo y muy resistente a las condiciones ambientales que emergió y se expandió rápidamente a fines de la década de los años 70. En los años 80 surgieron consecutivamente dos variantes antigénicas, denominadas VPC-2a y VPC-2b. En el 2000 se detectó una nueva variante antigénica llamada VPC-2c, reportándose con frecuencia en comunidades caninas de varios países del mundo. El objetivo de este trabajo consistió en caracterizar un aislamiento cubano de parvovirus canino, atenuado y adaptado a cultivo celular. El material genético fue amplificado por reacción en cadena de la polimerasa y secuenciado posteriormente. Las secuencias obtenidas fueron analizadas y comparadas con secuencias de aislados y cepas conocidas depositadas en las bases de datos, donde se evidenció que el aislamiento cubano era del tipo VPC-2.

The type 2 canine parvovirus (CPV-2) is the causal agent of an infected-contagious disease that produces a hemorrhagic and acute gastroenteritis that affects young canines. The CPV-2 is a virus with a small, naked DNA genome, very resistant to the environmental conditions that emerged and expanded fast at the end of the 70´s decade. In the 1980, two antigenic variants of CPV-2 emerged almost simultaneously. They were called CPV-2a and CPV-2b. In the 2000, a new antigenic variant was detected. It was called CPV-2c, and was frequently reported in canine communities in some countries worldwide. The objective of this work is to characterize a Cuban isolation of canine parvovirus attenuated and adapted to cellular cultivation. The genetic material was amplified by polymerase chain reaction and sequencing later. The obtained sequences were analyzed and compared with sequences of well-known strains placed in the data base where it was evidenced that the Cuban isolation was of CPV-2 type.

Development of Novel Protocol for Preclinical Monitoring the Release of Adjuvants Encapsulated Mucosal Delivery Carriers

This work contributes in vaccines down-stream process by introducing a novel platform for in-vitro monitoring of vaccine-adjuvant delivery profile as a crucial preclinical optimizing step in mucosal vaccines. Nano and micro particles of Calcium phosphate (Cap) vaccine-adjuvant were encapsulated in Chitosan and Alginate polymeric carriers. Adjuvants release profiles monitored in a permeable bag at 37°C, pH 2, incubated in isotonic buffer for 96 hours. The released Calcium in the outer buffer was monitored and compared in-addition to the carrier’s swelling and biophysical properties. The adjuvants and carriers did not interfere with the proliferation of cultured hepatocytes an indicator of their safe use; Chitosan’s viscosity and swelling were higher than Alginate. Chitosan’s Zeta-potential was significantly high positive, while Cap and Alginate were negative. The prepared CaP and Chitosan particles were in nano-size, while the ready-made CaP adjuvant and Alginate were in micro-size using zeta-seizer and scanning electron-micrograph. The release of nano-size particle was in ascending, extended and controlled manner compared to micro-size adjuvant. Moreover, nano-adjuvant release profile from Chitosan was superior compared to Alginate. The core controlling factors in vaccine-adjuvant sustained release includes; smaller adjuvant particles (nano-size), carrier’s low swelling, high viscosity and importantly carrier-adjuvant entrapment reversibility. Chitosan offers sustained ascending superior capacity in releasing Nano-Cap adjuvant. This novel in-vitro pre-clinical study answer a crucial downstream preparative step for optimizing mucosal vaccines before their direct routine in-vivo trial on animal regardless of adjuvant’s particle size or delivery kinetics.

Este trabajo contribuye a la investigación de vacunas, a través de una plataforma in vitro que monitorea los perfiles de liberación vacuna-adyuvante, como paso crucial para el desarrollo preclínico de vacunas mucosales. Las nano y macropartículas de fosfato de calcio (Cap), se encapsularon en sistemas de liberación de quitosana y alginato. El perfil de liberación del adyuvante fue monitoreado en membranas permeables a 37ºC, pH2 e incubado en tampón isotónico por 96 horas. Se monitoreó el calcio liberado en el tampón externo y se comparó con la capacidad de hidratación del sistema de liberación utilizado y sus características biofísicas. Los adyuvantes y sistemas de liberación no interfirieron con la proliferación de cultivos de hepatocitos, demostrando un uso seguro. La viscosidad de la quitosana y su nivel de hidratación fueron mayores que los del alginato, mientras que el potencial zeta de la quitosana fue altamente positivo y el del alginato negativo. Las formulaciones de Cap y las partículas de quitosana tenían tallas nanométricas, mientras que el Cap en alginato formó micropartículas que se observaron en zeta seizer y microscopios electrónicos de barrido. El perfil de liberación de las nanopartículas ocurrió de forma ascendente, extendida y controlada en comparación con el de las micropartículas. Además, el perfil de liberación de la quitosana fue superior al del alginato. Los factores esenciales a controlar en sistemas de liberación con capacidad adyuvante incluyen: partículas adyuvantes de pequeño tamaño (nano), sistemas de liberación con bajo perfil de hidratación, alta viscosidad y poder de encapsulación reversible. La quitosana ofrece una capacidad superior para la liberación del adyuvante nano-Cap. Este novedoso estudio, responde a la necesidad de optimizar las formulaciones antes de los estudios in vivo en animales, sin tener en cuenta el tamaño de partículas o la cinética de distribución.