Biotecnología Aplicada

Factors involved in the design of nasal delivery systems for peptides and proteins

Because the nasal mucous is one of the most permeable areas, the intranasal delivery route is the most promising for proteins and peptides to reach the central nervous system (CNS). Nevertheless certain aspects of these macromolecules limit their bioavailability, such as molecular weight, the rapid mucociliary clearance mechanism and enzymatic degradation. This paper critically summarizes the factors participating in the design of systems for the nasal delivery of peptides and proteins. The physicochemical properties of the biomolecules and features of the formulation design that directly influence their bioavailablity and stability are presented. Pharmaceutical aspects include an analysis of the influence of excipients that act as stabilizers, antimicrobial preservatives, absorption enhancers, and bioadhesive polymers as well as the administration device. The use of molecules involved in endogenous neuroprotection administered intranasally is a recent proposal in the development of new drugs. Neurotrophic factors, interferon beta-1b, erithropietin (i.e.: rH-EPO, Neuro-EPO) and insulin, are among the biotechnology products administered intranasally. These new products show greater therapeutic potential as putative neuroprotectors in neurological diseases, both for treatment during the acute phase, and for the chronic stage.

Factores que intervienen en el diseño de sistemas de liberación nasal de péptidos y proteínas. La vía nasal es una de las rutas más prometedoras para la administración efectiva de péptidos y proteínas hacia el sistema nervioso central, por la permeabilidad de la mucosa nasal. Sin embargo, estas macromoléculas tienen características como el peso molecular, el rápido aclaramiento mucociliar y la degradación enzimática que limitan su biodisponibilidad. Este trabajo resume de forma crítica los factores que intervienen en el diseño de sistemas de liberación nasal de péptidos y proteínas. Se exponen propiedades físico-químicas de las biomoléculas y del diseño de la formulación que influyen en su biodisponibilidad y estabilidad. Se presenta un análisis de la influencia de algunos excipientes que actúan como estabilizantes, preservativos antimicrobianos, promotores de la absorción y polímeros bioadhesivos, así como el dispositivo de administración. La administración intranasal de moléculas involucradas en la neuroprotección endógena es una propuesta reciente en el desarrollo de nuevos neurofármacos. Los factores neurotróficos, el interferón ß-1b, la rH-EPO, la Neuro-EPO y la insulina son algunos de los productos biotecnológicos que se administran por esa vía, y suelen poseer elevada potencialidad neuroprotectora durante las fases aguda y crónica de las enfermedades neurológicas.

High-level production and aggregation of hepatitis B surface antigen in transgenic tobacco seeds

The hepatitis B surface antigen (HBsAg) has been successfully produced in tobacco leaves, potato tubers and banana fruits, but at a rather low yield. Plant seeds are well suited for the accumulation, long-time storage and preservation of recombinant proteins with pharmaceutical interest, including antigens for prophylactic or therapeutic vaccines. In this work, we assessed the efficacy of the tissue-specific phaseolin promoter in driving the expression of the HBsAg gene in tobacco seeds. Two binary constructs were designed to synthesize this antigen fused or not to the KDEL motif for protein targeting to the endoplasmic reticulum. Tobacco plants were transformed via Agrobacterium tumefaciens using each construct. The highest yield (2.2 µg of the recombinant protein per gram of seed) was achieved by a transgenic line carrying the HBsAg gene without the KDEL fusion. The heterologous antigen aggregated properly forming particles that could be determined using an immunoenzymatic assay based on monoclonal antibody which recognizes the immunodominant epitope a of HBsAg, although seed-derived antigens sedimented slightly faster than the one produced in Pichia pastoris yeast. The HBsAg-expressing tobacco seeds could constitute a novel alternative source for the cost-effective production of the antigen.

El antígeno de superficie de la hepatitis B (AgsHB) se ha producido exitosamente en hojas de tabaco, tubérculos de papa y frutas del banano, pero a muy bajos rendimientos. Se adecuan las semillas de las plantas para la acumulación, el almacenamiento y la preservación de las proteínas recombinantes con interés farmacéutico, incluyendo los antígenos para vacunas profilácticas o terapéuticas. En este trabajo se evaluó la eficacia del promotor tejido específico faseolina para dirigir la expresión del gen del AgsHB en semillas de tabaco. Se diseñaron dos construcciones binarias para sintetizarlo, fusionado o no a la señal de retención en el retículo endoplasmático KDEL. Con cada construcción se transformaron las plantas de tabaco mediante el método de Agrobacterium tumefaciens. El mayor rendimiento (2.2 µg de proteína recombinante por gramo de semilla) se alcanzó en una línea transgénica que portaba el gen del AgsHB sin la fusión de la señal KDEL. El antígeno heterólogo se agregó adecuadamente y se formaron partículas, que se detectaron mediante un ensayo inmunoenzimático basado en un anticuerpo monoclonal que reconoce el epítopo inmunodominante a del AgsHB. El antígeno producido en las semillas sedimentó ligeramente más rápido que el producido en la levadura Pichia pastoris. Las semillas de tabaco que expresan el AgsHB podrían constituir una nueva fuente alternativa para la producción económica de este antígeno.

Immobilization of pectinase by adsorption on an alginate-coated chitin support

Aspergillus niger pectinase was immobilized on an alginate-coated chitin support by adsorption. The optimal conditions for immobilization were: pH 4.5, time of incubation 2 h and 85 µg/mL protein concentration. The yield of immobilized protein was 70 % and the enzyme retained 60 % of the initial activity. Optimal pH, heat stability and reusability were evaluated, among other properties of the immobilized enzyme. The thermostability was enhanced by about 9.7 °C after immobilization. The immobilized pectinase was resistant during incubation, 10-fold more resistant to thermal treatment at 50 ºC than the native enzyme. The optimal pH for the catalytic activity of both, the immobilized pectinase and the free enzyme, was the same, the prepared biocatalyst retaining 50 % of the original catalytic activity after 9 cycles of reuse. The obtained bioconjugate showed good operational stability and improved thermostability. These properties support the potential application of the immobilized pectinase at the juices industry.

Se inmovilizó la pectinasa de Aspergillus niger, por absorción en un soporte de quitina recubierta con alginato. Las condiciones óptimas fueron pH 4.5, incubación 2 h y concentración de proteína 85 µg/mL. El rendimiento de la proteína inmovilizada fue del 70 % y la enzima retuvo el 60 % de su actividad inicial. Se evaluaron el pH óptimo, la termoestabilidad y la reusabilidad, entre otras propiedades de la enzima inmovilizada. La termoestabilidad cambió en 9.7 °C, y la enzima inmovilizada fue 10 veces más estable ante el tratamiento térmico a 50 °C que la enzima nativa. El pH óptimo para la actividad catalítica de la pectinasa inmovilizada y la libre fue el mismo. El biocatalizador retuvo el 50 % de su actividad catalítica original después de 9 ciclos de reuso. El bioconjugado mostró estabilidad operacional y mejoramiento de la termoestabilidad. Estas propiedades son adecuadas para la potencial aplicación de la enzima inmovilizada en la industria de jugos.

Zea mays L. plant growth promotion by Tsukamurella paurometabola strain C-924

Plant growth-promoting bacteria is a group in rhizosphere colonizing bacteria, which produces substances that enhance plant growth and/or protect them against pathogens. Tsukamurella paurometabola C-924 is a strain with nematocidal activity isolated from the rhizospheric soil of a banana plantation in Camagüey, Cuba. The aim of this work was to determine plant growth promoting traits of T. paurometabola C-924 as well as to assess the effect of this strain on the growth of Zea mays L. in the absence of nematodes. Results shown that T. paurometabola C-924 produced indole acetic acid, proteases, chitinases and had the capability to solubilize calcium triphosphate. T. paurometabola C-924 also showed antagonistic activity versus the phytopathogenic fungi tested (Sarocladium oryzae, Alternaria longipes, Pestalotia palmarum and Pythium debaryanum) and it improved the development of Z. mays plants in greenhouse conditions. T. paurometabola C-924 might have potential in future field application not only as a nematocidic agent, but also as plant growth promoter. This is the first report of an isolate of T. paurometabola with plant growth promoting activity.

Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal son colonizadoras de la rizosfera y producen sustancias que estimulan el crecimiento de las plantas y/o las protegen contra organismos patógenos. Tsukamurella paurometabola C-924 es una cepa con actividad nematicida aislada de suelo rizosférico en una plantación de banana en Camagüey, Cuba. El objetivo de este trabajo fue determinar algunos de los caracteres promotores del crecimiento vegetal de T. paurometabola C-924 y evaluar el efecto de esta cepa en el crecimiento de Zea mays L. en ausencia de nematodos. Los resultados mostraron que T. paurometabola C-924 produce ácido indolacético, proteasas y quitinasas y solubiliza fosfato tricálcico. También mostró actividad antagónica contra los hongos fitopatógenos ensayados (Sarocladium oryzae, Alternaria longipes, Pestalotia palmarum and Pythium debaryanum) y estimuló el desarrollo de las plantas de Z. mays L. en condiciones de invernadero. T. paurometabola C-924 es potencialmente aplicable en el campo no solo como agente nematicida, sino también como promotor del crecimiento vegetal.

Preclinical safety testing of the Quimi-Hib(r) vaccine adjuvanted with aluminum phosphate during product development

Haemophilus influenzae type b (Hib) is a Gram-negative bacterium causing diseases such as meningitis, pneumonia, epiglottis, cellulitis, septicemia and arthritis, among others. Hib-caused meningitis / Hib meningitis is a very serious disease with a death rate of more than 50 % throughout the world; therefore obtaining a vaccine against this bacterium is a goal of the highest priority. The present report presents the results of preclinical safety testing of the Quimi-Hib(r) vaccine (synthetic Hib antigen conjugated to tetanus toxoid) adjuvanted with aluminum phosphate. The battery of toxicological tests included acute toxicity (15 days), local tolerance (15 days) and repeated-dose toxicity (30 days), all of them evaluating the therapeutic dose of the vaccine as part of the studied experimental treatments. Three vaccine dose levels and a placebo (excipients plus adjuvant) were examined, administering the vaccine intramuscularly to Sprague Dawley rats of both sexes. After examining the data obtained from the administration of this wide range of doses to Sprague Dawley rats, it was concluded that the synthetic conjugate vaccine Quimi-Hib(r) adjuvanted in aluminum phosphate is not toxic and does not cause systemic adverse effects. No macroscopic alterations were observed in the studied organs, and the evaluation of the inoculation site only detected indurations caused by macrophage granulomas, resulting from the mechanism of action of the adjuvant included in the formulation.

Haemophilus influenzae tipo b (Hib) es una bacteria gramnegativa causante de enfermedades como meningitis, neumonía, epiglotitis, celulitis, septicemia, artritis, entre otras, en los seres humanos. La meningitis causada por Hib es muy grave, con una tasa de muertes de más del 50 % en varias partes del mundo. Por tales razones, la obtención de una vacuna contra esta afección es una prioridad. El objetivo de este estudio fue evaluar la seguridad preclínica de la vacuna Quimi-Hib(r) (antígeno sintético de Hib conjugado con toxoide tetánico), en una formulación adyuvada con fosfato de aluminio, durante la etapa de desarrollo del producto. Los ensayos toxicológicos incluyeron estudios de toxicidad aguda (15 días), de tolerancia local (30 días) y de toxicidad a dosis repetidas (15 días), que incluyeron la dosis terapéutica de la vacuna. Se exploraron tres niveles de dosis de la vacuna y un placebo (excipientes más adyuvante), que se administraron por vía intramuscular a ratas Sprague Dawley de ambos sexos. Según nuestros resultados en el espectro de dosis explorado en las ratas, se concluyó que la vacuna conjugada Quimi-Hib(r) adyuvada en fosfato de aluminio no es tóxica, ni provoca efectos sistémicos adversos en esa especie. No se detectaron alteraciones macroscópicas en los órganos estudiados, y al evaluar el sitio de administración, solo se observaron induraciones causadas por granulomas macrofágicos, resultantes del mecanismo de acción del adyuvante incluido en la formulación.

Evaluation of four viroid RNA extraction methods for the molecular diagnosis of CEVd in Citrus lemon using RT-PCR, Dot blot and Northern blot

An efficient method for RNA extraction that leads to RNA high yield and purity is a technical issue relevant for development and optimization of molecular diagnostic methods aimed to detect viroid infections in citrus varieties. Residual contaminants may affect RNA detection depending on the molecular diagnosis approaches. This condition can be evaluated through RNA absorption spectrum analysis. Functionally, it is assessed through observation of RT-PCR amplification products and Northern blot and Dot-blot signal intensities, displaying levels of analytical response/sensitivity. Four RNA extraction methods were evaluated to determine their effects on the capacity to detect viroid CEVd presence/absence in Citrus limon through four molecular diagnostic approaches: 1) conventional viroid extraction (CVE); 2) phenol/guanidine thiocyanate (PGT), 3) SDS/potassium acetate (SPA); and 4) formaldehyde/ SSC (FS). Phloem tissue quantifications showed values between 7500 ng/µL and 1200 ng/µL and ranged 1.3-2.0 OD260/280. Evaluations through RT-PCR showed the expected amplifications of the entire CEVd genome, but erratic scenarios still remained. Non-radioactive probe hybridization techniques revealed high intensity signals (132 RU) for infected tissue, by using the CVE method, and a positivity cut-off for the presence of infection was established (78 RU). Nevertheless, molecular hybridization tools can jeopardize the diagnosis due to the thoroughness of the protocol and the RNA template conditions. The diagnostic ability of the association of Northern blot with CVE viroid extraction analyses as starting point was evidenced for successful detection, among the molecular methods tested.

En el desarrollo de metodologías moleculares diagnósticas en variedades cítricas propensas a infección viroide, se precisa la extracción eficiente de ARN, siguiendo criterios de concentración y pureza. Los contaminantes remanentes pueden afectar la detección según la herramienta molecular escogida. Esta condición se analiza a partir del espectro de absorción del ARN; mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y por los niveles de intensidad de las señales de Northern blot y Dot blot, en términos de respuesta analítica/sensibilidad. Se evaluaron cuatro métodos de extracción de ARN, por sus efectos sobre la detección de presencia/ausencia del Citrus Exocortis Viroid (CEVd) en Citrus limon mediante análisis moleculares diagnósticos: 1) extracción viroide convencional (EVC); 2) fenol/tiocianato de guanidina (FTG); 3) SDS/acetato de potasio (SAP); y 4) formaldehído/SSC (FS). Los valores del tejido de floema estuvieron entre 7500 ng/µL y 1200 ng/µL y los rangos entre 1.3 y 2.

Modified T4 Neonatal UMELISA(r) to 3 mm discs for a more rational use of dried blood newborn samples on filter paper

Congenital hypothyroidism (CH) is one of the most common preventable causes of mental retardation. Newborn screening and thyroid therapy started within 2 weeks of age can normalize the cognitive and motor impairment caused by lack of thyroid hormone during the early postnatal phase of brain development. The availability of assays to determine thyroxin (T4) and thyroid stimulating hormone has allowed the establishment of newborn screening programs for CH. The Immunoassay Center (Cuba) developed the T4 Neonatal UMELISA(r) to determine neonatal T4 levels in dried blood on filter paper using 5 mm discs of samples, standards and controls. The number of diseases which can be diagnosed in Neonatal Screening Programs has increased, so it is necessary to make the maximum use of blood samples collected on filter paper. This work shows the standardization of the T4 Neonatal UMELISA(r) modified in order to use 3 mm discs. The assay was completed in 3 1/2 hours, with a measuring range of 25-400 nmol/L. The intra- and inter-assay coefficients of variation (CV) were 6-10 % and 7-12 % respectively, depending on the T4 concentrations. The recovery ranged from 91.8-115.1 %. The modified assay showed high Pearson correlation (r = 0.877) and concordance correlation (?c = 0.867) with the T4 Neonatal UMELISA(r). The performed modifications do not affect the sensitivity, precision and accuracy of the assay, permitting a more rational use of newborn blood samples and the possibility to increase the number of diseases included in the newborn screening programs.

El hipotiroidismo congénito (HC) es una de las causas más frecuentes de retraso mental prevenible en la infancia. La pesquisa neonatal (PN), su diagnóstico y tratamiento, podrían normalizar la discapacidad cognitiva y motora por la falta de hormonas tiroideas durante la etapa temprana de desarrollo del cerebro. Los ensayos para determinar la tiroxina total (T4) y la hormona estimulante del tiroides han permitido establecer programas de PN del HC. El Centro de Inmunoensayo, de La Habana, desarrolló el ensayo inmunoenzimático competitivo UMELISA T4 Neonatal(r) para determinar los niveles de T4 en neonatos, utilizando discos de 5 mm de muestras, calibradores y controles de sangre seca sobre papel de filtro. Las enfermedades que se pueden diagnosticar mediante esos programas han aumentado, por lo que se deben optimizar los estudios con las muestras de sangre de recién nacidos tomadas en papel de filtro. Este trabajo consistió en la estandarización de un UMELISA T4 Neonatal(r) modificado para emplear discos de 3 mm. El ensayo dura 3 1/2 h, y el análisis abarca entre 25 y 400 nmol/L. Los coeficientes de variación intra e interensayo estuvieron en los rangos 6-10 % y 7-12 %, respectivamente. La recuperación fue de 91.8 y 115.1 %. La correlación de Pearson fue elevada (r = 0.877) y hubo concordancia de la correlación (?c = 0. 867) con el UMELISA T4 Neonatal.

A uniform digital identifier for scientific articles from manuscript through citation

A uniform digital identifier (UDI) is presented for scientific manuscripts from editorial receipt through bibliographic citation. The UDI replaces conventional pagination and allows citing the manuscript upon acceptance, remaining as article's metadata after the assignation of bibliographic information (year, volume and issue). It provides explicit information on the journal, type of article, manuscript editorial ID code, acceptance date, and, if peer-reviewed (i.e., original research) the period in months of that process. Additionally, the language of publication can be added as ISO 639-1. Significantly, it provides uniform tracking of manuscripts from submission, functioning as locator for all the article versions, and increases the explicit information on editorial processing provided when citing the article in bibliographic references. The last one will favor the bibliometric analysis of editorial peer-review directly from reference lists, adding value to them and also to bibliographic database metadata.

Se propone un identificador digital uniforme (IDU) para manuscritos científicos desde la recepción editorial hasta la citación bibliográfica. El UDI reemplaza la paginación tradicional y permite citar el manuscrito tras su aceptación, y permanece como metadato del artículo después de asignarle a este la información bibliográfica (año, volumen y número). Este identificador proporciona información explícita sobre la revista, el tipo de artículo, el código de identificación de procesamiento editorial, la fecha de aceptación y, en caso de que el artículo sea evaluado por pares, el periodo de revisión en meses. Adicionalmente, se puede indicar el idioma del artículo mediante el código ISO 639-1. De forma significativa, el UDI permite el seguimiento uniforme del los artículos durante todo su ciclo de vida desde el envío, funciona como localizador de todas sus versiones e incrementa la información explícita sobre el procesamiento editorial, disponible como metadato al citarlo dentro de listas de referencias bibliográficas. Este último aspecto favorecería el análisis bibliométrico de los periodos de revisión por pares editorial a partir de las listas de referencias, y les añadiría valor a estas y a sus metadatos depositados en las bases de datos bibliográficas.

Highlights from Barcelona 2012 International Liver Congress and EASL meeting

The International Liver Congress 2012 took place at the Centre de Convencions Internacional de Barcelona (CCIB), Spain, on April 18-22. This venue was the 47th annual meeting of the European Association for the Study of the Liver (EASL). The most important novelties of these two events are summarized in the present report.

El Congreso Internacional del Hígado del año 2012 se celebró en el Centro de Convenciones Internacional de Barcelona (CCIB), España, del 18 al 22 de abril. En esta ocasión coincidió con la 47 Convención Anual de la Asociación Europea para el Estudio del Hígado (EASL). Se describen en este reporte las novedades más relevantes de estos dos importantes eventos.

Proof of concept in non-human primates of the heterologous prime-boost strategy combining dengue-2 virus and recombinant proteins including domain III of the viral envelope protein

Live attenuated viruses are the most advanced candidates against a dengue infection. They have been demonstrated to be immunogenic in preclinical and clinical studies. However, due to their replicative capacity, they require several doses to achieve the balanced immune response against the four serotypes. The use of a suitable combination using nonreplicative immunogens, without viral interference, can help to induce such a balanced response. This work dealt with the proof of concept of the heterologous prime-boost strategy combining in the same schedule in non-human primates of a live virus and the recombinant proteins containing the domain III of the viral envelope. These combinations may result in condensed immunization schedules for humans, thus reducing the number of doses with attenuated virus and the dose time spacing. In both studies, the humoral and cellular immune responses after the boost dose with each recombinant protein were evaluated. In the second study, additionally, the possibility of shortening the schedule was assessed, an advantage related with this prime-boost strategy. The boost effect was demonstrated by the neutralizing antibodies induced after recombinant protein immunizations. Additionally, it was confirmed that these neutralizing antibodies were long lasting, also the animals were able to mount a specific cellular immune response after the boost. This study won the Annual Award of the Academy of Sciences of Cuba in 2012.

Los virus vivos atenuados son los candidatos vacunales más avanzados contra la infección por dengue. Sus propiedades inmunogénicas se han demostrado en estudios preclínicos y clínicos. Sin embargo, por su cualidad replicativa es necesario administrarlos en varias dosis para alcanzar el equilibrio entre las respuestas inmunológicas contra los cuatro serotipos del virus dengue. Las combinaciones adecuadas de inmunógenos no replicativos sin interferencia viral pudiera ayudar a alcanzar esta respuesta. En este trabajo se describe la prueba de concepto de la estrategia de inducción-potenciación de la respuesta inmune en un mismo esquema en primates no humanos tras la inmunización: primero con un virus vivo (dengue serotipo 2) y después con proteínas recombinantes que contenían el dominio III de la envoltura viral. Estas combinaciones pueden generar esquemas más cortos para la inmunización de seres humanos, con la reducción del número de dosis del virus atenuado y el espaciamiento entre ellas. En ambos estudios se evaluaron las respuestas inmune humoral y celular después de la dosis de refuerzo con cada proteína recombinante. En el segundo estudio se exploró, además, el acortamiento del esquema, una ventaja de este tipo de estrategias vacunales. El efecto potenciador se demostró mediante la inducción de anticuerpos neutralizantes después de la dosis de refuerzo con proteínas recombinantes. Adicionalmente se confirmó que estos anticuerpos neutralizantes tenían larga duración, y en los animales fueron hubo respuesta inmune celular específica después del refuerzo. Este estudio mereció el Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba, en el año 2012.

Therapeutic effect of two altered peptide ligands derived from the human heat shock protein 60 in experimental models of rheumatoid arthritis

Induction of immune tolerance as therapeutic approach for autoimmune diseases constitutes a current research focal point. In this sense, two Altered Peptide Ligands (APLs) were evaluated for the induction of peripheral tolerance in patients with Rheumatoid Arthritis (RA). Two novel T cell epitopes from human heat-shock protein 60 (hHsp60), an autoantigen involved in the pathogenesis of RA, were identified by bioinformatics tools and two APLs were designed from these epitopes (APL-1 and APL-2). APL-1 increases the proportions of the CD4+CD25highFoxP3+ regulatory T cells in ex vivo assays using PBMCs isolated from RA patients. While, APL-2 increased the IL-10 level and suppressed IL-17 secretion, and induces the activation of T cells through his ability to modify cell cycle phase's distribution of CD4+ T cells from RA patients. Additionally, the therapeutic effect of these APLs in two animal models was evaluated: adjuvant induced arthritis (AA) in Lewis rat and collagen induced arthritis (CIA) in DBA/1 mice. Our approach was compared to metotrexate (MTX), the treatment of reference for RA, in CIA model. Clinical score, TNF-a levels and histopathology were monitored. Both APLs efficiently inhibited the course of AA and CIA, with significant reduction of the clinical and histopathology scores. The therapeutic effect induced by APLs is mediated by different molecular mechanisms, associated with immunologic tolerance. These results indicate a therapeutic potentiality of these APLs and support further investigation for treatment of RA. This study won the Annual Award of the Academy of Sciences of Cuba in 2012.

La inducción de tolerancia periférica mediante el uso de autoantígenos involucrados en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes, constituye una alternativa muy atractiva para el tratamiento de estas afecciones. Se evaluaron dos ligandos peptídicos alterados (LPA-1 y LPA-2) para la inducción de tolerancia periférica en pacientes con artritis reumatoide (AR). Estos se derivaron de dos nuevos epitopos de células T humanas, identificados en la proteína de estrés celular de 60 kDa (Hsp60), autoantígeno involucrado en la patogénesis de la AR. El LPA-1 aumentó las proporciones de células T reguladoras CD4+CD25highFoxP3+ en ensayos ex vivo en células mononucleares de sangre periférica aisladas de pacientes con AR. El LPA-2 incrementó los niveles de IL-10, suprimió la secreción de IL-17 e indujo la activación de células T mediante la modificación de la distribución de fases del ciclo celular en linfocitos T CD4+ de pacientes con AR. Se comprobó el efecto terapéutico de los LPA en dos modelos animales: artritis adyuvante (AA) en ratas Lewis, y artritis inducida por colágeno (AIC) en ratones DBA/1. Este se comparó con el tratamiento con metotrexato (MTX), medicamento de referencia para la AR. Se monitorearon los niveles del factor de necrosis tumoral alfa, la clasificación clínica y la histopatología. Ambos LPA inhibieron eficazmente el curso de la AA y de la AIC, y redujeron significativamente los dos últimos parámetros. Su efecto terapéutico estuvo mediado por mecanismos moleculares relacionados con la tolerancia inmune. Estos resultados indicaron el potencial terapéutico de estos dos LPA en la AR, y las posibilidades investigativas en torno a ellos como candidatos. Este estudio mereció el Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba, en el año 2012.

Transgenic plants of Nicotiana tabacum L. express aglycosylated monoclonal antibody with antitumor activity

The expression and production of pharmaceutical, industrial and veterinary proteins in plants is an attractive approach. These expression hosts bear an enormous production potential in terms of volume, easy processing of the starting material, and safety of the final product due to the lack of pathogens able to infect animal and human cells. Antibodies are among the most frequently proteins expressed in plants, subsequently called plantibodies. However, plantibodies are differently glycosylated in plant cells, with oligosaccharide residues being added which may them immunogenic in the final organism. For that reason, several strategies have been developed to genetically modify host plants to mimic the N-glycosylation patterns typical in animal cells. This work was aimed at developing a strategy to obtain a aglycosylated plantibody version of nimotuzumab, the first antibody registered as a product in Cuba for cancer immunotherapy. The strategy comprised the genetic modification of the heavy chain glycosylation site of nimotuzumab, and its expression as an aglycosylated protein in tobacco leaves, by means of developing a transient expression system using Agrobacterium infiltration into tobacco leaves for the initial characterization of the plantibody. It was demonstrated that transgenic plants were capable of producing a plant-derived nimotuzumab antibody which retained the antitumor activity in vitro and in vivo, compared to its glycosylated counterpart produced in mammalian cells. This work demonstrates the potential of transgenic plants to produce aglycosylated therapeutic antibodies for cancer treatment, and won the National Award of the Academy of Sciences of Cuba in 2012.

El empleo de plantas transgénicas para producir proteínas con fines farmacéuticos, industriales y ve-terinarios es una estrategia promisoria. Este sistema hospedero tiene un gran potencial productivo, en términos de volumen, fácil procesamiento y seguridad del producto final, por la ausencia de patógenos que infecten las células animales y humanas. Los anticuerpos están entre las proteínas más frecuentemente expresadas en las plantas, denominados planticuerpos. Sin embargo, los planticuerpos se glicosilan diferencialmente en las plantas pues se les adicionan residuos de oligosacáridos que pudieran hacerlos inmunogénicos en el organismo de destino. Con estos fines se han implementado estrategias para modificar genéticamente las plantas de forma que reproduzcan los patrones de N-glicosilación típicos de células animales. El propósito de este trabajo fue desarrollar una estrategia para obtener una versión aglicosilada del anticuerpo nimotuzumab, el primero registrado en Cuba como producto para la inmunoterapia del cáncer. Comprendió la modificación genética del sitio de N-glicosilación en la cadena pesada del anticuerpo y su expresión como proteína aglicosilada en hojas de tabaco. Para la caracterización inicial del planticuerpo se desarrolló un sistema de expresión transitoria por infiltración de Agrobacterium en hojas de tabaco. Las plantas transgénicas expresaron el planticuerpo PhR3 con similar actividad antitumoral que la mostrada por el nimotuzumab producido en células de mamíferos. Este trabajo demuestra la potencialidad del sistema de plantas transgénicas para producir anticuerpos terapéuticos aglicosilados para el tratamiento del cáncer, y mereció el Premio Nacional de la Academia de Ciencias de Cuba en 2012.