Biotecnología Aplicada

Inorganic compounds as vaccine adjuvants

The adjuvant capacity of minerals was first discovered in 1926, when a suspension of diphtheria toxoid precipitated with potassium aluminum sulfate was found to be significantly more immunogenic than the same suspension in the absence of this compound. Although a large number of inorganic salts have since been evaluated for this purpose, only alum, phosphate and aluminum hydroxide, and aluminum sulfate hydroxyphosphate have been approved in humans, and calcium phosphate is included in some vaccines manufactured in Europe. In the past, lack of awareness of the fact that the adjuvant properties of inorganic salts are highly dependent on nuances of their production processes that directly affect the depot and presenting effects attributed to adjuvants has led to the rejection of many compounds with potentially better adjuvant properties than traditional aluminum salts. However, the application of recent advances in nanotechnology and the combination of different adjuvants have led to the emergence and evaluation of a large number of new alternatives. The present review describes the most frequently cited inorganic adjuvants, examining their potential for the development of more potent vaccines than the current crop of products using aluminum-based compounds.

Compuestos inorgánicos como adyuvantes de vacunas. La propiedad adyuvante de los minerales fue descubierta en 1926, al observarse que una suspensión de toxoide diftérico precipitado con sulfato doble de aluminio y potasio proveía de una inmunogenicidad notablemente superior al toxoide sin adyuvante. Desde entonces se han evaluado numerosas sales inorgánicas como adyuvantes de vacunas y las únicas aprobadas para su uso en seres humanos son el sulfato doble de aluminio y potasio, el fosfato e hidróxido de aluminio y el sulfato de hidroxifosfato de aluminio. El fosfato de calcio se ha utilizado en algunas vacunas europeas. Las propiedades adyuvantes de las sales inorgánicas son muy dependientes del proceso de obtención e inciden sobre los efectos depósito y presentador atribuidos a estas. La no observancia de ello ha conducido al rechazo de muchas sales con mejores propiedades adyuvantes que las tradicionales sales de aluminio. La aplicación de los últimos avances de la nanotecnología y la alternativa de combinar adyuvantes han motivado la síntesis y evaluación de nuevos adyuvantes. En esta revisión se describen los adyuvantes inorgánicos citados con mayor frecuencia y sus potencialidades para el desarrollo de vacunas más eficaces que las que poseen sales de aluminio como adyuvantes.

Characterization of the IVS17bTA microsatellite marker and six CTFR gene mutations in 21 Cuban families with cystic fibrosis

Cystic fibrosis is an autosomal recessive disease. Its incidence in Cuba is 1 in 5000 live births. The molecular cause underlying this disease is related to mutations in the regulatory gene encoding the cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR). In this study, the techniques for the study of IVS17bTA microsatellite marker were standardized, and the most frequent mutations in the CFTR gene were also detected for 21 Cuban families. Polymerase chain reaction, agarose and polyacrylamide (plus silver staining) gel electrophoresis techniques were used for both, identification of mutations and microsatellite standardization. Among the 22 Cuban patients, seven were found homozygous, four compound heterozygous and 11 with a single mutation so, 33 chromosomes were molecularly characterized for the 75 %. Twelve allelic variants were found for the IVS17bTA microsatellite; alleles 31 and 7 the most frequent ones. Alleles 31 and 46 were associated to the F508del and R334W mutations, respectively. Among the 21 families, 18 were completely informative for the IVS17bTA microsatellite marker, accounting for 85.7 %. This study helped to complete the diagnosis in those patients in which the responsible mutations in one or both chromosomes had not yet been identified. Besides, we were also able to identify mutations associated with different alleles of the marker without gene sequencing, also helping to decrease the cost of screening.

La fibrosis quística es una enfermedad autosómica recesiva. Su incidencia en Cuba es de 1 de cada 5000 recién nacidos vivos. La causa molecular que provoca esta enfermedad son las mutaciones en el gen regulador transmembranal de la fibrosis quística (CFTR). En este estudio se detectaron las mutaciones más frecuentes en 21 familias cubanas y se estandarizaron las técnicas para el estudio del marcador microsatélite IVS17bTA, lo cual constituyó nuestro objetivo principal. Para la identificación de estas mutaciones y la estandarización del microsatélite, se emplearon las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa y electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida (tinción con plata). De los 22 pacientes, se encontraron 7 homocigóticos, 4 heterocigóticos compuestos y 11 con una sola mutación, por lo que se caracterizaron molecularmente 33 cromosomas, lo que representa el 75 %. En el estudio del microsatélite IVS17bTA se encontraron 12 variantes alélicas, los alelos más frecuentes fueron el 31 y el 7. El alelo asociado a la mutación F508del fue el 31 y a la mutación R334W fue el 46. De las 21 familias analizadas, 18 resultaron completamente informativas para el marcador, lo que representa el 85.7 % Este estudio ha ayudado a completar aún más el diagnóstico en los pacientes en los que aún no se han identificado las mutaciones responsables en ambos cromosomas o en uno de ellos. Además se han podido identificar mutaciones asociadas a diferentes alelos del marcador, sin necesidad de secuenciar el gen, lo que aumentaría el costo.

Plant regeneration of plantain 'Barraganete' from somatic embryos using a temporary immersion system

Banana and plantain (Musa spp.) are highly-demanded fruits at the international level. In vitro propagation of plantain in solid medium by using apical meristems, as initial explants, is a very slow method that is always accompanied by high phenolization of culture medium, which leads to poor shooting or death of cultured tissue. This paper reports the successful regeneration (84.5 %) of 'Barraganete' plantain (AAB) plants from somatic embryos, obtained from embryogenic cell suspensions and using a temporary immersion system. The low percentage (1.55 %) of somaclonal variation in plants grown under greenhouse conditions indicates that this method could be used for commercial propagation. However, regenerated plants should be monitored for a longer period to rule out the possibility of somaclonal variation in adult plants.

Los bananos (Musa spp.) producen frutos de gran demanda en el mercado internacional. La propagación in vitro de plátano, utilizando el medio de cultivo sólido y los meristemos apicales como los explantes iniciales, es un método lento y siempre está acompañado por una alta fenolización, tanto de los explantes como de los medios de cultivo o la muerte de los brotes. En esta investigación se obtuvieron los embriones somáticos de plátano de la variedad 'Barraganete' (AAB) en las suspensiones celulares. El 84.5 % de estos se regeneraron en plantas mediante el uso de biorreactores de inmersión temporal, utilizando el medio de cultivo líquido. El bajo porcentaje de variación somaclonal (1.55 %) en las plantas evaluadas permitió pensar que el método empleado puede ser utilizado para la propagación comercial de plátano, aunque es necesario seguir el estudio de la variación somaclonal en las plantas adultas.

Impact of native phosphate solubilizing bacteria on the growth and development of radish (Raphanus sativus L.) plants

This work was aimed at evaluating the activity of native phosphate solubilizing bacteria on growth and development of radish (Raphanus sativus L.) plants. Bacteria were isolated from the Departament of Sucre (Colombia) soil using selective media (NBRIP), further identified by macroscopic and microscopic observation and biochemically characterized using the API System. Their ability to solublize phosphate was then evaluated using the vanadomolybdate acid phosphate colorimetric method. The microorganisms of the highest phosphate solubilizing capacity (Enterobacter sp. and Klebsiella sp.) were multiplied up to concentrations of 106, 107 and 108 c.f.u./mL and then evaluated on radish seeds. Eight treatments were used including witness control and commercial control. Biometric variables, root length, leaf area and dry weight, for treatments T5 (biopreparation with Klebsiella sp., 107 c.f.u./mL) and T1 (biopreparation with Enterobacter sp.,106 u.f.c./mL) were statistically higher than the control treatment. In addition, no significant differences regarding dry weight were found with respect to T7 (chemical fertilizer). The growth and development of radish plants were improved in treatments inoculated with bacteria when compared to controls, confirming the positive effect of phosphate solubilizing activity of the native strains.

El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad solubilizadora de fosfato de algunas bacterias nativas sobre el crecimiento y desarrollo de plantas de rábano (Raphanus sativus L.). Las bacterias se aislaron a partir de suelos del Departamento de Sucre (Colombia), usando medio selectivo de crecimiento con fosfato (NBRIP). Posteriormente se identificaron mediante observación macroscópica, microscópica y caracterización bioquímica, empleando el sistema de multipruebas API 20. La propiedad solubilizadora de fosfato se evaluó utilizando el método colorimétrico de ácido vanadomolibdato fosfato. Los microorganismos de más propiedades (Enterobacter sp. y Klebsiella sp.) se multiplicaron a concentraciones de 106, 107 y 108 u.f.c./mL, y luego se introdujeron en las semillas de rábano. Se utilizaron ocho tratamientos, que incluyeron un control testigo y un control que recibió fertilizante mineral sintético comercial. Las variables biométricas: longitud de la raíz principal, área foliar y peso seco de las plantas que recibieron los tratamientos T5 (biopreparado con Klebsiella sp. a 107 u.f.c./mL) y T1 (biopreparado con Enterobacter sp. a 106 u.f.c./mL) fueron estadísticamente superiores al tratamiento control testigo. No hubo diferencias significativas en el peso seco con respecto a las plantas que recibieron T7 (fertilizante mineral sintético comercial). Se evidenció un mayor crecimiento y desarrollo de las plantas de rábano inoculadas con las bacterias, en comparación con los controles, lo que confirmó el efecto positivo de la actividad solubilizadora de fosfato de las cepas nativas.

Cardiotropic effect of GHRP-6: in vivo characterization by echocardiography

A pharmacological therapy aimed at the multiple targets exposed by the complex pathophysiology of heart failure remains an unmet clinical need. One possible solution is the use of growth hormone secretagogue peptides, which have important cardiotropic properties. The aim of this work was to conduct an experimental evaluation of the effect of growth hormone releasing peptide six (GHRP-6) on heart function. Bi-dimensional experimental echocardiography was used to evaluate the cardiotropic effect of GHRP-6 when 400 µg/kg were administered to Balb/c mice, measuring the ventricular ejection fraction. Dose-dependency was studied with dosages of 100, 200 and 400 µg/kg, and the effect of concomitant beta-blocker usage on the effect of this peptide was assessed in animals chronically treated with metoprolol at 30 mg/kg. GHRP-6 increased the left ventricular ejection fraction without changes on heart rate. This inotropic effect was dose-dependent, and was sustained even in animals chronically treated with metoprolol.

Una terapia farmacológica que incida en múltiples blancos de la fisiopatología de la insuficiencia cardiaca es una necesidad clínica no satisfecha. Los péptidos secretagogos de la hormona de crecimiento se caracterizan por ejercer efectos cardiotrópicos relevantes. El objetivo de este trabajo fue evaluar, de manera experimental, el efecto del péptido 6 liberador de la hormona de crecimiento (GHRP-6) sobre la función cardiaca. Mediante la ecocardiografía bidimensional experimental, se evaluó el efecto cardiotrópico del GHRP-6 al administrar una dosis de 400 µg/kg en ratones Balb/c. Se estudió la respuesta en dependencia de la dosis: 100, 200 y 400 µg/kg, y el efecto sobre la función cardiaca en un grupo de animales que recibieron betabloqueo crónico con 30 mg/kg de metoprolol. El GHRP-6 incrementó la fracción de eyección ventricular izquierda, sin que aumentara la frecuencia cardiaca. El efecto inotrópico del GHRP-6 depende de la dosis y se mantiene, incluso, en los animales sometidos a betabloqueo crónico, sin que aumente la frecuencia cardiaca.

Economic-financial management modeling for biotechnology enterprises in Cuba

Valorization of knowledge generated by the fast advance of science and its marketing has led to the so-called "knowledge-based economy" and as a consequence high-technology (HiTech) companies have emerged. Those based in Biotechnology have some specific features compared to other HiTech sectors. This paper provides a model to structure the economic management of HiTech Biotechnology organizations in Cuba, considering the national economy and the experience accumulated by several institutions from the Scientific Biotech Pole in Western Havana. The model is based on some concepts and proposals, and it addresses key elements, such as: insurance of adequate funding levels for R&D activities and technology replacement, flexible import and export management, the ability to get into very competitive markets and preservation of a highly qualified workforce. It also demonstrates the feasibility to establish this kind of enterprises in the context and regulations already existing in a non-capitalist environment, in the middle of the update of Cuban economy.

El valor del conocimiento y su uso como mercancía, resultantes del acelerado avance de la ciencia, han originado el concepto economía del conocimiento y, como consecuencia, las empresas de alta tecnología (AT). Las del sector biotecnológico poseen características peculiares con respecto a otros ramos de AT. En tal sentido, se ofrecen conceptos necesarios y se propone un modelo de gestión económica para este tipo de empresas en Cuba, partiendo de la experiencia de varias instituciones del Polo Científico de la biotecnología. Este modelo persigue garantizar niveles de financiamiento adecuados para las actividades de investigación y desarrollo, la reposición de tecnologías, la flexibilidad en la gestión comercializadora, la capacidad de penetración en mercados cotizados y la preservación de una fuerza laboral altamente calificada, entre otros elementos claves. Se demuestra además la posibilidad de implementar este tipo de empresas en Cuba, pese a las regulaciones actuales de su economía, y en concordancia con el proceso de actualización de su modelo económico.

Strategic actions for a sustained leadership of the Cuban biotechnology industry

This paper offers a vision of the Cuban biotechnology industry (CBI) derived from the conception of its future, as a frame of reference for the transformations and actions of today. Based on prospective analysis, we have defined the fundamental variables having the largest impact on the sector, thus facilitating the identification of key objectives for future actions and decision-making, which will build the future image of Cuban biotechnology. The shared vision of all actors involved in the CBI, who will work together in devising it, is of utmost importance. Together with the State’s strategic priority to the industry and to strengthening the industrial policy for early actions consistent with this vision, this paper devotes a special significance to the updating of the Cuban economic model in agreement with the needs of the CBI. This would facilitate the necessary adjustments of strategic actions when dealing with the challenges in this sector.

Actuación estratégica para el sostenimiento del liderazgo de la industria biotecnológica de Cuba. Se ofrece una visión de la industria biotecnológica de Cuba (IBC) derivada de la reflexión sobre el futuro, como referente de transformación y actuación en el presente. Respaldado en las herramientas de la prospectiva, este artículo aporta las variables que provocan los cambios en la IBC y facilita la identificación de las variables clave para la toma de decisiones y la actuación, que conducirían a la construcción de la imagen de futuro del sector. Se destaca la connotación de compartir la visión entre los actores que convergen en la IBC, con el fin de que se movilicen mancomunadamente en su construcción. Junto con la prioridad estratégica del Estado sobre la industria y el fortalecimiento de la política industrial para la actuación anticipada y coherente con la visión, el artículo otorga un significado especial a la actualización del modelo económico, en correspondencia con las necesidades de la IBC. Todo ello facilita el ajuste necesario de la actuación estratégica frente a los desafíos de este sector.

Identification of the first antagonist peptide that inhibits biological effects of interleukin-15

Interleukin-15 (IL-15) is a pro-inflammatory cytokine that is expressed in several autoimmune and inflammatory diseases. We have identified the 36-45 sequence KVTAMKCFLL on human IL-15 that is recognized by a soluble form of recombinant hIL-15Ra-Fc fusion protein. This sequence synthesized as a 10 aa. peptide binds to the IL-15Raand was able to block the biological activity of IL-15 in two IL-15 dependent cells lines. Using alanine scan strategy we identified a more active peptide by replacing the second Lys in the sequence for the polar non-charged amino acid threonine. Moreover, soluble IL-15Rawas quantitated by a newly developed enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the P8 peptide as capture in samples of synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA). This research won the 2012 Award of the Cuban National Academy of Sciences.

La interleucina-15 (IL-15) es una citocina proinflamatoria que se expresa en varias enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Se identificó la secuencia 36-45 KVTAMKCFLL de la IL-15 humana, reconocida por la proteína de fusión hIL-15Ra-Fc soluble. Esta secuencia, sintetizada como un péptido de 10 aminoácidos, se une a la IL-15Ray bloquea la actividad biológica de la IL-15 en dos líneas celulares dependientes de IL-15. Mediante la estrategia de barrido de Ala, se detectó un péptido más activo por sustitución de la segunda lisina de la secuencia del péptido por el aminoácido polar, no cargado, treonina. Usando el péptido P8 en el paso de captura de un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), recientemente desarrollado, se cuantificó IL-15Ra soluble en fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (AR) u osteoartritis (OA). Este trabajo mereció el Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba, en el año 2012.

Synthetic peptides that reproduce the N-terminus of sticholysins as models for the study of their structure-function relationship

The Caribbean Sea anemone Stichodactyla helianthus produces two pore-forming proteins, sticholysins I and II (StI and StII). To clarify the contribution of the first thirty (StII) or thirty-one (StI) N-terminal amino acid residues to the activity of the toxins, four peptides spanning residues 1-31 of StI (StI1-31, StI12-31) and 1-30 of StII (StII1-30, StII11-30) were synthesized. StII1-30 was the most active peptide, followed by StI1-31 and the shortest ones. The difference between the hemolytic activities of the largest peptides qualitatively reproduces that found between the respective toxins StI and StII. The results suggest the importance of continuity of the 1-10 hydrophobic amino acid sequence in StII1-30 for displaying higher membrane binding and activity. Thus, the different peptide membranotropic action is explained in terms of the differences in their hydrophobic and electrostatic properties. Furthermore, we also demonstrated that StII1-30 forms pores of similar radius to that of the protein (around 1 nm), with its N-terminus oriented towards the hydrophobic core of the bilayer while the rest of the peptide is more exposed to the aqueous environment, as hypothesized for sticholysins. Altogether these results demonstrate that synthetic peptides that reproduce sticholysins' N-terminus are not only a good model of these toxins structure and function but, and due to its reduced molecular size, could also be useful biotechnological tools instead of their larger parental proteins. This research won the 2012 Award of the Cuban National Academy of Sciences.

La anémona del mar Caribe Stichodactyla helianthus produce dos proteínas formadoras de poros: las sticholysinas I y II (StI y StII). Para dilucidar la contribución de sus primeros 30 (StII) o 31 (StI) aminoácidos del extremo N-terminal a la actividad formadora de poros, se sintetizaron cuatro péptidos que abarcaron los residuos 1 al 31 de StI (StI1-31, StI12-31) y 1 al 30 de StII (StII1-30, StII11-30). StII1-30 fue el más activo, seguido por StI1-31. La diferencia entre las actividades hemolíticas de los péptidos largos reproduce cualitativamente la hallada entre las respectivas toxinas StI y StII. Los resultados sugieren la importancia de la continuidad de la secuencia hidrofóbica 1-10 en el péptido StII1-30 para su capacidad de unión a membranas y su actividad. La actividad membranotrópica diferencial de los péptidos se explica por las diferencias en sus propiedades hidrofóbicas y electrostáticas. Además se demostró que StII1-30 forma poros con un radio similar a los de la proteína (aproximadamente 1 nm), con su extremo N-terminal hacia el núcleo hidrofóbico de la bicapa lipídica, mientras que el resto está más expuesto hacia el microambiente acuoso, tal como se ha supuesto postulado para las sticholysinas. Ello demuestra que los péptidos sintéticos que reproducen el segmento N-terminal de las sticholysinas son un modelo de la estructura y función de estas toxinas, y herramientas biotecnológicas útiles, sobre la base de su reducido tamaño molecular, a diferencia de sus proteínas nativas de mayor tamaño. Este trabajo mereció el Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba, 2012.

Biological activity in vitro and in vivo of an in silico designed secretagogue peptide to be used in fish

In teleost fish, secretion of the growth hormone (GH) is regulated by several hypothalamic factors that are influenced by the physiological state of the animal. GH in fish is involved in many physiological processes that are not overtly growth-related such as: saltwater osmoregulation, antifreeze protein synthesis, and the regulation of sexual maturation and immune functions. This study was conducted to characterize a decapeptide A233 (GKFDLSPEHQ) designed by molecular modeling to evaluate its function as a GH secretagogue (GHS). In pituitary cell culture, the peptide A233 induces GH secretion and it is also able to increase superoxide production in tilapia head-kidney leukocyte cultures. This effect is blocked by preincubation with the GHS receptor antagonist [D-Lys3]-GHRP6. Immunoneutralization of GH by addition of anti-tilapia GH monoclonal antibody blocked the stimulatory effect of A233 on superoxide production. These experiments suggest a GH-mediated mechanism for the action of A233. The in vivo biological action of the decapeptide was also demonstrated for growth stimulation in goldfish and tilapia larvae (p < 0.001). Superoxide dismutase levels, antiprotease activity, and lectin titer were enhanced in tilapia larvae treated with this novel molecule. The decapeptide A233 is able to function as GHS in teleosts and enhance parameters of the innate immune system in the fish larvae. This study won the Annual Award of the Academy of Sciences of Cuba in 2012.

La secreción de la hormona de crecimiento (HC) en peces teleósteos es regulada por varios factores hipotalámicos que dependen de su estado fisiológico. Ella interviene en procesos fisiológicos asociados indirectamente con el crecimiento de estos animales, como la osmorregulación de agua salada, la síntesis de proteínas anticongelantes, y la regulación de la maduración sexual y de las funciones inmunológicas. En este estudio se caracterizó un decapéptido denominado A233 (GKFDLSPEHQ), diseñado por modelación molecular, y se evaluaron sus efectos como secretagogo de la HC (SHC). En cultivos de células pituitarias, este péptido indujo la secreción de la HC e incrementó la producción de superóxido dismutasa en cultivos de leucocitos de la cabeza del riñón: efecto bloqueado al preincubar las células con el antagonista de SHC [D-Lys3]-GHRP6. La inmunoneutralización de la HC por la adición de un anticuerpo anti-HC de tilapia bloqueó la producción de superóxido dismutasa estimulada por el péptido A233. Ello sugiere que la acción de este péptido está mediada por la HC. También se demostró su actividad biológica in vivo, mediante la estimulación del crecimiento en larvas de goldfish y de tilapia (p < 0.001). Los niveles de superóxido dismutasa, de actividad antiproteasa y los títulos de lectina aumentaron en larvas de tilapia tratadas con esta molécula. El decapéptido A233 funciona como SHC en peces teleósteos, y potencia los parámetros de la respuesta inmune innata en sus larvas. Este trabajo mereció el Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba, en el año 2012.