Biotecnología Aplicada

MicroRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer

Malignant tumors rank as the first cause of death mortality and potentially lost years of life in Cuba and many other countries where millions of people die each year because of cancer. Therefore, the diagnosis and treatment of cancer is a health issue worldwide. Malignant tumors are traditionally classified and treated according to clinical and pathological variables which are currently insufficient to reflect each patient’s molecular features. Consequently, there is a need to find new individual biomarkers and therapeutic targets that could complement current clinical-pathological variables and become a guide for diagnosis, prognosis and treatment. Advances in understanding the biology of cancer as well as the development of more powerful gene analysis tools create new clinical perspectives to find such biomarkers and targets. MicroRNAs (miRNAs) belong to a class of non-coding RNA with post-transcription regulation of gene expression. Their expression is aberrant in cancer where they could function either as oncogenes or tumor suppressors, being used as diagnostic, prognostic or predictive biomarkers and therapeutic targets. Since, research on miRNA is a key issue for oncologists and researchers, in this review we provide a description of their biogenesis, mechanism of action and recent findings, supporting their use in cancer, either as biomarkers or therapeutic targets.

Los tumores malignos son la primera causa de muerte temprana de millones de personas en Cuba y otros países, por lo que el diagnóstico y tratamiento del cáncer es un problema de salud mundial. Tradicionalmente, estos tumores se clasifican y tratan según variables clínico-patológicas un tanto imprecisas todavía, pues no reflejan las particularidades moleculares de cada paciente. En este sentido, es preciso encontrar otros biomarcadores individuales y blancos terapéuticos que complementen esas variables y guíen el diagnóstico de los pacientes, su pronóstico y tratamiento. Los avances en el conocimiento de la biología del cáncer y el desarrollo de herramientas para los análisis genómicos, constituyen perspectivas clínicas para el descubrimiento de estos biomarcadores. Los microARN (miARN) son un tipo de ARN no codificante que provocan la regulación postranscripcional de la expresión génica. Su expresión en el cáncer está alterada, y podrían funcionar como oncogenes o supresores de tumores, por lo que se utilizan como biomarcadores diagnósticos, pronósticos, predictivos y blancos terapéuticos. Teniendo en cuenta la importancia de este tema para oncólogos e investigadores, se describen la biogénesis de los miARN, su mecanismo de acción y los avances en el estudio como biomarcadores o dianas terapéuticas en el cáncer.

Dipeptidyl peptidase IV and its implication in cancer

Dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV, EC 3.4.14.5), also known as CD26, is a serine aminopeptidase that preferentially cleaves Xaa-Pro or Xaa-Ala dipeptides from the N-terminus of oligopeptides and processes regulatory peptides in vivo, leading to their biological activation or inactivation. The enzyme is a homodimer and each subunit is formed by a aß-hydrolase domain and a ß-propeller domain, involved in the enzymatic activity and its interaction with other proteins. It has an important role in multiple physiological functions, including the regulation of glucose metabolism being one of the current targets for the treatment of type II diabetes mellitus. This enzyme also regulates immune system responses mediated by CD4+ T lymphocytes, and recently has been identified a high/low DPP-IV activity regarding physiological levels, in pathologies like thyroid, ovarian, lung, skin, prostate cancers and central nervous system tumors. For these reasons, this enzyme evolves as a new target of attention for the development of more efficient diagnostics being considering as molecular markers for some pathologies and a target for the development of new therapeutic assessments in cancer. Current research interests are focused on depth in the structure-function relation for this enzyme, as a key point for the development of new therapies in pathologies involving DPP-IV activity or its interaction with other proteins.

La dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV, EC 3.4.14.5), también conocida como CD26, es una aminopeptidasa de tipo serino con preferencia de corte por la secuencia Xaa-Pro o Xaa-Ala, presente en el extremo amino de los oligopéptidos, que procesa péptidos regulatorios in vivo, y provoca su activación e inactivación. Es un homodímero y cada subunidad consiste en dos dominios: aß-hidrolasa y propela-ß, implicados en su función enzimática y su interacción con otras proteínas. Esta enzima interviene en varios procesos fisiológicos relacionados con el metabolismo de la glucosa, por lo que es uno de los blancos para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2. Además regula la respuesta inmune mediada por linfocitos CD4+, y recientemente se identificó una alteración de su actividad (elevada o muy baja), en relación con sus niveles fisiológicos normales, en varios tipos de cáncer: de tiroides, ovario, pulmón, piel, próstata, tumores del sistema nervioso central, entre otros. Por tales razones y por considerarse un potencial marcador molecular de varias enfermedades, constituye un foco de atención para el diagnóstico del cáncer y el desarrollo de terapias para combatirlo. Muchos son los estudios encaminados a una mayor comprensión de su relación estructura-función como base para el diseño de tratamientos a aquellas enfermedades en cuyo mecanismo molecular interviene la DPP-IV o interactúa con otras proteínas.

Production of a liquid Bradyrhizobium japonicum inoculant with high impact on the mechanized sowing of soybean in Cuba

Symbiotic nitrogen fixation is critical for high soybean (Glycine max L. Merril) yields with protection to the environment. This paper describes a procedure for massive production of Bradyrhizobium japonicum in an orbital multi-platform shaker and the use of the bacterial culture for seed inoculation in soybean areas under mechanized sowing. The B. japonicum strain was selected based on its highly efficient symbiotic interaction with major soybean varieties cropped in Cuba. Optimization of the growth medium and the use of serial and scaled inoculations allowed maintaining the cultures in continuous logarithmic phase while increasing its volume 100-fold in 7 days. The final culture having average cell viability of 5 × 1010 c.f.u./mL and high exopolysaccharides content does not require additives and can be stably stored for at least 8 months at 4 ºC. Soybean seeds were sprayed with the inoculant at equivalent dose of 150 mL/ha and sowed mechanically in production fields of Ciego de Avila province during the campaigns 2010-2013. The plants showed abundant nodulation and a proper nutritional state during the whole cycle. The bacterium strain was reisolated from root nodules of inoculated plants and its identity was confirmed by phenotype characterization. The high-cell density liquid inoculant rich in polysaccharides produced in this work is compatible with mechanized seed sowing, favors the bacterium survival in soil, and promotes the establishment of an efficient symbiotic interaction with the host plant.

La fijación simbiótica del nitrógeno es un proceso clave en la obtención de altos rendimientos en el cultivo de la soya (Glycine max L. Merril) con protección del medio ambiente. Se describe una metodología para la producción masiva de una cepa de Bradyrhizobium japonicum de alta eficiencia simbiótica, en una zaranda orbital de plataformas múltiples, y el empleo del cultivo bacteriano como bioinoculante para variedades de soya bajo condiciones de siembra mecanizada en Cuba. La optimización del medio de crecimiento y el establecimiento de un sistema de inoculaciones seriadas y escaladas permitieron mantener el cultivo en continua fase logarítmica e incrementar su volumen 100 veces en 7 días. El cultivo final con viabilidad promedio de 5 × 1010 u.f.c./mL y alto contenido de exopolisacáridos no requiere aditivos y se mantiene estable en conservación a 4 ºC durante al menos 8 meses. La aplicación del inoculante a las semillas fue a dosis equivalente de 150 mL/ha durante las campañas de 2010-2013 en la empresa Cubasoy, de la provincia Ciego de Ávila. Las plantas de campo inoculadas mostraron nodulación abundante en la zona del cuello de la raíz y mantuvieron un estado nutricional adecuado durante todo el ciclo vegetal. La bacteria reaislada de nódulos de raíces en plantaciones al azar mostró el mismo fenotipo de la cepa inoculada, lo que confirma la efectividad de la inoculación. El inoculante líquido obtenido es técnicamente compatible con el empleo de las máquinas sembradoras, favorece la supervivencia de la bacteria en el suelo y su simbiosis eficiente con la planta hospedera.

In vitro modeling of the environmental performance of attenuated strains of Vibrio cholerae O139

Vibrio cholerae, serogroups O1 and O139, is the causative agent of cholera diarrheal disease. Much of the research aimed to develop oral cholera vaccines is directed to the production of live attenuated strains, such as the V. cholerae O139 TLP01 and TLP05 strains. These two strains lack CTXfprophage genes and do not produce the hemagglutinin protease, a relevant pathogenesis factor, and the mannose-sensitive hemagglutinin fimbria, which could play an important role in the environmental behavior. In this work, different in vitro models were used to study the potential environmental performance of these two strains. Their ability to produce different types of biofilms, to acquire rugose phenotype and to resist different environmental stress conditions such as the presence of chlorine, detergents or high salt concentrations, were assessed. Significantly, the TLP01 and TLP05 strains displayed characteristics that limit their in vitro survival under different stress conditions, with respect to controls and wild-type strains. Such behavior under harsh environmental settings may limit their survival and act for their containment while using them as active ingredients for the development of a cholera vaccine candidate.

El cólera es una enfermedad diarreica producida por la infección con la bacteria Vibrio cholerae de los serogrupos O1 y O139. Muchas de las investigaciones para el desarrollo de vacunas orales contra esta enfermedad se dedican a la producción de cepas vivas atenuadas. TLP01 y TLP05 son cepas atenuadas del serogrupo O139, que carecen de los genes del profago CTXf; además, no producen la hemaglutinina proteasa, importante factor de la patogénesis; ni la fimbria hemaglutinina sensible a manosa, la cual pudiera ser importante en el comportamiento de las cepas vacunales en el ambiente. En este artículo se describe el posible comportamiento ambiental de estas cepas, a partir del estudio in vitro de sus propiedades para producir varios tipos de biopelículas, de adquirir el fenotipo rugoso y de resistir varias condiciones de estrés ambiental, como la presencia de hipoclorito de sodio, de detergentes o altas concentraciones salinas. Los resultados evidencian que las cepas TLP01 y TLP05 poseen características que limitan su supervivencia in vitro frente a distintas condiciones de estrés, con respecto a cepas controles y salvajes. En el entorno ambiental, estas características pudieran limitar su supervivencia y actuar como elementos de contención del agente biológico que se use como ingrediente farmacéutico activo del candidato vacunal.

DNA damage and repair capacity in patients with neurofibromatosis type 1

Neurofibromatosis type 1 (NF1) is an autosomal dominant disorder which displays considerable inter- and intra-familial variability in phenotypic expression. NF1 is characterized particularly by café-au-lait spots and fibromatous tumors of the skin. In this study, the comet assay was used to evaluate levels of basal single strand breaks, H2O2 oxidation-induced DNA damage, and repair capacity in lymphocytes of NF1 patients compared to healthy control subjects. No significant differences in DNA damage were observed between controls and patients (p > 0.05), but DNA repair capacity was significantly slower in NF1 patients (p < 0.05). It suggests less efficient DNA repair capacity may be associated with NF1 disease. Using this assay we could identify individuals with poor repair capacity who would be good candidates for intensive follow-up and screening.

La neurofibromatosis tipo 1 (NF1) es una enfermedad autosómica dominante que muestra una gran variabilidad inter e intrafamiliar en la expresión fenotípica. Se caracteriza sobre todo por manchas de color café con leche y tumores fibromatosos de la piel. En este estudio, se utilizó el ensayo de cometa para evaluar los niveles basales de roturas de simple cadena, la oxidación inducida por H2O2 en el ADN, y la capacidad de reparación en los linfocitos de los pacientes con NF1 en comparación con sujetos sanos. No se observaron diferencias significativas en el daño de ADN entre los controles y los pacientes (p > 0.05), pero la capacidad de reparación del ADN fue significativamente más lenta en los pacientes con NF1 (p < 0.05). Esto sugiere que la capacidad de reparación del ADN menos eficiente puede estar asociada con el desarrollo y evolución de la enfermedad. Con la utilización de este ensayo podríamos identificar a los individuos con la capacidad de reparación disminuida, los cuales serían buenos candidatos para un seguimiento intensivo.

Determination of HIV-1 viral load on dried blood spot specimens

Dried blood spot specimens on filter paper were evaluated to determine the viral load of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), through the Cobas(r)Ampliprep/Cobas(r)Taqman(r) HIV-1 test. RNA levels were quantified in pairs of plasma and dry blood spot specimens on filter paper from persons infected with HIV-1. The Pearson linear correlation coefficient was calculated as well as the agreement by the Bland-Altman method. Studies on precision, linearity and analytical sensitivity of the assay were also carried out. The linear regression model was used to predict the value of the viral load in the plasma. There was a high correlation in viral load measurements in the plasma and dried blood spot specimens, in 39 out of the 43 sample pairs studied (r = 0.964, p < 0.0001). Detection rate was 90.7 % and the test behaved linearly between 134 and 420 000 copies/mL of viral RNA, showing good precision. No statistically significant differences were observed between the means of the true and predicted values of viral load in the plasma, with a 95 % confidence level. These results support the use of dried blood spots on filter paper for viral load determination with the Cobas(r)Ampliprep/Cobas(r)Taqman(r) HIV-1 Test. Authors recommend the validation of the model proposed with a larger number of samples.

Para la determinación de la carga viral del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1), se evaluaron muestras de sangre seca en papel de filtro, mediante la prueba Cobas(r)Ampliprep/Cobas(r)Taqman(r) HIV-1. Se cuantificó el ARN en pares de muestras plasma-sangre seca en papel de filtro, provenientes de personas infectadas con el HIV-1. Se calculó el coeficiente de correlación lineal de Pearson y la concordancia mediante el método de Bland y Altman. Se estudiaron la precisión y la linealidad, y se determinó la sensibilidad analítica del ensayo. El modelo producto de la regresión lineal se utilizó para pronosticar el valor de la carga viral en el plasma. Hubo una elevada correlación entre las mediciones de la carga viral en el plasma y la sangre seca en papel de filtro, en 39 de los 43 pares de muestras estudiados (r = 0.964, p < 0.0001). La tasa de detección fue del 90.7 %. Se apreció un comportamiento lineal entre 134 y 420 000 copies/mL de ARN viral, con precisión satisfactoria. Se demostró que no existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias de los valores de carga viral pronosticados y reales en el plasma, mediante un nivel de confianza del 95 %. Tales resultados apoyan el empleo de muestras de sangre seca en papel de filtro, para la determinación de la carga viral del HIV, mediante la prueba Cobas(r)Ampliprep/Cobas(r) Taqman(r) HIV-1. Se recomienda validar el modelo propuesto con un número más amplio de muestras.

Nimotuzumab, effective immunotherapy for the treatment of malignant epithelial tumors

Nimotuzumab, a humanized monoclonal antibody, is a novel drug against the epidermal growth factor receptor, which is a protein that is highly expressed in malignant tumors of epithelial origin. This paper presents its physicochemical and pharmaceutical characteristics, the results of pre-clinical and clinical research, and the international regulations for the diseases for which its use has been indicated: in advanced head and neck tumors, malignant brain tumors in adults and children, and advanced esophagus tumors. Its safety profile, efficacy and effectiveness studied before and after its regulatory approval are also described. Finally, recommendations are given for its dosage according to clinical evidence, for the appropriate therapeutic use of this medication.

Nimotuzumab, anticuerpo monoclonal humanizado, es un novedoso fármaco contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico: proteína altamente expresada en tumores malignos de origen epitelial. En este artículo se exponen sus características físico-químicas y farmacéuticas, los resultados de investigaciones preclínicas y clínicas, y las regulaciones internacionales para las enfermedades en las que se ha indicado su uso: en tumores avanzados de cabeza y cuello, tumores cerebrales malignos en adultos y niños, y tumores avanzados de esófago. Se describen su perfil de seguridad, eficacia y efectividad, antes y después de su aprobación. Por último se ofrecen recomendaciones posológicas según las evidencias clínicas, para el uso terapéutico adecuado de este medicamento.

Characterization of the vegetal growth promoting capacity of Tsukamurella paurometabola C-924 and the main mechanisms involved

The Tsukamurella paurometabola C-924 strain, previously isolated from banana rhizosphere as antagonist of phytoparasitic nematodes, was shown to display other beneficial effects in plants. This work was aimed at determining its growth-promoting activity, and characterizing the main mechanism involved in this process. It was confirmed that T. paurometabola C-924 displays growth-promoting activity in plants through various mechanisms. Therefore, under the tested conditions, T. paurometabola C-924 was able to release indoleacetic acid, solubilize phosphate, produce ammonia from organic matter and release lytic exoenzymes, which may protect plants during the attack of phytopathogens. Its compatibility with other soil microorganisms used as biofertilizers (Rhizobium leguminosarum, Pseudomonas fluorescens and Azotobacter chrococcum) was also tested, favoring the colonization process of mycorrhizogen fungi and stimulating the formation of arbuscular mycorrhizae. It was further determined that T. paurometabola C-924 stimulates the development of economically relevant crops, such as: beans, corn, banana and lettuce, by increasing height, structuring of the radicular system, foliage and dry weight. This was the very first report ever on the growth promoting activity of T. paurometabola, and also in the Tsukamurella genera, describing the processes involved. That strain bears potentialities for application as biofertilizer in different agricultural systems. This research granted the 2013 Award of the Cuban National Academy of Sciences.

La cepa Tsukamurella paurometabola C-924 aislada a partir de rizosfera de plátano como antagonista de nematodos fitoparásitos; en experimentos previos se observó que además de su actividad nematicida ejercía otros efectos sobre las plantas. El objetivo del trabajo fue determinar la capacidad promotora del crecimiento vegetal de T. paurometabola C-924 y caracterizar los principales mecanismos involucrados en el proceso. Se confirmó que la cepa posee actividad estimuladora sobre los cultivos a través de diferentes mecanismos de acción. Bajo las condiciones ensayadas produce ácido indolacético, es capaz de solubilizar fosfatos y produce amoniaco a partir de materia orgánica. Se comprobó que produce exoenzimas líticas que pueden proteger las plantas contra el ataque de patógenos. Se estudió su compatibilidad con otros microorganismos del suelo empleados como biofertilizantes (Rhizobium leguminosarum, Pseudomonas fluorescens y Azotobacter chrococcum) y se observó que favorece el proceso de colonización de hongos micorrizógenos, estimulando la formación de micorrizas arbusculares. Se determinó además que estimula el desarrollo de cultivos de interés económico como: frijol, maíz, plátano y lechuga. Se logró con su aplicación plantas de mayor altura, mayor desarrollo del sistema radical, mayor follaje y peso seco. Este trabajo informó por primera vez para la ciencia la actividad promotora del crecimiento vegetal para la especie T. paurometabola y los mecanismos involucrados en este proceso. T. paurometabola C-924 tiene potencialidades para su empleo como biofertilizante en diferentes sistemas agrícolas. Este trabajo mereció el Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba para el año 2013.

Keystone Symposia "Advancing vaccines in the genomics era", Rio de Janeiro, Brazil, October 31-November 4, 2013

The Keystone Symposia "Advancing vaccines in the genomic era" was held in the Convention Center of the Windsor Hotel, Rio de Janeiro, Brazil, from October 31 to November 4. It was part of the Keystone Global Symposia series sponsored by Bill and Melinda Gates Fundation. Two-hundred and twenty delegates and more than a hundred of others participants around the world attended. The event was subdivided into 10 workshops covering 68 lectures and 120 posters on the latest results for vaccine design, development and testing, most of them with examples of the application of the Systems Biology approach with new technologies and an integral focus. The high quality of debates and researchers meetings brought about the general concerns on the main infectious diseases. They also provided an extraordinary opportunity to exchange about new ideas and to establish collaboration programs.

El Simposio Keystone "Avances en vacunas en la era de la genómica" se celebró en el Centro de Convenciones del hotel Windsor, como parte de los simposios auspiciados por la Fundación Bill y Melinda Gates. A las conferencias y sesiones de carteles asistieron 220 delegados y más de un centenar de otros participantes de varios países. El evento comprendió 10 talleres, en los que se ofrecieron 68 conferencias y expusieron 120 carteles sobre los últimos resultados en el campo de investigación de las vacunas. La mayoría de ellos con ejemplos de aplicación de la biología de sistemas, de nuevas tecnologías y enfoques más integrales. La alta calidad de los debates y de los contactos entre los investigadores demostró la preocupación general sobre las principales enfermedades infecciosas. También significó una extraordinaria oportunidad para el intercambio de nuevas ideas y el establecimiento de programas de colaboración.