Biotecnología Aplicada

Pharmacological applications and in vitro biotechnological production of anticancer alkaloids of Catharanthus roseus

Catharanthus roseus (periwinkle) is a plant of the Apocynaceae family. This plant synthesizes two indole terpene alkaloids: vinblastine and vincristine, used against cancer. C. roseus is endemic to Madagascar and is known as vicaria in Cuba; in Mexico, it is found in Veracruz, Tabasco, Quintana Roo and Yucatan. C. roseus is of considerable interest for in vivo or in vitro studies, and from which over 130 alkaloids of the indole terpene group have been isolated. The total alkaloid content in roots is 2-3 %, 9 % in the fibers, the leaves contain 1 % alkaloids, the stem, fruit, seeds, and pericarp containing 0.48, 0.40, 0.18 and 1.14 %, respectively. About 500 kg of dried leaves are used to isolate 1 g of vinblastine and two tons of macerated leaves provide 1 g of the active principle required for the treatment of a child with leukemia for 6 weeks. Semi-synthesis and organic synthesis are costly and low yielding, so alternatives have been used to enhance biotechnological production by adding inducers to stimulate the production of metabolites in the biosynthetic pathway. Therefore, the objectives of this paper are: to mention the biological mechanism of action, biological activity, biosynthetic pathway of the vinblastine and vincristine alkaloids, report on the production of alkaloids from in vitro callus cultures and cells in suspension. Finally, the methods for the quantification of terpene indole alkaloids are highlighted.

Aplicaciones farmacológicas y producción biotecnológica in vitro de los alcaloides anticancerígenos de Catharanthus roseus. Catharanthus roseus es una planta que pertenece a la familia Apocynaceae. Esta planta sintetiza dos alcaloides indol-terpénicos cuyo uso es relevante para el tratamiento contra el cáncer: vinblastina y vincristina. C. roseus es endémica de Madagascar y se conoce como vicaria en Cuba; en México, se distribuye en Veracruz, Tabasco, Quintana Roo y Yucatán. Es de gran interés para estudios in vivo o in vitro, y de ella se han aislado más de 130 alcaloides del grupo indol-terpénico. Su contenido total de alcaloides en raíces es de 2-3 % (9 % en sus fibras), las hojas contienen 1 % de alcaloides, el tallo, fruto, semillas, pericarpio contiene 0.48; 0.40; 0.18 y 1.14 %, respectivamente. Se utilizan cerca de 500 kg de hojas secas para aislar 1 g de vinblastina y dos toneladas de hojas maceradas proporcionan 1 g del principio activo, cantidad requerida para el tratamiento de un niño con leucemia durante 6 semanas. La semisíntesis y la síntesis orgánica son costosas y de baja producción, por lo que se han utilizado alternativas biotecnológicas para incrementar la producción mediante la adición de inductores que estimulan la producción de los metabolitos en su ruta de biosíntesis. En este trabajo se abordan el mecanismo de acción y las actividades biológicas de esta planta, la ruta de biosíntesis de los alcaloides vinblastina y vincristina, y la producción de alcaloides a partir de cultivos in vitro de callos y células en suspensión. Finalmente, se destacan los métodos de cuantificación de los alcaloides indol-terpénicos.

Therapeutic vaccines against the hepatitis C virus in the age of direct-acting antivirals

Hepatitis C is a significant health problem worldwide, with incidence estimates around 160 million people and 500 000 annual deaths. The limited success of treatments in chronic genotype 1 hepatitis C virus (HCV) patients and the numerous and significant adverse effects of the therapeutic treatment with pegilated interferon and ribavirin have encouraged the development of different direct-acting antivirals (DAAs) with promising results. This was also stimulated by advances of the knowledge on virus cell cycle and the properties of its structural properties. However, DAAs are very expensive and some of those compounds have developed multiple adverse events, all these limiting their use in certain infected populations. Moreover, its use does not prevent from HCV reinfections. Hence, new treatments, such as therapeutic vaccines, have arisen as additional or combined therapies against chronic HCV infection.

La hepatitis C constituye un problema de salud mundial, con estimados de más de 160 millones de personas infectadas. Esta enfermedad es responsable de alrededor de 500 000 muertes anuales. El éxito limitado del tratamiento en pacientes infectados con el virus de la hepatitis C (VHC), genotipo 1, así como los numerosos e importantes efectos adversos de la terapia con interferón pegilado más ribavirina, unido a los avances en el conocimiento del ciclo de vida y de las características de las proteínas estructurales del virus, han estimulado el desarrollo de diferentes antivirales de acción directa (AAD), muy prometedores en sus efectos terapéuticos. Sin embargo, estos nuevos productos son extremadamente costosos y además algunos de ellos han presentado múltiples eventos adversos, lo que limita su empleo en determinadas poblaciones de individuos infectados, y no evitan la reinfección con el VHC. Por lo que se necesitan tratamientos con vacunas terapéuticas como un tratamiento adicional o alternativo para las infecciones crónicas por el VHC.

Evaluation in vitro of the cytotoxicity and genotoxicity of silica nanoparticle aggregates synthesized by the sol-gel method

Amorphous silica nanoparticles (NPs) has become attractive for biomedical applications. In the present study, the toxicity of different concentrations of amorphous silica NPs of 27 nm was evaluated, such NPs synthesized by the sol-gel method assisted by reverse micelle microemulsion. Characterization of nanoparticles was done using Scanning Electron Microscopy (SEM), Transmission Electron Microscopy (TEM) and Dynamic Light Scattering (DLS). Cytotoxicity was assessed in CHO-K1 and Cal27 cell cultures by the reduction bromide 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazol (MTT) test. Cellular viability and density tests were assessed in CHO-K1 cells with Trypan Blue, while genotoxicity was evaluated in the CHO-K1 cell line and in primary cultures of human lymphocytes using the Comet assay. Results showed that silica NPs produced cytotoxicity in both cell models in a dose dependent manner (12.5 µg/mL or higher), while genotoxicity was observed in CHO-K1 cells at all the concentrations tested (1.5625-12.5 µg/mL), but not in the primary cultures of human lymphocytes. The variability of the toxic effects of amorphous silica NPs, as dependent on NPs concentration and the cell line tested, among others, indicates that their applications could be determined by their use at non-toxic doses or through functionalization by chemical modifications to reduce their toxicity. These parameters, together with their unique chemical and physical properties could make NPs a feasible option for biomedical applications.

Las nanopartículas (NP) amorfas de sílice son atractivas para aplicaciones futuras en la biomedicina. En este estudio, se evaluó la toxicidad de diferentes concentraciones de agregados de NP amorfas de sílice de 27 nm, sintetizadas mediante el método sol-gel asistido por microemulsión de micelas inversas. Estas NP se caracterizaron mediante Microscopía Electrónica de Barrido, Microscopía Electrónica de Transmisión y Dispersión Dinámica de Luz. La citotoxicidad se evaluó en células CHO-K1 y Cal27 en cultivo mediante el test de reducción de Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) y en CHO-K1 se hicieron pruebas Viabilidad y Densidad Celular con Azul de Tripano. La genotoxicidad se evaluó en la línea celular CHO-K1 y en cultivos primarios de linfocitos humanos usando el Ensayo Cometa. Las NP indujeron citoxicidad dependiente de la dosis en ambos modelos celulares, a concentraciones iguales o superiores a 12.5 µg/mL, mientras que se observó genotoxicidad en las células CHO-K1 a todas las concentraciones evaluadas (1.5625-12.5 µg/mL), pero no en los cultivos primarios de linfocitos humanos. La variabilidad de los efectos citotóxicos de las NP amorfas de sílice en función de la concentración y línea celular, entre otros, indican que su posible uso puede estar condicionado por el empleo a dosis no tóxicas, o a su disminución mediante la funcionalización de las NP mediante modificaciones químicas que disminuyan su toxicidad. Tales estrategias, unidas a sus características químicas y físicas exclusivas, las convierten en una opción a considerar para diversas aplicaciones en la biomedicina.

Design of the purification process by metal-chelate affinity chromatography of a new vaccine antigen for the control of sea lice

The present work aims at designing the purification process of protein MY32/Ls to obtain the active pharmaceutical ingredient (API) against sea lice, marine pathogen that significantly affects the salmon industry in South America and Europe. A compact purification process was designed, based on the analysis of alternatives to establish the steps of rupture, chromatography and renaturation. Due to technical-economic advantages, a chemical rupture process was established using 8 mol/L urea for 1 hour, which was 20 % cheaper than mechanical rupture with glass beads. For washing and elution of the protein in the chromatographic step, pH and imidazole were evaluated. Imidazole was selected for the technical-economic advantages it offered; the costs of the selected variant were 12.33 % lower than washing and elution by pH. In scaling the chromatographic step, an economic variant was assessed with modifications of the urea concentration in washing and elution, lowering the costs of the step 3.4 %, which was moreover attractive for its impact on reducing volumes to be handled in the renaturation step. Tween 80 was selected in the renaturing step, which allowed obtaining the protein in solution. The obtained API induced higher antibody titers in C57Bl/6 mice than the laboratory standard used (three times more on average). The API specifications satisfy the requirements for the formulation of the new vaccine against sea lice.

Este trabajo tuvo como objetivo el diseño de un proceso de purificación de la proteína MY32/Ls para obtener el Ingrediente Farmacéutico Activo (IFA) contra el piojo de mar, patógeno marino que afecta considerablemente la industria salmonera de Suramérica y Europa. El proceso se diseñó compacto, basado en el análisis de alternativas para establecer las etapas de ruptura, cromatografía y renaturalización. Por sus ventajas técnico-económicas previstas, se estableció un proceso de ruptura química con urea 8 mol/L durante 1 hora, con un 20 % de ahorro respecto a la ruptura mecánica con perlas de vidrio. Para el lavado y la elución de la proteína se evaluó el pH y el imidazol en la etapa cromatográfica. Se escogió el imidazol por las ventajas técnico-económicas brindadas, con costos de la variante seleccionada inferiores en un 12.33 % a los del lavado y elución por cambios de pH. En el escalado de la etapa cromatográfica se evaluó una variante económica con modificaciones en la concentración de urea en el lavado y elución, con costos reducidos en un 3.4 %, más atractiva por el manejo de volúmenes menores en la etapa de renaturalización. En esta última se seleccionó el Tween 80, lo cual posibilitó obtener la proteína en solución. El IFA obtenido indujo títulos de anticuerpos IgG en ratones C5Bl/6 mayores que los del patrón a escala de laboratorio, tres veces como promedio. Las especificaciones del IFA obtenido satisfacen los requerimientos para la formulación de una nueva vacuna contra el piojo de mar.

Design of the lyophilization process of a L-leucyl-L-alanine dipeptide formulation based on its thermal properties

The system for phenylketonuria diagnostic in newborns (UMTEST® PKU) is produced at the Center for Immunoassay (Havana, Cuba). L-leucyl-L-alanine is one of the kit components and requires lyophilization due to its limited aqueous solution stability. Results from Diffferential Thermal Analysis/Impedance (DTA/ Zsinφ) and lyomicroscopy determinations, identify that during the freezing step product temperature must be below –30 ºC, while throughout the primary drying process product temperature at sublimation front cannot exceed –18.9 ºC. The use of a procedure based on the critical variables determinations, allow the lyophilization of three industrial batches that finally fulfilled the quality specifications and achieve a reduction of 32 % in the cycle total time.

El sistema para la detección de la fenilcetonuria (UMTEST® PKU) en recién nacidos, se produce en el Centro de Inmunoensayo (CIE, La Habana, Cuba). La L-leucil-L-alanina, uno de los componentes del diagnosticador, requiere ser liofilizado debido a su limitada estabilidad en solución acuosa. La utilización de las técnicas de Análisis Térmico Diferencial/Impedancia (ATD/Zsinφ) y la liomicroscopía permitieron definir que en la liofilización de este reactivo, la congelación requiere ser realizada a temperaturas inferiores a –30 °C, mientras que en el secado primario la temperatura del frente de sublimación no puede sobrepasar el valor de temperatura de colapso (T C) de –18.9 ºC. La liofilización de tres lotes a escala industrial, ejecutada con el procedimiento diseñado según los resultados de las determinaciones previamente descritas, garantizó la obtención de un producto acorde a las especificaciones de calidad, con una reducción del 32 % en el tiempo total del ciclo.

Knowledge of the consumer from Murcia, Spain, on biotechnology and genetic engineering applied to food

Human beings always have distrusted from any innovation, especially in topics of food supply. The development of new technologies has contributed to innovation in the food industry. The aim of our study was to know the level of knowledge that the population in Murcia could have on biotechnology and genetic engineering applied to food production and his influence in the acceptance or rejection of these technologies. Results were confronted to other studies in different regions of Spain and Argentine. A quantitative methodology was followed, based on descriptive analyses and bivariable answers, in the Spanish region of Murcia. The results revealed a high level of awareness of the consumer on biotechnology and also a high perception of it as posing a risk for human health. The higher level of unawareness accounted for an increase in the level of distrust against both technologies for food production. This evidenced the need for educational programs able to orient the consumer on the benefits and potential risks of using biotechnology and genetic engineering for food production.

Los seres humanos siempre han desconfiado de cualquier novedad, sobre todo en temas de alimentación. El desarrollo de las nuevas tecnologías ha contribuido a la innovación de la industria alimentaria. Se condujo un estudio para conocer el nivel de conocimiento que tenía la población española sobre la biotecnología y la ingeniería genética aplicada a la producción de alimentos, y su influencia en la aceptación o rechazo de dichas tecnologías. Los resultados se confrontaron con los de otras regiones españolas y de Argentina. Se empleó una metodología cuantitativa, basada en el análisis descriptivo y de respuestas bivariables, para el estudio de la población de la región española de Murcia. Los resultados mostraron bajos niveles de conocimiento por parte de los consumidores sobre la biotecnología, así como una elevada percepción de riesgo para la salud debido al consumo de los productos derivados de la biotecnología. A menor conocimiento, mayores fueron los niveles de desconfianza respecto a ambas tecnologías aplicadas para la producción de alimentos. Esto evidenció la necesidad de programas educativos que orienten al consumidor sobre los beneficios y riesgos potenciales que tienen ambas tecnologías para los fines investigados.

Congress of the European Society of Medical Oncology, ESMO, in Madrid, Spain, September 26 to 30, 2014

The Congress of the European Society of Medical Oncology was celebrated on September 26 to 30, 2014, in the Fairground Institution of Madrid (IFEMA). In that meeting, the new scientific advances on cancer studies were pre-sented. Advances in clinical trials of several aggressive cancer types were presented, including the Cleopatra clinical trial phase III in HER2 positive breast cancer. Detailed practices, policies and financial aspects relevant for the advancement of the collaboration between clinical researchers and healthcare personnel were also discussed. The need to provide an optimal care to cancer patients was debated as well.

Del 26 al 30 de septiembre de 2014 se celebró el Congreso de la Sociedad Europea de Oncología Médica, ESMO 2014, en las instalaciones de la Institución Ferial de Madrid (IFEMA). Se presentaron las novedades y avances científicos en el estudio del cáncer, en particular los resultados de estudios clínicos en tipos de cáncer muy agresivos, entre ellos los del estudio clínico fase III Cleopatra en cáncer de mama positivo a HER2 positivo. También se expusieron detalladamente las cuestiones prácticas, políticas y financieras que dificultan la colaboración entre investigadores y personal de la salud. También se debatió sobre necesidad de una atención óptima a cada paciente de cáncer.