Biotecnología Aplicada

Tratamiento actual de la artritis reumatoide. Perspectivas para el desarrollo de las terapias antígeno-específicas

Rheumatoid arthritis is a degenerative disease characterized by chronic inflammation of peripheral joints. The first line of treatment involves the use of potent anti-inflammatory and immunosuppressive drugs, leading to an overall suppression of the immune system. However, these drugs do not induce sustained remission and their use can cause immunosuppression that leads to severe complications. Thus, there is a need for developing new therapeutic alternatives for the treatment of this disease. Antigen-specific therapies allow the elimination of pathogenic cells without affecting the immune system's ability to respond to infections. Within this approach heat stress proteins are promising candidates. Although progress has been made in the development of efficient antigen-specific therapies, the excellent results obtained in animal models have been difficult to translate to humans. The combined use of antigen-specific therapy with current drugs can be an attractive strategy in the near future to achieve the complete remission of the disease. Some of these combinations have already begun to be evaluated in animal models and in rheumatoid arthritis patients.

La artritis reumatoide es una enfermedad degenerativa caracterizada por la inflamación crónica de las articulaciones periféricas. La primera línea de tratamiento de esta enfermedad implica el uso de potentes antinflamatorios y drogas que provocan una supresión global del sistema inmune. Sin embargo, estos fármacos no inducen una remisión sostenida, y su uso puede causar una inmunosupresión importante que puede conducir a complicaciones. Por ello es necesario el desarrollo de nuevas modalidades terapéuticas para esta enfermedad. Las terapias antígeno-específicas suprimen las células patogénicas, sin afectar la propiedad del sistema inmune de responder ante las infecciones. Las proteínas de estrés térmico son candidatas promisorias en esta modalidad de tratamiento. Aunque se ha avanzado en el desarrollo de terapias antígeno-específicas eficientes en modelos animales con excelentes resultados, ha sido difícil trasladarlas a los seres humanos. El uso combinado de las terapias antígeno-específicas con los fármacos actuales puede ser una estrategia muy atractiva en el futuro cercano para lograr la remisión completa de la enfermedad. Algunas de estas combinaciones de tratamiento ya han comenzado a evaluarse en modelos animales y en pacientes con artritis reumatoide.

Efecto del factor de crecimiento epidérmico humano en la línea celular tumoral A431: análisis de la inhibición del crecimiento tumoral y la expresión génica in vivo

The historical tag of the epidermal growth factor (EGF) as carcinogenesis promoter has not been uniformly reproduced, since, in some experiments, malignant cells are bound to growth inhibition and apoptosis. The present study intends to obtain additional data on the interaction of EGF with cancer cells by analyzing its effect in vitro on the growth of cultured A431 cells, and in vivo on nude mice xenotransplanted with this cell line; identifying, in addition, the gene expression patterns for a selected group of genes related to EGF and cancer pathways in the solid tumor. EGF-treated animals showed significantly smaller tumor volumes than controls, suggesting cellular growth inhibition mediated by this factor. Similar results were obtained regarding the proliferation of cultured A431 when treated with 2.2, 33 and 165 nM of EGF. These results may imply a common mechanism for the EGF-mediated growth inhibition of A431 cells in both biological conditions (in vivo and in vitro). The action of EGF at nanomolar concentrations may trigger a transient recovery of the tumor suppressor ability of tumor cells through the reduction of the biological action of mutated TP53, cell cycle arrest due to a decrease in Cdk4 expression levels and the initiation of caspase through the activation of CASP9.

El carácter de promotor de la carcinogénesis atribuido al factor de crecimiento epidérmico (FCE) no se ha reproducido uniformemente, pues las células malignas tratadas con esta molécula en algunos experimentos han mostrado inhibición del crecimiento y apoptosis. Se ofrecen datos adicionales de la interacción del FCE con células cancerosas, mediante el análisis de su efecto en el crecimiento de la línea celular A431 in vitro y en ratones atímicos xenotrasplantados con esta línea. Se estudiaron además los patrones de expresión de un grupo de genes relacionados con el FCE y el cáncer en los tumores sólidos de A431. Este estudio reveló que los animales tratados con FCE humano recombinante (FCEhr) desarrollaron volúmenes tumorales inferiores que los animales controles. Ello sugiere una inhibición del crecimiento celular mediada por el FCE. Resultados similares se obtuvieron in vitro al tratar las células A431 con FCEhr a 2.2, 33 y 165 nM. A estas concentraciones, el FCE recobra la propiedad supresora tumoral en las células cancerosas, posiblemente por la reducción de la acción biológica de la TP53 mutada, la inhibición del ciclo celular al disminuir la expresión del gen cdk4, y la iniciación de la vía de las caspasas mediante la activación de la expresión del gen CASP9. Tales hallazgos sugieren mecanismos comunes de inhibición del crecimiento de las células A431 in vitro e in vivo, mediados por el FCE.

Generación de un modelo murino de encefalomielitis autoinmune experimental crónico progresivo para estudios de farmacología molecular en esclerosis múltiple

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), when induced in syngenic C57BL/6 mice by using myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), usually exhibits a chronic progressive pattern. This model mimics many of the symptoms and clinical signs typical of multiple sclerosis (MS) in humans. The present work describes specific adjustments to the experimental parameters described in the literature that were necessary when implementing this model under our conditions, demonstrating the presence of EAE in experimental animals by means of clinical evaluations, molecular assays and ultrastructural studies. The disorder was induced by active immunization with peptide MOG35-55 emulsified in Freund's Incomplete Adjuvant supplemented with Mycobacterium tuberculosis, together with two additional administrations of Pertussis toxin. All immunized animals exhibited the typical clinical signs of EAE, with a severity that increased progressively from day 8 post-induction to the end of the evaluation, at day 28 post-induction. The maximum clinical score was 3.5, and the disorder was not reversible. Body weight loss was associated with clinical deterioration at the initial stages of the experiment. From a molecular perspective, it was shown that effector cytokines (mainly IL-17) were positively regulated in the brain of diseased animals. The characteristic ultrastructural changes of MS were also detected; namely, demyelination and axonal damage. The methodology described here enabled the implementation of an animal model that reproduces fundamental aspects of the pathogenesis of MS and is, therefore, highly useful for the study of physiopathological mechanisms, the identification of new pharmacological targets and the evaluation of specific biomolecules with therapeutic purposes.

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) mediante la glicoproteína de la mielina del oligodendrocito (MOG) en ratones C57BL/6 isogénicos y homocigóticos, se caracteriza por un patrón crónico progresivo. Este modelo remeda un amplio espectro de síntomas y signos clínicos típicos de la esclerosis múltiple (EM) en humanos. Se describe el ajuste de las condiciones experimentales con respecto a las referidas en la literatura, y se demuestra la generación del modelo mediante evaluaciones clínicas, moleculares y ultraestructurales. La enfermedad se indujo por inmunización activa con el encefalitógeno constituido por el péptido MOG35-55 emulsificado en adyuvante incompleto de Freund, suplementado con Mycobacterium tuberculosis y dos administraciones adicionales de toxina pertussis. Los animales inmunizados mostraron signos clínicos de EAE, cuya severidad aumentó en forma progresiva y ascendente a partir del día 8 después de la inducción, con un puntaje clínico máximo de 3.5, sin reversión hasta el día 28, en que finalizó el periodo de evaluación. La disminución del peso corporal estuvo asociada con el inicio del deterioro clínico. Desde el punto de vista molecular, se identificó una regulación positiva de citocinas efectoras en el cerebro de los animales enfermos, principalmente de la IL-17. Se observaron daños ultraestructurales característicos de la EM en la mielina y el axón. La metodología permitió la generación de un modelo animal con elementos esenciales de la patogénesis de la EM y, por tanto, útil para el estudio de mecanismos fisiopatológicos, la identificación de nuevos blancos farmacológicos y la evaluación de biomoléculas con fines terapéuticos.

Caracterización del estrés oxidativo en diferentes condiciones clínicas mediante índices redox de valor diagnóstico

The redox status imbalance could be related to diverse clinical entities. Recognized analytic methodologies quantifying both: oxidative biomolecular damage and antioxidant activity were used for the characterization of redox balance in human samples (urine, lymphocytes, plasma and serum) in relation with progression markers of diverse clinical conditions. Case and control studies of Human immunodeficiency virus (HIV), Dengue, Diabetes mellitus (DM) type 1, Human-T lymphotropic virus type-1 patients and apparently healthy individuals (18-84 years) were carried out. The evaluation was also applied in intervention designs. The results evidenced oxidative alterations and antioxidant capacity decreased significantly (p < 0.05) in patients compared to healthy individuals related in age and gender. Studies of nutritional intervention and antioxidant supplementation with Vimang(r) in 40 and 81 HIV Cuban patients respectively showed significant beneficial changes (p < 0.05) in 56% and 43.9% of cases respectively. An observational study in 56 HIV Cuban patients was carried out involving two combinations of antiretroviral therapy. The study showed evidences of oxidative modifications significant (p < 0.05) in 87% of the cases, finding differences among combinations. An observational study involving 40 Cuban DM type 1 patients with change of neutral protamine Hagedorn insulin from pig to human recombinant, showed a significant beneficial change (p < 0.05) in 81% of the cases after the change. The integral characterization could be useful for follow up and individuals' management but also contribute to the knowledge of the molecular mechanisms underlying in these illnesses.

El desbalance del estado redox pudiera estar relacionado con diversas condiciones clínicas. Para la caracterización del estado redox en muestras humanas (plasma, suero, eritrocitos, linfocitos y orina) se emplearon metodologías analíticas para cuantificar el daño oxidativo a biomoléculas y la actividad antioxidante. Se hicieron controles de pacientes con virus de inmunodeficiencia humana (VIH), con diabetes mellitus (DM) tipo 1, con virus linfotrópico de células T humanas tipo 1, y de individuos aparentemente sanos (entre 18 y 84 años de edad). La caracterización también se aplicó a diseños de intervención. Se evidenciaron alteraciones oxidativas y significativa disminución de la capacidad antioxidante (p < 0.05) en los enfermos con respecto al grupo presumiblemente sano, relacionados en edad y género. Los estudios de intervención nutricional y suplementarios con Vimang(r) en 40 y 81 pacientes con VIH, mostraron beneficios significativos (p < 0.05) en el 56% y 43.9% de los casos, respectivamente. En el estudio observacional en 56 pacientes con VIH con dos combinaciones de terapia, se incrementó el daño oxidativo y disminuyó la capacidad antioxidante significativamente (p < 0.05) en el 87% de ellos, con diferencias según las combinaciones. Se efectuó un estudio observacional en pacientes con DM tipo 1 con cambio de insulina protamina neutral de Hagedorn de cerdo a insulina recombinante humana, que evidenció beneficios significativos (p < 0.05) en el 81%. Ello contribuyó no solo a la atención integral de los pacientes, sino también al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en estas enfermedades.

Interferón alfa-2b y ribavirina como tratamiento combinado para la hepatitis C crónica en Cuba: Programa Nacional

The treatment of chronic hepatitis C with interferon alpha (IFN-a) is widely used. However, the relapse rate is high, and sustained response is only in 10-20%. A combined treatment based on the synergic antiviral effects described for IFN-a and ribavirin was used as a National Program in Cuba. The study enrolled 357 patients treated during 48 weeks with an injection of IFN-a, 3 times weekly, combined with oral ribavirin in daily doses, the doses adjusted to body weight. Sustained virological response was the efficacy end point, supported by biochemical and histological changes. Normalization in transaminase levels occurs in 60.5% of patients after the first 4 weeks, 71.4% at 26 weeks and 60.2% at the end of treatment. In similar moments, the viral load was undetectable in 42.9%, 42.6% and 37.0% respectively. The implementation of this National Program led to 49.0% and 29.7% of biochemical and virological sustained response respectively. A histological improvement was observed in 53.5% of evaluated patients. The treatment was well tolerated and almost all adverse reactions were attributable to IFN-a. The main adverse reports were: anemia, leucopenia, asthenia, fever, headache, arthralgias, anorexia and myalgia. Anti-interferon antibodies were developed in 38 patients, in 3 of them as neutralizing of antiviral activity. These results confirm the efficacy and security profile of both drugs as combined therapy for the chronic hepatitis C and represent the first clinical data generated from its extensive use in the Cuban general population. The virological response was in agreement with international reports for populations with similar characteristics.

El porcentaje de recaída tras el tratamiento de la hepatitis C crónica con interferón alfa (IFN-a) es elevado y la respuesta sostenida oscila entre el 10 y el 20%. El efecto antiviral sinérgico entre el IFN-a y la ribavirina fue la base para instaurar el tratamiento combinado mediante un programa nacional en Cuba. Se escogieron 357 pacientes que durante 48 semanas recibieron IFN-a, 3 veces por semana, y varias dosis de ribavirina según el peso corporal. La respuesta virológica sostenida fue la variable principal de eficacia, apoyada en las variaciones bioquímicas e histológicas. Tras las primeras 4 semanas, el 60.5% de los pacientes tenía la transaminasa normal; 71.4% en la semana 26, y 60.2% al concluir el tratamiento. En iguales momentos, la carga viral fue indetectable en 42.9, 42.6 y 37%, respectivamente. En 7 años de ejecución, se registraron 49 y 29.7% de respuesta bioquímica y virológica sostenida. Hubo una mejoría histológica en el 53.3% de estos pacientes. El tratamiento fue bien tolerado y casi todas las reacciones adversas se atribuyeron al IFN-a. Las principales fueron anemia, leucopenia, astenia, fiebre, cefalea, artralgias, anorexia y mialgias. En 38 pacientes se formaron anticuerpos anti- IFN-a y en 3 pacientes neutralizaron la actividad antiviral. Los resultados confirman la eficacia y el perfil de seguridad de esa combinación para tratar la hepatitis C crónica. Son los primeros datos clínicos tras su uso en la población cubana. La respuesta virológica coincide con la descrita en otras poblaciones con características similares.

Evidencias de infección autóctona por Borrelia burgdorferi sensu lato en Cuba

Borrelia burgdorferi sensu lato is the causative agent of Lyme disease, borreliosis not reported in Cuba but clinical and epidemiological suspicions exist since the 1980's, and there were no microbiological testing for confirmation. This led to perform a series of researches to provide scientific evidences about the presence of this agent in the country, including the evaluation and implementation of microbiological methods for the detection of this spirochete, confirmation of infection in clinical samples from patients with clinical and epidemiological suspicions, the estimated seroprevalence of antibodies against this agent in a population at risk and the molecular detection of borrelia in ticks of veterinary and medical importance. The microbiological tools evaluated (culture medium modified, methods of extracting genetic material from ticks for subsequent detection of B. burgdorferi sensu lato by molecular testing, and analytical sensitivity of two sets of primers) and implemented (specific serological tests) strengthened the IPK analytical capacity with novel methods for future researches. We found specific serological evidences of autochthonous infection by this organism in samples of individuals with clinical and epidemiological suspicion, and those exposed to tick bites. Genetic material of B. burgdorferi sensu lato was undetected in the analyzed ticks, what does not rule them out as potential carriers of the agent. In this paper we show evidence highly suggestive of infection with B. burgdorferi sensu lato and it is the first of its kind in the country.

Borrelia burgdorferi sensu lato causa la enfermedad de Lyme, una borreliosis no reportada en Cuba. Desde la década de 1980 se tenían sospechas clínicas y epidemiológicas, pero no había pruebas microbiológicas que lo confirmaran. Las investigaciones científicas sobre su presencia en el país incluyeron la evaluación e implementación de métodos microbiológicos para su detección, la confirmación de la infección en muestras clínicas de pacientes con sospechas clínico-epidemiológicas de esta enfermedad, la estimación de la seroprevalencia de anticuerpos contra este agente en una población de riesgo y la detección molecular de borrelias en garrapatas de importancia médico-veterinaria. Las herramientas microbiológicas evaluadas (medio de cultivo modificado, métodos de extracción de material genético de garrapatas para la posterior detección de B. burgdorferi sensu lato por pruebas moleculares, y la sensibilidad analítica de dos juegos de cebadores) e implementadas (pruebas serológicas específicas) fortalecieron la capacidad analítica del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí, en Cuba, con nuevos métodos para futuras investigaciones. En las muestras de individuos con sospechas clínico-epidemiológicas y en los expuestos a mordeduras por garrapatas, se encontraron evidencias serológicas específicas de la infección autóctona por este microorganismo. No se detectó material genético de B. burgdorferi sensu lato en las garrapatas analizadas, lo que no descarta que sean posibles vectores del agente. Las evidencias de este estudio son altamente sugestivas y constituye el primero de su tipo en Cuba.

Nueva estrategia para mejorar la presentación antigénica en la inmunoterapia activa del cáncer. Fusión del antígeno E7 del virus del papiloma humano tipo 16 a un péptido penetrador a células

Facilitating the delivery of exogenous antigens to antigen-presenting cells, ensuing processing and presentation via the major histocompatibility complex class I and induction of an effective immune response are fundamental for an effective therapeutic cancer vaccine. In this regard, we propose the use of cell-penetrating peptides fused to a tumor antigen. To demonstrate this concept we designed a fusion protein comprising a novel cell-penetrating and immunostimulatory peptide corresponding to residues 32 to 51 of the Limulus anti-lipopolysaccharide factor protein (LALF32-51) linked to human papillomavirus 16 E7 antigen (LALF32-51-E7). In this work, we demonstrated that the immunization with LALF32-51-E7 using the TC-1 mouse model induces a potent and long-lasting anti-tumor response supported on an effective E7-specific CD8+ T-cell response. The finding that therapeutic immunization with LALF32-51 or E7 alone, or an admixture of LALF32-51 and E7, does not induce significant tumor reduction indicates that covalent linkage between LALF32-51 and E7 is required for the anti-tumor effect. These results support the use of this novel cell-penetrating peptide as an efficient means for delivering therapeutic targets into cellular compartments with the induction of a cytotoxic CD8+ T lymphocyte immune response. This approach is promissory for the treatment of tumors associated with the human papillomavirus 16, which is responsible for the 50% of cervical cancer cases worldwide and other malignancies. Furthermore, protein-based vaccines can circumvent the major histocompatibility complex specificity limitation associated with peptide vaccines providing a greater extent in their application.

Facilitar la internalización de moléculas exógenas por las células presentadoras de antígenos, su procesamiento, presentación en el complejo mayor de histocompatibilidad tipo I y la inducción de una respuesta inmune efectiva, constituyen premisas fundamentales en el diseño de candidatos vacunales terapéuticos contra cáncer. Para ello se propone el uso de péptidos penetradores a células (PPC) fusionados con el antígeno tumoral. Para demostrarlo se empleó un novedoso PPC derivado de la proteína factor antilipopolisacárido de Limulus (LALF32-51), fusionado genéticamente a una muteína de la proteína E7 del virus del papiloma humano tipo 16 (VPH16), que denominamos LALF32-51-E7. En este estudio se demuestra que la inmunización con LALF32-51-E7, en el modelo murino tumoral TC-1 de VPH16, induce una respuesta anti-tumoral potente, protectora y de larga duración, cuyo mecanismo es la inducción de una respuesta celular mediada por linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos contra el antígeno E7. La inmunización con la E7 sola o la mezcla de ella con el PPC no reproduce los efectos obtenidos con la fusión covalente LALF32-51-E7. Los resultados avalan este nuevo PPC como una herramienta atractiva para la internalización de antígenos con la consecuente inducción de una respuesta de linfocitos T citotóxicos CD8+. Además, abre una perspectiva promisoria para el tratamiento de tumores asociados al VPH16 responsable del 50% del cáncer cervical y de otros tumores. A diferencia de las vacunas peptídicas, las basadas en proteínas no están restringidas por el antígeno leucocitario humano y permiten una amplia aplicación.

Caracterización genética de Pneumocystis jirovecii en fallecidos por sida, IPK, 1995-2008

Pneumocystis jirovecii is a frequent opportunistic pathogen in HIV/AIDS. The inability to culture this species prevents from acquiring deeper knowledge about its biology, drug susceptibility as well as the epidemiology of the disease that it produces. Pneumocystosis diagnosis in Cuba is suspected, based on the clinical and radiological findings which often lead to misdiagnosis since other microorganisms produce symptoms, signs and radiological patterns similar to this infection. Currently, the status on drug resistance is unknown and there are no means to evaluate the resistance to the recommended drugs. On the other hand, no studies on the distribution of P. jirovecii of genotypes in the country have been described. The results of the present study allows: a) to describe for the first time in the literature a new genotype of mitochondrial small RNA ribosomal subunit (160A/196T), b) to suggest a narrow circulation of the pathogen in Cuba; and c) to assume a very low prevalence of sulfamide resistance linked to mutations of P. jirovecii in our country. The results obtained constitute highly valuable knowledge of pneumocystosis in Cuba, as well as worldwide since they provide new information that can be used to a better disease management.

Pneumocystis jirovecii es un agente patógeno oportunista que frecuentemente afecta a los enfermos con el VIH/sida. La imposibilidad de su cultivo limita el conocimiento profundo de su biología, susceptibilidad a los fármacos, y la epidemiología de la neumocistosis que provoca. En Cuba, se diagnostica mediante la información clínico-radiológica del paciente; pero esta puede ser inespecífica y acarrear errores, pues otros microorganismos provocan síntomas, signos y patrones radiológicos similares a los de esa infección. A su vez, no poder evaluar la resistencia a los medicamentos es un obstáculo en el tratamiento completo al paciente con VIH/sida. Ningún estudio describe la distribución de los genotipos de P. jirovecii en Cuba. Los resultados que se presentan a) revelan un nuevo genotipo (160A/196T) del gen que codifica para la subunidad menor del ARNr, b) sugieren una circulación restringida del agente patógeno en Cuba, c) e indican que la prevalencia de P. jirovecii con mutaciones vinculadas con su resistencia a sulfamidas es muy baja en nuestro medio. Tales resultados son de extraordinario valor no solo para el conocimiento de la neumocistosis en Cuba y en el mundo, sino también para el tratamiento integral a pacientes con VIH/sida.