Biotecnología Vegetal

Estabilidad genética entre clones de berenjena in vitro inducidos por diferentes reguladores de crecimiento de plantas

ABSTRACT Many factors may influence the genetic stability of plant in vitro clones, among which the genotype and the regenerative process induced by plant growth regulators. The resulting somaclonal variations may be useful for breeding projects, but may be detrimental to germplasm conservation. The objective of this work was to evaluate the genetic stability of Solanum melongena cv. ‘Florida Market’ clones, obtained in response to different plant growth regulators. For the production of clones, leaf explants were used from commercial seed germinated plants. The explants were inoculated in Murashige and Skoog medium supplemented with different plant growth regulators at predefined concentrations. The DNA was extracted by the CTAB method from leaves of complete plants obtained by somatic embryogenesis induced by naphthaleneacetic acid (NAA) or indirect organogenesis induced by benzylaminopurine (BAP) or thidiazuron (TDZ). For the RAPD, 117 DNA samples were amplified by ten decamer primers and 49 specific bands were selected among the products for the comparative study. A total of 5733 fragments were obtained, with a rate of 5.37% polymorphism. NAA did not generate polymorphism and the BAP was responsible for the highest rate obtained (14.28%). Two RAPD primers were identified as markers for monitoring the genetic stability of eggplant. The polymorphic pattern was observed only in clones originating from indirect organogenesis. These results indicate the usefulness of a monitoring protocol for studies using in vitro cloned eggplant.

RESUMEN Muchos factores pueden influir en la estabilidad genética de los clones de plantas in vitro, entre los que se encuentran el genotipo y el proceso regenerativo inducido por los reguladores del crecimiento. Por lo tanto, las variaciones somaclonales resultantes del cultivo pueden ser útiles para proyectos de mejoramiento genético, pero pueden ser perjudiciales para la conservación de germoplasma. El objetivo de este estudio fue evaluar la estabilidad genética de Solanum melongena cv. ‘Florida Market’, obtenida en respuesta a diferentes reguladores del crecimiento. Para la producción de clones se utilizaron explantes de hojas provenientes de plantas obtenidas de semillas germinadas. Los explantes se inocularon en medio de cultivo Murashige y Skoog con los diferentes reguladores del crecimiento en concentraciones predefinidas. El ADN se extrajo mediante el método CTAB a partir de plantas completas obtenidas por medio de embriogénesis somática inducida por ácido naftalenoacético (ANA) u organogénesis indirecta inducida por bencilaminopurina (BAP) o tidiazurón (TDZ). Para el RAPD, 117 muestras de ADN se amplificaron mediante diez cebadores y se seleccionaron 49 bandas puntuales entre los productos, para el estudio comparativo. Se obtuvieron un total de 5733 fragmentos, con una tasa de 5.37% de polimorfismo. ANA no generó polimorfismo y BAP fue responsable de la tasa más alta obtenida (14.28%). Se identificaron dos cebadores RAPD como marcadores para monitorear la estabilidad genética de la berenjena. El patrón polimórfico se observó solo en los clones originados en la organogénesis indirecta. Estos resultados indican la utilidad de un protocolo de monitoreo para estudios que usan berenjena clonada in vitro.

Uso de meta-topolina, una citoquinina no convencional en la multiplicación in vitro de Opuntia stricta Haw.

ABSTRACT The erect prickly pear (Opuntia stricta Haw) is an important alternative used to feed ruminants during prolonged periods of drought. The objective of this research was to evaluate the effect of different types and concentrations of cytokinins on the morphophysiological aspects of in vitro multiplication of O. stricta. Segments of O. stricta were grown in liquid and semisolid Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 2.22 or 1.11 µM l-1 of 6-benzylaminopurine (BAP) and 1.11 µM l-1 meta-Topolin (mT). The experiment was conducted in a growth room at 25±2 °C over a period of 45 days. It were evaluated multiplication rate, shoot formation index, rooting and callus formation, fresh biomass, height, activity of antioxidant enzymes, and content of hydrogen peroxide and malondialdehyde. The experiment was carry out in a completely randomized design with six treatments and twelve replicates. The results showed that the consistency of the medium had influence on the shoots development and roots emission. The increase in BAP concentrations resulted in a reduction in the length and fresh biomass of the shoots and in the root system. The enzymatic activity and oxidative stress were inducted with the use of 6-benzylaminopurine. The micropropagation of O. stricta was improved with the use of mT, verified through shoot with better morphophysiological quality for acclimatization, with longer shoot length, rooting and reduction in the occurrence of hyperhydricity, a morphophysiological disorder that leads to large losses in micropropagation of this specie.

RESUMEN El nopal erecto (Opuntia stricta Haw) es una alternativa importante que se utiliza para alimentar a los rumiantes durante períodos prolongados de sequía. El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de diferentes tipos y concentraciones de citoquininas en los aspectos morfofisiológicos de la multiplicación in vitro de O. stricta. Se cultivaron segmentos de O. stricta en medio de cultivo líquido y semisólido de Murashige y Skoog (MS) con 2.22 o 1.11 µM l-1 de 6-bencilaminopurina (BAP) y 1.11 µM l-1 de meta-Topolina (mT). El experimento se realizó en una sala de crecimiento a 25 ± 2 °C durante un período de 45 días. Se evaluaron la tasa de multiplicación, el índice de formación de brotes, la formación de raíces y callos, la biomasa fresca, la altura, la actividad de las enzimas antioxidantes y el contenido de peróxido de hidrógeno y malondialdehído. El experimento se realizó con un diseño completamente al azar con seis tratamientos y doce repeticiones. Los resultados mostraron que la consistencia del medio de cultivo influyó en el desarrollo de brotes y en la emisión de raíces. El aumento en las concentraciones de BAP resultó en una reducción en la longitud y la biomasa fresca de los brotes y en el sistema radicular. La actividad enzimática y el estrés oxidativo se indujeron con el uso de 6-bencilaminopurina. La micropropagación de O. stricta se mejoró con el uso de mT, verificado a través de brotes con mejor calidad morfofisiológica para la aclimatización con mayor longitud de brotes, enraizamiento y reducción en la aparición de hiperhidricidad, un trastorno morfofisiológico que conduce a grandes pérdidas de micropropagación de esta especie.

Daño a la membrana y respiración celular de Passalora fulva por extractos de hojas de Citrus aurantiifolia

RESUMEN El moho foliar del tomate (Solanum lycopersicum L.), producido por Passalora fulva, constituye un problema fitosanitario importante que afecta la producción de tomate en casas de cultivo. El uso de extractos de plantas pudiera contribuir al manejo de esta enfermedad. En este sentido, extractos etanólicos de hojas de Citrus aurantiifolia han mostrado actividad antifúngica frente a P. fulva. El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de un extracto de C. aurantiifolia en la membrana celular y la respiración de P. fulva. El extracto se obtuvo mediante extracción asistida por ultrasonido y se cuantificó el contenido de fenoles totales. El efecto de los extractos en la membrana celular se evaluó mediante la determinación de las concentraciones de fósforo y potasio en el medio extracelular y el efecto en la respiración, mediante la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa. Las altas concentraciones de fósforo y potasio encontradas en el medio extracelular sugirieron daños en la permeabilidad de la membrana celular de P. fulva. De manera similar, la inactividad de la enzima succinato deshidrogenasa indicó la inhibición de la respiración celular del hongo por el extracto evaluado. Los resultados de este estudio confirmaron las propiedades antifúngicas del extracto de hojas de C. aurantiifolia.

ABSTRACT The foliar mold of tomato (Solanum lycopersicum L.), produced by Passalora fulva, constitutes an important phytosanitary problem that affects the production of tomato in greenhouse. The use of plant extracts could contribute to the disease management. In this sense, ethanolic extracts of Citrus aurantiifolia leaves have shown antifungal activity against P. fulva. The aim of this study was to determine the effect of C. aurantiifolia extract on the cell membrane and respiration of P. fulva. The extract was obtained by ultrasound-assisted extraction and the content of total phenols was quantified. The effect of the extracts on the cell membrane was evaluated by determining the phosphorus and potassium concentrations in the extracellular medium and the effect in respiration for succinate dehydrogenase activity. The high concentrations of phosphorus and potassium in the extracellular medium suggested damage in the permeability of the cellular membrane of P. fulva. Similarly, the inactivity of the enzyme succinate dehydrogenase indicated an inhibition of cellular respiration of P. fulva by the extract evaluated. The results of this study confirmed the antifungal properties of the leaf extract of C. aurantiifolia.

Polvo de hojas de Melia azedarach L., Dendranthema grandiflora Tzvelev y Tagetes erecta L. para el tratamiento de semillas de Carthamus tinctorius L.

RESUMEN El cártamo (Carthamus tinctorius L.) presenta una amplia diversidad de uso, como alimentación, extracción de aceite y vástagos florales para ornamentación. Sin embargo, presenta baja productividad debido a la alta susceptibilidad al ataque de microorganismos patógenos durante su cultivo. Por ello, el tratamiento de semillas es una alternativa para la protección y garantizar la calidad sanitaria. El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto de polvo de hojas de tres especies de plantas sobre la calidad fisiológica y sanitaria de semillas de cártamo (Carthamus tinctorius L.) almacenados por diferentes períodos de tiempo. El experimento fue realizado en un diseño completamente al azar, en factorial 10x3 (combinaciones de polvo de hojas y períodos de almacenamiento de semillas), con cuatro repeticiones. El lote de semillas fue almacenado con grado de humedad promedio del 9%. Hojas de Melia azedarach L., Dendranthema grandiflora Tzvelev y Tagetes erecta L. se secaron y trituraron hasta obtener polvo que se aplicó a las semillas a las dosis de: cero (control), 1, 2 y 3 g kg-1 de semillas. Se evaluó la calidad de las semillas a través de las pruebas de germinación, longitud y masa de plántulas, emergencia y sanidad. El uso de polvo de hojas a partir de M. azedarach, de D. grandiflora y T. erecta como tratamiento de semillas de cártamo fue benéfico para el control de la infestación por hongos fitopatógenos e incrementó su potencial de germinación y de emergencia en el campo. Los resultados indicaron que tienen potencial para el tratamiento de semillas de cártamo almacenadas por diferentes períodos de tiempo.

ABSTRACT The safflower (Carthamus tinctorius L.) has a wide diversity of use, such as feeding, oil extraction and floral stems for ornamentation. However, it has low productivity due to the high susceptibility to attack by pathogenic microorganisms during its culture. For this reason, seed treatment is an alternative for protection and to guarantee sanitary quality. The objective of the present work was to determine the effect of leaf powder from three plant species on the physiological and sanitary quality of safflower seeds (Carthamus tinctorius L.) stored for different periods of time. The experiment was carried out in a completely randomized design, in 10x3 factorial (leaf powder combinations and seed storage periods), with four repetitions. The seed lot was stored with an average moisture content of 9%. Leaves of Melia azedarach L., Dendranthema grandiflora Tzvelev and Tagetes erecta L. were dried and crushed to obtain powder that was applied to the seeds at the doses of: zero (control), 1, 2 and 3 g kg-1 of seeds. Seed quality was evaluated through germination, seedling length and mass, emergence and health tests. The use of leaf powder from M. azedarach, D. grandiflora and T. erecta as a treatment of safflower seeds was beneficial for the control of the infestation by phytopathogenic fungi and increased its potential for germination and emergence in the field. The results indicated that it have potential for the treatment of safflower seeds stored for different periods of time.

Predicción de la afinidad de ligandos antagonistas por receptores de adenosina A_2A usando árboles de decisión

RESUMEN Las enfermedades neurodegenerativas están siendo tratadas mediante la modulación de los receptores de adenosina con antagonistas más eficaces, seguros y selectivos. El objetivo del estudio consistió en desarrollar una metodología para obtener modelos de clasificación sobre la base de algoritmos de árboles de decisión y descriptores de 0D a 2D de familias no congenéricas de compuestos orgánicos para predecir cualitativamente la afinidad ligando-RAA2A. Para ello se construyó y curó una base de datos no congenérica de 315 antagonistas con su constante de inhibición en nano molar, etiquetados como potentes y débiles. Se utilizaron los programas Dragon e ISIDA/QSPR para calcular descriptores moleculares y se obtuvieron cinco grupos de descriptores. En cada grupo se seleccionaron 50 descriptores usando el criterio mRMR. La base de datos se dividió en series de Entrenamiento, Prueba y Externa mediante una selección aleatoria y un análisis de clúster k-means generalizado. Se desarrollaron y validaron clasificadores utilizando el programa WEKA. Los resultados fueron analizados mediante las pruebas estadísticas de Friedman y Wilcoxon. Se comprobó la influencia significativa del parámetro m del algoritmo J48 en la predictividad, para los modelos que usaron los descriptores de los grupos aug.a-b e hyb.aug.a del ISIDA/QSPR. El modelo de mejor desempeño se obtuvo de los descriptores seleccionados del grupo ISIDA-todos con un valor de m=6 y alcanzó 90.6% de predicción sobre la serie Externa. La metodología desarrollada para obtener modelos de clasificación sobre la base de algoritmos de árboles de decisión y descriptores de 0D a 2D de familias no congenéricas de compuestos orgánicos es efectiva para predecir cualitativamente la afinidad ligando-RAA2Acon una exactitud, especificidad y selectividad superiores al 90%.

ABSTRACT Neurodegenerative diseases are being treated by modulating adenosine receptors with more effective, safe and selective antagonists. The objective of the study was to develop a methodology to obtain classification models based on decision tree algorithms and descriptors from 0D to 2D of non-congenital families of organic compounds to qualitatively predict ligand-RAA2A affinity. For this purpose, a non-congeneric database of 315 antagonists was constructed and cured with its inhibition constant in nano molar, labeled as potent and weak. The Dragon and ISIDA / QSPR programs were used to calculate molecular descriptors and five groups of descriptors were obtained. In each group 50 descriptors were selected using the mRMR criterion. The database was divided into Training, Test and External series through a random selection and a generalized k-means cluster analysis. Classifiers were developed and validated using the WEKA program. The results were analyzed using the statistical tests of Friedman and Wilcoxon. The significant influence of parameter m of algorithm J48 on the predictivity was verified for the models that used the descriptors of the aug.a-b and hyb.aug.a groups of ISIDA / QSPR. The best performance model was obtained from the selected descriptors of the ISIDA-all group with a value of m = 6 and reached 90.6% prediction on the External series. The methodology developed to obtain classification models based on decision tree algorithms and descriptors from 0D to 2D of non-congenital families of organic compounds is effective in qualitatively predicting ligand-RAA2A affinity with accuracy, specificity and selectivity greater than 90 %.

Optimización del medio de cultivo y las condiciones de fermentación para la producción de un biofertilizante a base de Pseudomonas fluorescens

RESUMEN En Cuba se ha desarrollado un biofertilizante a base de una cepa de Pseudomonas fluorescens, solubilizadora de fosfatos. Ante la necesidad de estandarizar su escalado industrial este trabajo tuvo por objetivo optimizar el medio de cultivo y las condiciones de fermentación. Primero se realizaron ensayos a escala de zaranda y posteriormente en un fermentador. En cada caso se realizó una validación experimental. Para la optimización del medio de cultivo se empleó un diseño compuesto central para ajustar superficies de respuesta. Se aplicó un diseño factorial 23 con puntos estrellas equidistantes y seis repeticiones en el centro del plan considerado como cero. Se realizaron un total de 20 corridas experimentales, con tres repeticiones cada una y se determinó la ecuación de regresión. Como variable de respuesta se determinó el crecimiento celular por densidad óptica λ =600 nm (DO600). Para optimizar del crecimiento microbiano en función de la velocidad de agitación y el flujo de aire se empleó un fermentador de 12 litros de volumen total con 8.5 litros de volumen efectivo con un diseño factorial 22, tomando como variable de respuesta la DO600. Se comprobó que para la producción industrial de P. fluorescens y la formulación del bioproducto puede emplearse un medio de cultivo semisintético optimizado, sin melaza, que unido al empleo de una velocidad de agitación y flujo de aire óptimos permiten incrementar el contenido de biomasa bacteriana. Las nuevas condiciones permitieron reducir el tiempo de fermentación a 12 horas con respecto a las 20 a 22 horas que se empleaban en el esquema de producción. Además, se redujo el 29%, 50% y 40%, respectivamente de las fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo.

ABSTRACT In Cuba, a biofertilizer has been developed based on a Pseudomonas fluorescens strain phosphate solubilizer. Given the need to standardize its industrial scale up, this work aimed to optimize the culture medium and the fermentation conditions. First, tests in the shaker were carried out and then in a fermenter. In each case an experimental validation was performed. For the optimization of the culture medium, a central composite design was used to adjust response surfaces. A 23 factorial design with equidistant star points and six repetitions in the center of the plan considered zero was applied. A total of 20 experimental runs were performed, with three repetitions each and the regression equation was determined. As a response variable, cell growth was determined by optical density λ = 600 nm (OD600). To optimize microbial growth based on agitation speed and air flow, a 12-liter total volume fermenter with 8.5 liters of effective volume with a factorial design 22 was used, taking OD600 as the response variable. It was found that for the industrial production of P. fluorescens and the formulation of the bioproduct, an optimized semisynthetic culture medium can be used, without molasses. Together with the employed of optimal agitation speed and air flow, the bacterial biomass content can be increased. The new conditions allowed reducing the fermentation time to 12 hours compared to the 20 to 22 hours used in the production scheme. In addition, 29%, 50% and 40%, respectively, of carbon, nitrogen and phosphorus sources were reduced.

Efecto del uso combinado de dos citoquininas en la multiplicación y regeneración de yemas adventicias de banano cv. ‘Gros Michel’ (Musa AAA)

RESUMEN En los programas de mejoramiento genético es importante contar con un sistema de regeneración de plantas eficiente. En el cultivar ‘Gros Michel’ (Musa AAA) resulta difícil la obtención de yemas adventicias debido a la alta dominancia apical. La presente investigación se desarrolló con el objetivo de determinar el efecto de las citoquininas en la multiplicación y regeneración de yemas adventicias en dicho cultivar. Se establecieron tres tratamientos 6-BAP y TDZ combinados y cada uno de ellos por separado. Se emplearon secciones de 0.4 mm2 de yemas adventicias con un subcultivo de multiplicación. Cada 30 días se cuantificó el número de yemas adventicias y brotes formados por explante. Posteriormente, se colocaron en un medio de cultivo libre de reguladores del crecimiento y a los 30 días se evaluó el porcentaje de brotes regenerados por explante, la altura del brote y el número de hojas emitidas. Los resultados demostraron que con cuatro subcultivos en un medio de cultivo con 6-BAP (2.0 mg l-1) y TDZ (1.0 mg l-1) se forman entre 1.5 y 8.0 yemas adventicias por explante con 92% de regeneración y altura superior a 2.0 cm, sin mostrar evidencias de cambios fenotípicos. Todo lo anterior confirma que la utilización de estas dos citoquininas combinadas a concentraciones más bajas y en un menor número de subcultivos brinda mayores posibilidades para la formación de yemas adventicias, su multiplicación y posterior regeneración lo cual posibilitará su empleo en los Programas de Mejora Genética de bananos.

ABSTRACT In breeding programs it is important to have an efficient plants regeneration system. In the cultivar ‘Gros Michel’ (Musa AAA) it is difficult to obtain adventitious buds due to high apical dominance. The present investigation was developed with the objective of determining the effect of cytokinins on the multiplication and regeneration of adventitious buds in that cultivar. Three treatments were established with the combination of 6-BAP and TDZ and each of them separately. Sections of 0.4 mm2 of adventitious buds with one multiplication subculture were used. The number of adventitious buds and shoots formed by explant was quantified every 30 days. Subsequently, it were placed in a culture medium free of growth regulators and after 30 days the percentage of shoots regenerated by explant, the height of the shoot and the number of leaves emitted were evaluated. The results showed that with four subcultures in a culture medium with 6-BAP (2.0 mg l-1) and TDZ (1.0 mg l-1) were achieved 1.5 to 8.0 adventitious buds per explant with 92% regeneration and height greater than 2.0 cm without showing evidence of phenotypic changes. All of the above confirms that the use of these two cytokinins combined at lower concentrations and in a smaller number of subcultures provides greater possibilities for the adventitious buds formation, their multiplication and subsequent regeneration which will enable their use in the Genetic Improvement Programs of bananas.

Manejo de la contaminación bacteriana en la propagación in vitro de yemas axilares de Colocasia esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’

RESUMEN La propagación in vitro de Colocasia esculenta se limita por la presencia de contaminantes microbianos, especialmente bacterias. El objetivo de este trabajo fue demostrar que la inclusión de acciones para el manejo de la contaminación bacteriana en la propagación in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’ a partir de explantes de campo, puede reducir las pérdidas. Se emplearon dos protocolos de propagación in vitro y se comparó la incidencia de contaminantes bacterianos en las fases de establecimiento y multiplicación. Un protocolo modificó al otro con acciones para el manejo de la contaminación bacteriana. En cada uno se partió de 20 rizomas primarios de los que se extrajeron al menos dos yemas axilares y de cada una se estableció una línea. Se cuantificó el número de explantes contaminados con bacterias por subcultivo. La contaminación bacteriana se observó en el medio de cultivo debajo de los explantes o alrededor de estos lo que indica al explante inicial como fuente primaria de contaminación. Con la aplicación del protocolo modificado se redujo el porcentaje de pérdidas por contaminación bacteriana en todos los subcultivos evaluados. En el establecimiento in vitro no rebasó el 5%. La combinación de acciones para el manejo de la contaminación bacteriana entre las que se encuentran la reducción del tamaño del explante, el trabajo por líneas y la detección visual de contaminantes previo al subcultivo del material vegetal reduce la presencia de contaminantes bacterianos en la propagación in vitro de C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’.

ABSTRACT The in vitro propagation of Colocasia esculenta is limited by the presence of microbial contaminants, especially bacteria. The objective of this work was to demonstrate that the inclusion of actions for the bacterial contamination management in the in vitro propagation of C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’, from field explants, can reduce losses. Two in vitro propagation protocols were used and the incidence of bacterial contaminants in the establishment and multiplication stages was compared. One protocol modified the other with actions for the management of bacterial contamination. In each one, 20 primary rhizomes were taken from which at least two axillary buds were extracted and from each one a line was established. The number of explants contaminated with bacteria per subculture was quantified. Bacterial contamination was observed in the culture medium below or around the explants, indicating the initial explant as the primary source of contamination. With the application of the modified protocol, the percentage of losses due to bacterial contamination in all subcultures evaluated was reduced. In the in vitro establishment it did not exceed 5%. The combination of actions for the management of bacterial contamination among which are the reduction of the size of the explant, the work by lines and the visual detection of contaminants prior to the subculture of the plant material reduces the presence of bacterial contaminants in the in vitro propagation of C. esculenta cv. ‘INIVIT MC-2012’.