Revista de Protección Vegetal

STRATEGIES OF GENETIC ENGINEERING FOR THE OBTAINMENT OF TRANSGENIC PLANTS RESISTANT TO GEMINIVIRUSES. EXPERIENCE AT CENSA

Los begomovirus constituyen el principal problema para la producción del cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) en la mayoría de las regiones tropicales y subtropicales, causando pérdidas de un 100% del rendimiento. Para el control de los mismos se han aplicado varias estrategias convencionales de lucha, las que prometen obtener resultados alentadores a largo plazo. La aplicación de la transgenesis en plantas para conferir resistencia a virus hace de esta alternativa una herramienta de gran importancia para el desarrollo de una agricultura más sostenible. Entre las estrategias más utilizadas se encuentran: la resistencia conferida por la sobreexpresión del gen de la proteína de la cápsida viral (CP), uso de ácidos nucleicos defectivos interferentes, expresión de los ARNs de genes de interés utilizando la expresión de ARNs antisentido, así como de pequeños fragmentos de ARN viral como inductores del silenciamiento génico post-transcripcional. En Cuba, se han identificado tres begomovirus afectando este cultivo, el Virus del Encrespamiento Amarillo de la Hoja del Tomate (TYLCV), Taíno Moteado del Tomate (ToMoTV) y Mosaico Habana del Tomate (ToMHV), pero el TYLCV ha sido el de mayor diseminación e incidencia. Dado el impacto que conllevan las pérdidas ocasionadas por los geminivirus y el aporte de la ingeniería genéticapara su control, el presente artículo refiere aspectos sobre las principales estrategias desarrolladas para la obtención de plantas transgénicas resistentes a estos, el impacto de esta tecnología en la agricultura actual y los resultados específicos obtenidos en el CENSA.

Begomoviruses constitute the principal problem for the production of tomato crop (Lycopersicon esculentum Mill.) in tropical and subtropical regions, causing yield damages of 100%. Conventional strategies for the control of these viruses which promise to obtain long term results have been developed. The application of trangenesis in plants for conferring resistance to virus is a tool of great importance for the development of a more sustainable agriculture. Among the main strategies developed are: resistance by the over expression of the coat protein (CP), use of interfering defective nucleic acids, expression of RNAs from genes of interest, as well as the use of antisense RNAs and short RNAs as inductors of post-transcriptional gene silencing. In Cuba, three begomoviruses have been identified in tomato crops: Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV), Tomato Mosaic Havana Virus (ToMHV) and Taíno Tomato Mottle Virus (TToMoV), but TYLCV has had the greatest incidence and dissemination. Due to the impact on damages caused by geminiviruses and the role played by the genetic engineering in their control, the present article reviews the aspect related to the main strategies developed for obtainment of transgenic plants resistant to geminiviruses, the impact of this technology in the current agriculture and the specific results obtained at CENSA.

**POTENTIALITIES OF Heterorhabditis bacteriophora POINAR STRAIN HC1 FOR THE MANAGEMENT OF Hypothenemus hampei FERR. I. PARASITISMM AND SEARCH CAPACITY**

En Cuba, Heterorhabditis bacteriophora cepa HC1 ha demostrado cualidades favorables como agente de control biológico de diversos insectos plagas, empleándose con éxito en el manejo del complejo de chinches harinosas (Pseudococcidae) del cafeto, tetuán del boniato (cylas formicarius) y plutela (Plutella xyllostella) en col de repollo; entre otras. Con el objetivo de comprobar su efectividad sobre la broca del cafeto (Hypothenemus hampei), plaga del cafeto en Cuba, se evaluó la susceptibilidad de los diferentes estadios del insecto y la capacidad de penetración de los nematodos a los granos de café infestados. A las 48 horas se registró el 100 % de mortalidad de las larvas y pupas en el ensayo in vitro y también dentro de los granos de café tratados. Se observó una agregación de juveniles infectivos del nematodo sobre los huevos, los que parasitaron a las larvas en el momento de la emergencia. En condiciones simuladas de campo, se obtuvo un 60% de mortalidad en estos estadios dentro de los granos de café con un incremento progresivo, en dependencia del momento de evaluación, registrándose una mortalidad media del 93% a los 17 días.

In Cuba, Heterorhabditis bacteriophora strain HC1 has demonstrated favourable qualities as biological control agent of diverse pest insects under the Cuban conditions. It is being used successfully against mealybugs (Pseudococcidae) complex in coffee Cylas formicarius in sweet potato and diamond back (Plutella xyllostella) in cabbage, among others. In order to check its effect on the coffee berry borer (Hypothenemus hampei), main pest in coffee in Cuba, the susceptibility on different insect stages and the capacity of nematodes for penetrating coffee grains infested were evaluated. A mortality of 100% of larvae and pupae placed in Petri dishes and in coffee grains treated was registered at 48 hours. Infective juveniles, which parasite larvae at the moment of the emergency, were aggregated on the eggs. Under simulated field conditions, a 60% mortality was obtained in these stages inside coffee grains with a progressive increment in dependance of the evaluation moment, registering a half mortality of 93% at 17 days.

MEALYBUG (HEMIPTERA: PSEUDOCOCCIDAE) FAUBA ASSOCIATED TO PLANTS OF INTEREST: III COFFEE AND COCOA

Con el propósito de conocer la fauna de chinches harinosas asociadas a cafeto y cacao se realizaron muestreos en diferentes localidades del país. Se hallaron 13 especies de chinches harinosas en cafeto y seis en cacao, de los géneros: Dysmicoccus Ferris, Ferrisia Fullaway, Nipaecoccus Sulc, Paracoccus Ezzat y Mc Connell, Phenacoccus Cokerell, Planococcus Ferris y Planococcoides Ezzat y Mc Connell. De las especies encontradas coincidieron en ambos cultivos Dysmicoccus bispinosus, D. brevipes, Paracoccus marginatus, Planococcus citri, P. minor y Planococcus sp.

Different areas of the country were sampled to find out the mealybug fauna associated to coffee and cocoa trees. Thirteen species of mealybugs in coffee trees and six in cocoa trees were reported. They belonged to the genera Dysmicoccus Ferris, Ferrisia Fulaway, Nipaecoccus Sulc, Paracoccus Ezzat & Mc Conell, Phenacoccus Cokerell, Planococcus Ferri and Planococcoides Ezzat & Mc Connell. Of the species reported Dysmicoccus bispinosus, D. brevipes, Paracoccus marginatus, Planococcus citri, P. minor and Planococcus sp. coincided in both crops.

PREDATORY MITES: **AN ALTERNATIVE FOR THE CONTROL OF Thrips palmi KARNY (THYSANOPTERA: THRIPIDAE)**

Con el propósito de determinar la importancia de los ácaros depredadores en la regulación de las poblaciones de Thrips palmi, se realizó un total de 95 muestreos, en 23 cultivos diferentes, en el período comprendido entre mayo/1997 y diciembre/2000, en las provincias La Habana y Ciudad de La Habana. En todos los casos se extrajeron 25 hojas, preferentemente que presentaran daños de trips o 10 flores, si eran plantas ornamentales. Se determinó la riqueza de especies de los ácaros depredadores. En el cultivo de la papa (Solanum tuberosum), se compararon dos campos localizados en los municipios de San José de las Lajas y Güira de Melena, a través de índices ecológicos. Se realizaron, además, otras observaciones cualitativas y cuantitativas a nivel de campo y laboratorio. Se identificaron 24 especies de ácaros depredadores, pertenecientes a las familias Phytoseiidae, Blattisociidae, Ascidae y Laelaptidae. La familia mejor representada fue la Phytoseiidae con 20 especies, la mayoría de las cuales poseen hábitos generalistas. Se encontró en el campo de papa ubicado en San José de las Lajas, una mayor riqueza de especies y por tanto una mayor diversidad. Se discuten las implicaciones de estos resultados para el manejo de las poblaciones de T. palmi.

In order to determine the importance of predatory mites in the regulation of Thrips palmi populations, 95 samplings were carried out in 23 different crops from May 1997 to December 2000 in La Habana and Ciudad de La Habana provinces. Twenty five leaves or 10 flowers damaged with thrips were taken. Species richness of the predatory mites was determined. Two crops of Solanum tuberosum, localized in San José de las Lajas and Güira de Melena municipalities were compared through ecological indexes. Other qualitative and quantitative observations were carried out in field and laboratory. Twenty four predatory mite species belonging to Phytoseiidae, Blattisociidae, Ascidae and Laelaptidae family were identified. The Phytoseiidae family was the most representative with 20 species, generally with generalist food habit. San José de las Lajas potato crops presented the highest species richness and diversity. The implications of these results for T. palmi management are discussed.

COMPARISON OF DETECCTION LIMIT OF NUCLEIC ACID ANALYSIS METHODS FOR THE HOP STUNT VIROID (HSVd) IN CITRUS

Se determinó y comparó el límite de detección de la electroforesis secuencial en geles de poliacrilamida (sPAGE), hibridación de ácidos nucleicos (NASH) y transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para el diagnóstico del viroide del enanismo del lúpulo (HSVd) en cítricos, basados en el análisis de ácidos nucleicos de plantas de cidro y pepino como amplificadores biológicos. El límite de detección de la sPAGE fue mayor (5x10-3) en plantas de pepino que en plantas de cidro (5x10-2); sin embargo, este fue 50 veces menos sensible que el de la NASH (10-4). El límite de detección de la RT-PCR en pepino fue el mayor de todos los métodos analizados (10-6). Dicho valor se potenció cuando los productos de RT-PCR fueron detectados por NASH en lugar de electroforesis en geles de agarosa. La RT-PCR fue el más sensible de todos los métodos y su sensibilidad se incrementó cuando se combinó con la NASH. Sin embargo, la presencia de contaminaciones asociada a su alta sensibilidad constituye una problemática en el diagnóstico rutinario. Por su parte, la NASH es un método con una sensibilidad adecuada para las condiciones analizadas, su límite de detección fue superior al de la sPAGE, aunque menor que el de la RT-PCR.

The detection limit of sequence polyacrilamide gel electrophoresis (sPAGE), nucleic acid hybridization (NASH) and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was determined for the diagnosis of the hop stunt viroid (HSVd) in citrus hosts, using citron and cucumber plants as biological amplifiers. The detection limit of sPAGE was higher (5x10-3) when cucumber plants were analyzed than that using citron plants (5x10-2); however, it was 50 times less sensitive than that of NASH (10-4) by comparison. The RT-PCR detection limit for cucumber host was the highest (10-6) of all methods analyzed. This value was higher when the RT-PCR products were detected by NASH and no with agarose gel electrophoresis instead. RT-PCR was the most sensitive method and its sensitivity was increased when it was combined with NASH. However, the presence of contaminations associated with the high sensitivity of RT-PCR is a routine diagnosis problem. On the other hand, NASH is a method with a proper sensitivity under the conditions analyzed since the detection limit was higher than that of sPAGE, although slower than that of RT-PCR.

INFLUENCE OF THE HOST PLANT AND ITS INTERACTION WITH Meloidogyne incognita ON THE EFFECTIVENESS OF Pochonia chlamydosporia var. catenulata

El efecto de las plantas hospedantes y su interacción con Meloidogyne incognita (Kofoid y White) Chitwood sobre la efectividad de Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyscho ex Barron y Onions) Zare y Gams como agente de control biológico de nematodos formadores de agallas se estudió en condiciones de aisladores biológicos. Para el desarrollo de la experiencia se utilizaron diferentes especies de plantas que se cultivan en los sistemas intensivos de producción de hortalizas en Cuba y se evaluó la colonización de la rizosfera, a partir del conteo de UFC del hongo, en plantas sanas e infestadas por M. incognita. Los resultados demostraron que el crecimiento del hongo en la rizosfera varió en dependencia de la especie de planta. Entre los mejores hospedantes de P. chlamydosporia var. catenulata estuvieron la col, coliflor y acelga china, cultivos resistentes a M. incognita. Las plantas infestadas por M. incognita mostraron mayores niveles de colonización del hongo que las plantas sanas y el cultivo de la habichuela resultó ser un buen hospedante, en presencia del nematodo. Se recomienda la utilización de estos cultivos dentro de esquemas de rotación que incluyan la aplicación de P. chlamydosporia var. catenulata como agente de control biológico para el manejo de M. incognita en sistemas intensivos de producción de hortalizas.

The effect of the host plants and their interaction with Meloidogyne incognita (Kofoid and White) Chitwood on the effectiveness of Pochonia chlamydosporia var. catenulata (Kamyscho ex Barron and Onions) Zare and Gams as a biological control agent of root-knot nematodes was studied in glasshouse conditions. Different plant species from the Cuban Intensive Vegetable Production Systems were used to perform the experience. The growth of the fungus in the rhizosphere differed with the host plant. Among the best host plants of P. chlamydosporia var. catenulata were cabbage, salt-wort and cauliflower, resistant crops to M. incognita. The plants infested by M. incognita showed higher levels of fungus colonization than those healthy, and the kidney bean crop was a good host in the presence of the nematode. The use of these crops into rotation systems, with the application of Pochonia chlamydosporia var. catenulata as biological control agent for the management of M. incognita on Intensive Vegetable Production Systems, was recommended.

INFLUENCIA DE LA APLICACIÓN FOLIAR DEL BIOESTIMULANTE LIPLANT SOBRE ALGUNOS INDICADORES BIOLÓGICOS DEL SUELO: INFLUENCE OF LIPLANT BIOESTIMULANT SYSTEMATIC APPLICATION ON SOME SOIL BIOLOGICAL INDICATORS

presente trabajo tuvo como objetivo valorar el efecto del Liplant (Humus líquido de vermicompost), en su uso continuado, sobre la población microbiana del suelo y su actividad biológica. Se efectuaron tres experimentos, replicados durante dos años, con muestras representativas de un suelo Ferralítico Rojo Lixiviado en barbecho por más de 15 años, al que se le aplicó dosis extremas de Liplant, (diluciones de concentraciones de 1:10 y 1:20 v:v), similares a las que se utilizan para la bioestimulación de cultivos de ciclo corto. Se realizó el aislamiento, identificación y cuantificación de grupos de microorganismos del suelo, vermicompost y al producto Liplant. En los ensayos de antagonismo in vitro se utilizó el método de difusión en placas Petri. La actividad respiratoria se realizó a través del método de respirometría inducida. Se encontró tanto en el suelo, vermicompost y Liplant, grupos y géneros de microorganismos similares, su número y actividad biológica (respiración) no fueron modificados significativamente por la aplicación del producto en el período evaluado. Los microorganismos aislados del suelo no mostraron inhibición por la adición del Liplant, puro y en dilución 1:10 y 1:20, en ensayos in vitro. La presencia del Liplant en las concentraciones estudiadas a largo plazo (mayores de un año), favorece la fertilidad del suelo, mejora la humificación de la materia orgánica y la disponibilidad de fósforo para las plantas y el medio edáfico.

The aim of the present work was to value Liplant effect (vermicompost liquid Humus), in its continuous use, on the soil microbial population and their biological activity. Three experiments replicated during two years, were carried out using representative samples of a red ferralitic leached soil in fallow for more than 15 years, to which extreme doses of Liplant (dilutions 1:10 and 1:20 v:v concentrations), similar to those used for the biostimulation short cycle crops, were applied. Isolation, identification and quantification of groups of soil microorganisms, vermicompost and to the product Liplant were carried out. In the in vitro antagonism tests, the diffusion method was used. The activity was carried out through the induced respirometric method. Groups and goods of similar microorganisms were found either in soil, vermicompost or Liplant. Their number and biological activity (breathing) were not modified significantly by application of the product in the period evaluated. The isolated microorganisms of the soil did not show inhibition due to the addition of the pure Liplant and in dilutions 1:10 and 1:20 in vitro assays. The presence of Liplant in the studied long term concentrations (higher than one year) favors soil fertility, improves organic matter humification and makes phosphorus available for plants and edafic medium.

**BIOMASS PRODUCTION BY THE STRAIN Nr-003 OF Nomuraea rileyi (FARLOW) SAMSON IN DIFFERENT LIQUID MEDIA IN SHAKE CULTURE AND ITS VIRULENCE ON Spodoptera frugiperda (J.E. SMITH)**

Con el propósito de determinar la producción de biomasa del aislamiento Nr-003 de Nomuraea rileyi (Farlow) Samson se evaluó el efecto de cuatro medios de cultivos líquidos en agitación: caldo de boniato (B), boniato-extracto de levadura (BL), boniato- extracto de levadura-cloruro de calcio (BLC) y boniato-cloruro de calcio (BC). Se realizó también la dinámica de producción de biomasa sobre un sustrato de melaza- extracto de levadura. Se evaluó, además, la virulencia del aislamiento Nr-003 sobre larvas de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), determinándose las relaciones dosis-mortalidad, con los datos de los 7 días y tiempo-mortalidad, para la mayor de las dosis utilizadas, a través de un análisis de Probitas, calculándose los valores de dosis letal media (DL50) y el tiempo letal medio (TL50). El hongo creció bien en los cuatros medios utilizados aunque los mejores resultados se obtuvieron con el BL. En cuanto a la dinámica de crecimiento se determinó que este hongo forma masa seca a partir de las 12 horas, experimentando un rápido crecimiento a las 60 horas, siendo este más lento cuando adquiere el tiempo de 108 horas. Con relación a la prueba de virulencia se aprecia que la DL50 a las 168 horas es de 9.7x10(5) conidios.mL-1 y la TL50 para la mayor de las dosis utilizadas es de 111.5 horas.

With the purpose of determining the biomass production by the strain Nr-003 of Nomuraea rileyi (Farlow) Samson and its virulence on Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), the effect of four liquid media was evaluated in shake culture. They were sweet potato broth (B), sweet potato broth-yeast extract (BL), sweet potato broth-yeast extract-calcium chloride (BLC) and sweet potato broth-calcium chloride (BC). The biomass production dynamics on a molasses-yeast extract substrate was also studied. The virulence of the strain was assayed on S. frugiperda larva determining the relationships dose - mortality with the data of the seven days, and time _ mortality for the highest of the doses used through a Probit analysis calculating the values of the lethal dose (LD50) and the lethal time (LT50). A good fungus growth was obtained on the four culture media with the best results on BL. Regarding the growth dynamics, it was found that this fungus produced dry mass after the first 12 hours with a fast growth after 60 hours that became slower after 108 hours. The virulence test showed that the DL50 at 168 hours was 9.7 x 10(5) (conidia. mL-1) and the TL50 for the highest dose used was 111.5 hours (4.6 days).

**STABILITY OF IMI SD 187 Pochonia chlamydosporia var. catenulata STRAIN ON SOLID MEDIUM**

Un aspecto importante en el desarrollo de un microorganismo como agente potencial de control biológico es disponer de un método de conservación adecuado para la cepa seleccionada, sin afectación de sus características. Entre los métodos más usados se encuentra los subcultivos seriados. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de esta práctica sobre la cepa IMI SD 187 del hongo nematofago Pochonia chlamydosporia var. catenulata, a través del comportamiento de las enzimas proteasas. El estudio se desarrolló en medio sólido, a través de la medición del halo de degradación de la gelatina adicionada al medio, el crecimiento del hongo y el indicador Actividad Proteasa (AP), a diferentes días post inoculación. Se demostró que este método de conservación de cepas no afectó la producción de las proteasas, lo cual reafirma la robustez de la cepa analizada.

A safe conservation method not affecting the strain characteristics is essential for developing any microorganism as a potential biological agent. The serial subculture is one of the most used methods. The aim of this work was to find out the effect of this practice on protease production by the strain IMI SD 187 of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia var. catenulata. The study was carried out on solid medium by measuring the gelatine degradation halo, the fungal growth and the PA indicator (protease activity) at different days after inoculation. Adverse effects of serial subculture on protease production by the strain studied were not observed confirming the robustness of this strain.

In vitro **SELECTION OF PROMISSORY STRAINS OF Lecanicillium lecanii (ZARE AND GAMS) FOR THE BIOLOGICAL CONTROL OF Hemileia vastatrix (BERK. et Br.)**

El trabajo tuvo como objetivo la selección en condiciones de laboratorio de aislamientos promisorios de Lecanicillium lecanii (Zare y Gams) como agente de control biológico, a través de la aplicación del método heurístico que determina el peso de los valores biológicos y fisiológicos de cada aislamiento, tomando como plaga diana a Hemileia vastatrix (berk. et Br.) causante de roya de café. Este método novedoso en este tipo de estudio, permitió seleccionar el aislamiento Vl-01 como el de mejores atributos atendiendo a su crecimiento micelial en diferentes medios de cultivos, temperaturas y humedad relativa estudiadas, mejor esporulación en medios sólidos, porcentaje de parasitismo y deformación de uredosporas del fitopatógeno, por lo que resultó exitoso como herramienta de análisis para la selección.

The heuristic method determining the weight of the biological and physiological values of each isolate was used to select promissory strains of Lecanicillium lecanii (Zare and Gams) as biological control agents. The target pest was Hemileia vastatrix (Berk. et Br.) causal agent of coffee rust. This novel method in this type of study permitted the selection of V1-01 as the isolate with the best attributes according to its mycelium growth on different culture media at the temperature and relative humidity values studied, better sporulation on solid media, higher percentages of parasitism and deformation of the phytopathogen uredospores resulting successful as a tool of analysis for selection.

ENTOMOPATHOGENIC NEMATODE PRODUCTION AT THE NATIONAL PHYTOSANITARY REFERENCE CENTER FOR THE MOUNTAIN IN CUBA

Los nematodos entomopatógenos de los géneros Heterorhabditis y Steinernema constituyen eficientes agentes de control biológico de insectos. En Cuba se han estudiado y desarrollado diversas cepas de Heterorhabditis spp., los que se han empleado con éxito en el manejo de plagas. En el año 2005, personal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) transfirió la tecnología de reproducción de nematodos entomopatógenos sobre Galleria mellonella y la cepa nativa HC1 de Heterorhabditis bacteriophora al Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria para la Montaña (CNRFM) para su evaluación en el manejo de la broca del café (Hypotenemus hampei Ferrari). En los primeros tres meses se produjeron siete lotes de nematodos entomopatógenos, donde a partir del lote No. 4, se logró obtener una media de 190 000 JI larva-1, valor muy cercano al potencial reproductivo real de la cepa. En cuanto a la viabilidad (% de vivos), a partir del lote No. 2 el valor estuvo cercano al 90%. Como expresión de una exitosa transferencia el CNRFM produjo más de 291 millones de JI de H. bacteriophora cepa HC1. Los JI producidos mostraron ser patogénicos contra estadios larvales de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith), Diaphania hyalinata (L.) y Manduca sexta (L.) donde presentaron un 100% de mortalidad a las 48 horas.

The entomopathogenic nematodes belonging to Heterorhabditis and Steinernema genera are efficient biological control agents for insects. Several strains of Heterorhabditis spp. have been studied and developed in Cuba, and they have been used successfully in pest management. In 2005, specialists from the National Center for Animal and Plant Health (CENSA) transferred the technology for mass rearing of entomopathogenic nematodes on Galleria mellonella to the National Phytosanitary Reference Center for the Mountain (CNRFM), and the native strain HC1 of Heterorhabditis bacteriophora was used to be evaluated in coffee berry borer (Hypotenemus hampei Ferrari) management. Seven batches of entomopathogenic nematodes were produced in the first three months and mean yields of 190 000 IJ larvae-1 were obtained since batch No. 4, a value very close to the real productive potential of the strain. In relation to the viability (% of live juveniles), it was close to 90% since batch No. 2. As an indicator of a successful technology transfer, the specialists from CNRFM produced more than 291 millions of infestive juveniles (lJ) of the strain HC1 of H. bacteriophora. The lJ produced showed to be pathogenic to larvae of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), Diaphania hyalinata (L.) and Manduca sexta (L.) with 100% mortality at 48 hours.

ENTOMOFAUNA ASSCIATED TO SOYBEAN VARIETIES, Glycine max (L.): HARMFULNESS, POPULATION FLUCTUATION AND NATURAL ENEMIES OF THE PHYTOPHAGE COMPLEXES OF GREATER AGRICULTURAL INTEREST

ENCYRTIDS ASSOCIATED TO PSEUDOCOCCIDS, SELECTION AND REARING METHOD OF BIOLOGICAL CONTROL AGENT

**RATOON STUNTING DISEASE OF SUGARCANE (Leifsonia xyli subsp. xyli): IMPROVEMENT OF THE DIAGNOSTIC AND EVALUATION OF THE VARIETAL RESISTANCE**