Biotecnología Aplicada

Hepatitis C virus and lipid metabolism: their implications in vaccine development and treatment

The hepatitis C virus (HCV) infects over 170 million people worldwide and is a leading cause of chronic hepatitis and severe forms of liver damage as cirrhosis and hepatocellular carcinoma. There is no vaccine available against this pathogen and the current therapeutic option, based on the combination of pegylated interferon plus Ribavirin, is expensive, produces undesirable side effects, and is effective in approximately half of the patients treated. HCV establishes a complex and not completely understood interaction with the host. In addition to its variability and interference with the immune system function, the HCV life cycle is closely associated with lipid metabolism and this relationship contributes to viral persistence. The present review analyzes the current state of the art in this association and the disturbances generated, mainly expressed as intracellular lipid accumulation in hepatocytes and increased oxidative stress with negative consequences in the immune response. Moreover, the potential impact on the development of vaccines and more effective therapeutic interventions against this virus, in the context of the disorders in lipid metabolism, is discussed. Finally, perspectives for rational intervention, taking into account the dependence of HCV to lipid metabolism, and potential targets, are evaluated.

El virus de la hepatitis C (VHC) infecta a más de 170 millones de personas globalmente y es la causa principal de hepatitis crónica y formas graves de daño hepático, como cirrosis y carcinoma hepatocelular. No existe vacuna disponible contra este patógeno y la terapia actual que se basa en la combinación de interferón pegilado más Rivabirina provoca efectos secundarios y solo es efectiva en aproximadamente la mitad de los pacientes tratados. El VHC establece una compleja interacción con el hospedero que aún no ha sido completamente caracterizada. El ciclo de vida del VHC se relaciona estrechamente con el metabolismo lipídico, lo que junto a su variabilidad genética e interferencia con el funcionamiento del sistema inmune contribuye a la persistencia viral. En esta revisión se analiza el estado del arte de tal interacción, así como las alteraciones que provoca, fundamentalmente la acumulación de lípidos en los hepatocitos y el incremento del estrés oxidativo, con la consiguiente afectación a la respuesta inmune. Además, se discute el impacto potencial para el desarrollo de vacunas e intervenciones terapéuticas contra el VHC en el contexto de un metabolismo lipídico alterado. También se abordan las perspectivas para una intervención racional de la infección, teniendo en cuenta la dependencia del VHC en el metabolismo lipídico y los blancos potenciales de tales procedimientos.

Glycosylation and Bioinformatics: current status for glycosylation prediction tools

Glycosylation is an important co-and post-translational modification involved in a variety of critical biological processes. The development of computational algorithms for protein glycosylation prediction has been propelled in the latest years. The localization of potential glycosylated sites facilitates the rational alteration of glycosylationrelated functions in cells. This manuscript gives an overview of current available bioinformatics resources and databases for glycobiology, focusing on glycosylation predictors. As a complement, general features about the different glycosylation types are also exposed.

El desarrollo de algoritmos computacionales para la predicción de sitios potenciales de glicosilación en las proteínas ha sido impulsado en los últimos años. La glicosilación constituye una modificación co-y post-traduccional involucrada en una gran variedad de procesos biológicos críticos. La localización de los sitios potenciales de glicosilación facilita la modificación racional de las funciones relacionadas con la glicosilación en las células. Este manuscrito resume el estado actual de las herramientas bioinformáticas y las bases de datos disponibles para la glicobiología, haciendo énfasis en los predictores de glicosilación. Además, como complemento se incluyen las principales características de los diferentes tipos de glicosilación.

The Sticholysin I mutants St I E2C and St I R52C show similar binding to liposomal vesicles but differ in their permeabilizing activity

The mechanism of pore formation by actinoporins is a multistep process, involving binding of water soluble monomer to membrane and subsequent oligomerization of monomers on the membrane surface, forming a functional pore. However, molecular details of membrane insertion mechanism and oligomerization are not clear. A phosphocholine-binding site and a surface cluster of aromatic rings, together with a basic region, are important to the initial interaction with membrane and the N-terminal region is relevant in the pore formation. Aiming to deepen into the structure-function relationship in sticholysins, we designed and produced two Cys mutants of recombinant sticholysin I (rSt I) in relevant functional regions for membrane interaction: St I E2C (in the N-terminal region) and St I R52C (in the membrane binding site). Conformational studies suggested that the replacement of Glu-2 and Arg-52 by a Cys residue in rSt I not noticeably changes protein conformation as assessed by fluorescence and CD spectroscopy, the first change not affecting toxins permeabilizing ability. The relative decrease in the pore forming capacity of St I R52C is not related with a smaller binding capacity of this mutant to membrane. In summary, St I E2C and St I R52C retain the main conformational properties of the wild type and show similar binding to liposomal vesicles while differing in their permeabilizing activity. St I E2C and St I R52C constitute good tools to study those steps of the permeabilizing mechanism of sticholysins that take place after binding to membrane, using thiol-specific probes such as fluorescent and spin labels.

El mecanismo de formación de poros de las actinoporinas es un proceso de varias etapas hasta la formación de un poro funcional. Se requiere un sitio de unión a fosfocolina, un grupo de anillos aromáticos y una región básica, para la interacción inicial con la membrana. La región N-terminal es relevante para la formación del poro. En este trabajo se diseñó y obtuvo dos mutantes de Sticolisina I (St I) con Cys en regiones funcionalmente relevantes para la interacción con membranas: St I E2C (en la región N-terminal) y St I R52C (en el sitio de unión a membranas). El reemplazo de los residuos Glu-2 y Arg-52 por Cys no produce cambios notables en la conformación de St I, según determinaciones de fluorescencia y espectroscopía de dicroísmo circular. El primer cambio no afectó la actividad permeabilizante. La disminución relativa en la capacidad formadora de poros en St I R52C no se vincula a su menor capacidad de asociación con la membrana. St I E2C y St I R52C conservan las principales características conformacionales de St I nativa y muestran similar capacidad de unión a vesículas liposomales, mientras que difieren en cuanto a actividad permeabilizante. Estos dos mutantes son herramientas útiles para estudiar los pasos de los mecanismos de permeabilización de las Sticholisinas, en especial los que ocurren tras su unión a las membranas, mediante el uso de sondas específicas para grupos tiol tales como indicadores fluorescentes y del momento del espín.

Using reibergrams to evaluate the intrathecal synthesis of C3c and C4 in children affected with Neisseria meningitidis meningoencephalitis

Meningococcal meningoencephalitis was a serious pediatric health problem in Cuba before the successful introduction of a Cuban vaccine against Neisseria meningitidis. The present paper assesses the role of the complement system in this disease in unvaccinated sick children, using a novel methodology developed by the authors. Seven children were used, of an average of 5.8 years of age with N. meningitidis meningoencephalitis diagnosed by traditional microbiological methods. Serum and cerebrospinal fluid samples were obtained at the same time point, and used to quantify major immunoglobulins, IgG subclasses, C3c, C4 and albumin by radial immunodiffusion with commercially available plates. No C3c was found in one of the two deceased patients. Measurable intrathecal synthesis of C3c was observed in the remaining patients, however, intrathecal synthesis of C4 was found in all patients, as demonstrated with the corresponding reibergrams. The measurement of the intrathecal synthesis of these components of the complement system is useful for discriminating immunodeficiencies and to better understand the behavior of the disease.

La meningoencefalitis por Neisseria meningitidis afectó sensiblemente a la población infantil cubana antes de la exitosa campaña con la vacuna producida en Cuba contra esta bacteria. El objetivo del presente trabajo es evaluar, por medio de métodos novedosos desarrollados por los autores, el papel del sistema de complemento en el desarrollo de la enfermedad en niños con la enfermedad que no fueron vacunados. Siete niños con edad promedio de 5.8 años con meningoencefalitis por N. meningitidis, diagnosticados por los métodos microbiológicos tradicionales. Las muestras de suero y líquido cefalorraquídeo se obtuvieron simultáneamente y se cuantificaron las inmunoglobulinas mayores, las subclases de IgG, C3c, C4 y la albúmina por inmunodifusión radial en placas comerciales. Uno de los dos pacientes que fallecieron no poseía C3c en tales líquidos biológico s. Se observó síntesis intratecal de C3c en los otros pacientes y síntesis intratecal de C4 en todos los pacientes estudiados, lo cual se demostró a partir de los correspondientes reibergramas diseñados en Cuba para estos componentes del sistema de complemento. La determinación de la síntesis intratecal de estos componentes del sistema de complemento es útil para discriminar inmunodeficiencias y entender el comportamiento de la enfermedad.

Diagnostic value of alpha-fetoprotein for hepatocellular carcinoma

Hepatocellular carcinoma (HCC) variously occupies the fifth or sixth position as the most frequent neoplasia worldwide. The present work used alpha-fetoprotein (AFP) determinations on the ultra-micro analytical system (SUMA®) as a tumoral marker in 189 cirrhotic patients evaluated at the Center for Medical and Surgical Research between January 1999 and September 2005. The principal factors associated to increases in AFP were HCC and viral cirrhosis. In all, 22 patients (11.64%) suffered from HCC, with viral cirrhosis caused mainly by hepatitis C virus infections as the most important etiological factor. AFP as a tumoral marker displayed a sensitivity of 68.18% and a specificity of 92.17%, which increased to 86.36 and 100% respectively when combined with abdominal sonography. It is concluded that AFP is valuable for the diagnosis of HCC.

El carcinoma hepatocelular (CHC) es la quinta y sexta neoplasia más frecuente en el mundo. En este trabajo se empleó la alfa-fetoproteína (AFP) por la técnica del sistema ultramicroanalítico (SUMA®), como marcador tumoral en 189 pacientes cirróticos evaluados en el Centro de Investigaciones Médico-Quirúrgicas (CIMEQ), entre enero de 1999 y septiembre de 2005. Los principales factores que se asociaron a una elevación de la AFP fueron el CHC y la cirrosis viral. Veintidós enfermos presentaron CHC (11.64%) y la causa más importante fue la cirrosis hepática viral, principalmente por el virus de la hepatitis C. Este marcador tumoral mostró una sensibilidad de 68.18% y una especificidad de 92.17%. Al combinarlo con la ecografía abdominal, se incrementó la sensibilidad a 86.36% y la especificidad a 100%. Se concluyó que la AFP tuvo valor en el diagnóstico del CHC.

Comparison of three methods for DNA extraction from paraffin-embedded tissues

DNA extraction from paraffin-embedded tissue (PET) is a critical step for many molecular techniques. Several protocols have been carried out for this objective according to the literature. In the present study, the performances of three DNA extraction methods from PET were compared to establish the optimal protocol for our laboratory. Ten lymph nodes from ten patients dying of AIDS were investigated. Histological and bacteriological studies were performed in lymph nodes samples. DNA was extracted using three methods: boiling for 20 minutes in distilled water (Method A); boiling for 30 minutes in 5% Chelex-100 resin solution (Method B) and a 4-hours lasting proteinase K digestion (Method C). PCR with specific sequence (IS 6110) were evaluated for the identification of Mycobacterium tuberculosis in PET. The DNA extract by the three methods was degraded. Statistical differences were observed when three DNA extraction methods were compared according to the purity of extracted DNA. Only with Methods B and C successful amplification was obtained. The last method (C) was the more time consuming of all. These results demonstrated that the Chelex-100 DNA extraction method (Method B), which uses a quelating resin, is useful as a routine method to achieve DNA extraction with good enough quality and quantity in a short period of time from PET. Method B is a good option in molecular pathology research.

La extracción de ADN de tejidos embebidos en parafina (TEP) es crucial en muchos estudios moleculares. Varios han sido los protocolos utilizados para conseguir tal propósito. En esta investigación se compararon tres métodos de extracción de ADN con la finalidad de seleccionar uno para el trabajo en nuestro laboratorio. Se tomaron diez ganglios linfáticos de diez fallecidos por sida, para su estudio histológico y bacteriológico. El ADN se extrajo por calentamiento a 100 °C (método A); con el empleo de resina quelante Chelex-100 (método B) y por digestión con proteinasa K (método C). Para la identificación de Mycobacterium tuberculosis se amplificó una región de la secuencia específica de inserción IS 6110, mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El ADN de los TEP se obtuvo degradado, con diferencias significativas de pureza. Solo se logró amplificación con los métodos B y C; este último fue el más laborioso. El método que requirió resina quelante Chelex-100 (método B) fue el más útil: se obtuvo ADN con calidad y cantidad suficiente en un menor tiempo. Por tanto, este método puede ser considerado como una buena opción en patología molecular.