Biotecnología Aplicada

Uses of immunoglobulin A in the control of the infectious diseases

The main door of entrance for most of pathogens is the mucosal route. As known, one of the main immunological elements at this level is the immunoglobulins and within them, immunoglobulin A (IgA) is the most abundant. Its role in the protection against different pathogens has been demonstrated from observations in experimental models and humans, where its effect was evaluated from the prophylactic and therapeutic points of view. However, there are still many infectious diseases for which the role of IgA has not been studied so far and this field remains open for future research and potential applications to diseases for which there are no efficient methods of control. Here we focus on accumulative evidences of the uses of IgA in the control of infectious diseases, derived from experimental observations in animal models and humans. The main source of information was derived from papers published related with the subject, included in Pubmed and Google Scholar databases.

La principal puerta de entrada de la mayoría de los microrganismos patógenos es la vía mucosal. Uno de los principales protagonistas inmunológicos en este nivel son las inmunoglobulinas, y entre ellas, prevalece la inmunoglobulina A (IgA). Su función en la protección contra varios patógenos se ha demostrado a partir de la evaluación de sus efectos profiláctico y terapéutico en modelos experimentales y en seres humanos. Sin embargo, aún existen muchas enfermedades infecciosas para las cuales no se ha estudiado la función de la IgA. Por tanto, el campo de aplicaciones de esta inmunoglobulina en enfermedades para las que no existen eficientes métodos de control, permanece abierto a futuras investigaciones. Este artículo trata acerca de las evidencias acumuladas sobre el uso de la IgA para el control de las enfermedades infecciosas, a partir de observaciones experimentales en modelos animales y seres humanos. La información se obtuvo tras la consulta de artículos científicos sobre la temática indizados en las bases de datos Pubmed y Google Académico.

Potential applications of Bacillus subtilis strain SR/B-16 for the control of phytopathogenic fungi in economically relevant crops

Countries all over the world have experienced the negative impact that phytopathogenic fungi and oomycetes have on food security. Controlling these organisms remains a daunting task due to their genetic plasticity and the large temporal and geographic variability of their populations, which enables them to evolve and develop pesticide-resistant variants despite the considerable effort spent on developing disease-resistant varieties. One strategy for the control of plant diseases is that of biological control using natural enemies of these pests, such as rhizobacteria of the Bacillus and Pseudomonas genera. Bacillus subtilis, in particular, is characterized by the extracellular secretion of a number of antibiotics, microbial lipopeptides and hydrolytic enzymes such as chitinases and proteases that can be harnessed for the control of phytopathogens. The present review describes and examines the advantages and potential applications of B. subtilis strain SR/B-16, originally isolated from the rhizosphere of organically farmed ornamental plants, for the biological control of fungal phytopathogens attacking commercially important crops. In vitro challenging of phytopathogenic fungi with SR/B-16 has demonstrated that the antifungal activity of the latter has a broad spectrum, due to the secretion of metabolites producing structural and ultrastructural changes on the fungal cell. In addition, strain SR/B-16 efficiently colonizes the rhizosphere, which confers it advantages as a potential biopesticide and biofertilizer. Therefore, this microorganism may promote plant growth both by increasing the availability of nitrogen and phosphorous in agricultural soils and by controlling fungal phytopathogens.

El impacto negativo de los hongos y oomycetes fitopatógenos es una amenaza importante para la seguridad alimentaria en varios países. El control de tales microrganismos se dificulta por su mutabilidad genotípica y espaciotemporal y su capacidad adaptativa, que les permite desarrollar variedades resistentes a plaguicidas. Las estrategias en ese sentido incluyen el control biológico con el empleo de microrganismos enemigos naturales, como las rizobacterias de los géneros Bacillus y Pseudomonas. La especie Bacillus subtilis se puede utilizar a través de la producción extracelular de antibióticos, lipopéptidos antimicrobianos y enzimas hidrolíticas, como las quitinasas y las proteasas. En este artículo se describen las potencialidades de la cepa autóctona Bacillus subtilis SR/B-16, aislada a partir de rizosfera de cultivos fertilizados con substrato orgánico, para el control de hongos fitopatógenos en cultivos de importancia económica. La interacción in vitro de la cepa SR/B-16 con estos microrganismos ha evidenciado su actividad antifúngica de amplio espectro, que se expresó mediante la excreción de metabolitos causantes de alteraciones en la estructura y la ultraestructura fúngica. La bacteria SR/B-16 posee propiedades que le permiten colonizar la rizosfera, por lo que se puede utilizar como bioplaguicida y también como biofertilizante. Este microrganismo puede contribuir al crecimiento de las plantas, por el aumento de la disponibilidad de nitrógeno y fósforo en los suelos agrícolas y el control de enfermedades fúngicas.

Genetic stability of micropropagated banana plants (Musa spp.) with non-traditional growth regulators

Cytogenetic and molecular markers (isozymes and DNA) techniques are very important to monitor the genetic stability of the material obtained by in vitro culture, because in many occasions the micropropagated plants usually produce non-normal regenerating plants or somaclonal variants of the origin cultivars. The aim of this work was to evaluate the genetic stability of banana (Musa spp.) plants of the 'FHIA-18' (AAAB) clone obtained in vitro. The cytogenetic, isoenzymatic and RAPD analyses were carried out in plants at the late acclimatization phase and in vitro propagated with brassinosteroids analogues (Biobras-6-ABr) or oligogalacturonides mixture with polymerization grade between 9 and 16 (Pectimorf-mOLG). Plants cultured in vitro without ABr or mOLG treatment, but either under indolebutyric acid (IBA), indole acetic acid (IAA) or 6-bencyl aminopurine (6-BAP), were used as controls, and field-grown mother plants of this cultivar. Two additional treatments were also used, one applied to plants cultured in vitro under ABr during all the developmental phases, and the other one under mOLG. The results showed that the ABr and mOLG did not induce genetic variability in the regenerants obtained, remaining constant the chromosomes number of the specie (2n = 4x = 44). Twenty-nine bands were obtained with the isozymes and twenty-seven with RAPD, all monomorphic.

Las técnicas citogenéticas y de marcadores moleculares (isoenzimas y ADN) son útiles para verificar la estabilidad genética de material obtenido por cultivo in vitro, pues en muchas ocasiones en las plantas micropropagadas brotan regenerantes anormales o variantes somaclonales de las variedades de origen. El objetivo de esta investigación fue evaluar la estabilidad genética de plantas de banano (Musa spp.) clon 'FHIA-18' (AAAB) obtenidas in vitro. Se cometieron análisis citogenéticos, isoenzimáticos y técnicas de amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), luego de la fase de aclimatización de plantas propagadas in vitro, con un análogo de brasinoesteroides (Biobras-6-ABr) o una mezcla de oligogalacturónidos, cuyo grado de polimerización estaba entre 9 y 16 (Pectimorf-mOLG). Como control se emplearon plantas del cultivo in vitro que no tenían ABr ni mOLG; pero que contenían ácido 3-indolbutírico (AIB), ácido 3-indolacético (AIA) o 6-bencilaminopurina (6- BAP), y plantas madre de esta variedad provenientes del campo. También se emplearon dos tratamientos adicionales: en uno, las plantas procedían del cultivo in vitro con el ABr en todas sus fases, y en el otro, se empleó la mOLG. Los resultados mostraron que estos tratamientos no indujeron variabilidad genética en los regenerantes, ya que el número de cromosomas de la especie se mantuvo constante (2n = 4x = 44). Con las isoenzimas se obtuvieron 29 bandas y con los RAPD, 27 bandas; todas monomórficas.

Yield improvement of the sea lice MY32/Cr novel antigen production and IgM immune response characterization in Oreochromis niloticus as a model

Sea lice cause over 300 million € annual losses in salmon aquaculture-leading countries and most treatments consist of chemicals, with their limitations regarding the generation of parasite resistance, environmental damage and high costs. Researches about fish vaccines against sea lice as a method for controlling parasites have been accomplished; however there is no commercial vaccine available up to date against this pest. It could be due to an insufficient immunological and protective response of the selected antigen or to the lack of appropriate/suitable process for its production with commercial perspectives. Previously, the gene coding for the akirin protein of Caligus rogercresseyi (MY32/Cr) was cloned. It was produced recombinant in Escherichia coli and it showed 57 % of protection in a vaccination-challenge experiment against sea lice infestation in salmon. In the present study, the MY32/Cr yield was improved up to four fold in fermentation process by testing different culture media. It was also studied the effect of this novel antigen, for a potential vaccine, on humoral immune response of tilapia (Oreochromis niloticus). It was observed that the immunization with MY32/Cr elicited a statistically significant IgM antibody response after a double injection of the recombinant protein. The process obtained is a suitable method, an essential tool as a first step to produce this recombinant antigen at commercial scale. The results suggest that the MY32/Cr protein may be used as a target to be tested in salmon, for developing of a vaccine to control sea lice infestations in fish; and that the administration of a single booster dose could be useful to improve antibody response.

Las pérdidas anuales provocadas por el piojo de mar en los países líderes en la acuicultura salmonera superan los 300 millones de euros. La mayoría de los tratamientos emplean compuestos químicos, con sus limitaciones de generación de resistencia en los parásitos, el potencial daño al medioambiente y sus altos costos. A pesar de los estudios en peces sobre vacunas contra esta plaga como un posible método de control, no existe actualmente ninguna vacuna comercial. Esto pudiera deberse a que los candidatos estudiados no han mostrado un respuesta inmunológica y protectora suficiente, o a la carencia de un proceso apropiado para su producción con perspectivas comerciales. Previamente, se clonó el gen que codifica para la proteína akirin de Caligus rogercresseyi (MY32/Cr). Esta se produjo de forma recombinante en Escherichia coli, y mostró un 57 % de protección contra la infestación por piojo de mar en un estudio de vacunación-reto en salmón. En el presente trabajo se mejoró la productividad de MY32/Cr hasta cuatro veces mediante procesos de fermentación empleando diferentes medios de cultivo. También se estudió el efecto de este nuevo antígeno como preparado vacunal sobre la respuesta inmune humoral en tilapia (Oreochromis niloticus). La inmunización provocó una respuesta de anticuerpos IgM estadísticamente significativa después de la reinmunización con MY32/Cr. El proceso obtenido constituye un método eficiente como premisa esencial para la producción de este antígeno recombinante a escala comercial. Los resultados sugieren que la proteína MY32/Cr podría ser empleada como antígeno blanco para evaluaciones en salmón, con vistas a desarrollar una vacuna para el control de las infestaciones por piojo de mar en peces. La administración de una dosis de reinmunización resultaría útil para mejorar la respuesta inmune mediada por anticuerpos.

Recombinant hybrid proteins from pertactin type 1 and 2 of Bordetella pertussis are more immunogenic in mice than the original molecules

The present study explores the concept of hybrid pertactin (PRN) molecules for immunizing against Bordetella pertussis. New molecules were designed using an additive/inclusive approach that comprehends the complete sequences/ regions of two different types of pertactin (Prn). PRN molecules bear the two variable R1 regions from Prn1 and Prn2. The genes of Prn1, Prn2 and six variants of PRN were cloned in Escherichia coli, and PRN proteins were over-expressed at 25-30 % of total protein concentrations using the pET28a/BL21 Codonplus RP expression system. The proteins were purified (> 90 % purity) using the His-tag /Ni-NTA affinity method with amounts of 8-10 mg/g of wet biomass. After refolding, the PRNs were recognized by anti-Prn monoclonal antibodies that bind protective conformational and linear epitopes/regions. Moreover, a panel of ten sera from individuals boosted with a commercial vaccine reacted with the PRN molecules without differences from the P.69 protein. The PRN proteins were highly immunogenic in Balb/c mice, with the induction of the IgG2a and IgG2b subtypes. Particularly, two PRNs (PRN2-lc-1 > PRN2-1) induced highly significant anti-Prn1 antibody levels (p < 0.001). Moreover, the PRN2-lc-1 induced higher levels of antibodies (p < 0.05) against epitopes located at the immunodominant N-terminus region and the variable region R1. The PRN2-lc-1 and PRN2-1 molecules exhibited an enhanced immunological profile in Balb/c mice in terms of level of whole anti-Prn IgG antibodies in respect to natural Prn controls. These two molecules constitute valuable candidates for further evaluation in vivo in acellular vaccine formulations.

En este estudio se exploró el concepto de moléculas híbridas de pertactina (PRN) para inmunizar contra Bordetella pertussis. Se diseñaron nuevas moléculas mediante un método aditivo/inclusivo que comprendió las secuencias completas/regiones de dos pertactinas (Prn). Las moléculas PRN portan las dos regiones variables R1 de Prn1 y Prn2. Se clonaron los genes de Prn1, Prn2 y seis variantes de PRN en Escherichia coli. Las PRN se sobre-expresaron a 25-35 % de la concentración de proteínas totales, con el uso del sistema de expresión pET28a/BL21 Codonplus RP. Se purificaron por el método de afinidad His-tag /Ni-NTA proteínas con más del 90 % de pureza, con rendimientos de 8-10 mg/g de biomasa. Tras la reconstitución, las PRN fueron reconocidas por anticuerpos monoclonales anti-Prn contra epitopos y regiones conformacionales y lineales, involucrados en la respuesta inmune protectora. Un panel de 10 sueros de individuos reactivados con una vacuna comercial reaccionaron con las moléculas PRN a niveles similares a los obtenidos con la proteína P.69. Las proteínas PRN fueron altamente inmunogénicas en ratones Balb/c, e indujeron respuesta de anticuerpos IgG2a e IgG2b. Dos proteínas PRN (PRN2-lc-1 > PRN2-1) indujeron niveles significativos de anticuerpos (p < 0.05) contra epitopos localizados en el extremo N-terminal inmunodominante y en la región variable R1. Estas dos proteínas mostraron un perfil de respuesta potenciada de anticuerpos (anticuerpos IgG totales antiPrn) en ratones Balb/c comparadas con los controles de Prn. PRN2-lc-1 y PRN2-1 son valiosos candidatos para evaluaciones posteriores in vivo, como parte de formulaciones de vacunas acelulares.

Stoichiometry equation to describe the growth of the Pleurotus ostreatus ceba-gliie-po-010606 strain

This work was aimed at developing a proximate stoichiometric equation to describe the growth of Pleurotus ostreatus mushroom strain ceba-gliie-po-010106 on picking beans (Phaseolus vulgaris) waste. Empirical formulas were established for the residue of fresh dried picking beans (CH1.81O0.81N0.15) and the biomass of the fungal strain (CH1.83O0.84N0.26). The elemental composition of these materials and the ashes was determined. The stoichiometric coefficients obtained further supported the estimation of parameters relevant for fungal growth characterization: theoretical biological efficiency (867.49 g of fungal dry matter (FDM)/kg of substrate dry matter), mean coefficient of breath (0.77 CO2/mol O2 consumption), specific air consumption (1.36 m3/kg FDM) and metabolic heat (16 576.47 kJ/kg FDM).

Se desarrolló una ecuación estequiométrica aproximada que describe el crecimiento de la cepa ceba-gliie-010106 de Pleurotus ostreatus sobre residuos de la cosecha del fréjol (Phaseolus vulgaris). Se establecieron fórmulas empíricas para el residuo del fréjol fresco seco (CH1.81O0.81N0.15) y la biomasa de la cepa del hongo (CH1.83O0.84N0.26). Para ello se determinó la composición elemental de estas materias primas y su contenido de cenizas. Los coeficientes estequiométricos permitieron estimar parámetros relevantes del proceso de crecimiento; entre ellos: la eficiencia biológica teórica (867.49 g de materia seca del hongo (MSH)/kg de materia seca del sustrato), el coeficiente medio de respiración (0.77 mol CO2/mol O2), el consumo específico de aire para el proceso de crecimiento (1.36 m3/kg MSH), así como el calor metabólico (16 576.47 kJ/kg MSH).

Isolation and partial purification of a hemolytic sphingomyelin-inhibitable fraction from the sea anemone Anthopleura nigrescens

Actinoporins are highly hemolytic pore-forming proteins with a molecular mass of around 20 kDa and high affinity for sphingomyelin-containing membranes. On the crude extract of the sea anemone Anthopleura nigrescens, hemolytic activity (HA) was detected. In order to identify the presence of pore-forming proteins similar to actinoporins in this anemone, the fractionation and analysis of its crude extract was carried out. The aqueous extract of the whole body was subjected to gel filtration chromatography on Sephadex G50 medium rendering three resolved peaks (P-I, P-II, and P-III) as measured by their absorbance at 280 nm. Functional characterization of the crude extract and chromatographic fractions was evaluated by HA against human red blood cells. The crude extract and two peaks (P-II and P-III) showed HA. Interestingly, the HA of the crude extract and P-II were specifically inhibited by small unilamellar vesicles of phosphatidylcholine: sphingomyelin (1:1). Both the crude extract and P-II revealed the existence of at least one protein band around 20 kDa by SDS-PAGE. The inhibition by sphingomyelin of the whole body extract HA and the localization of this property in P-II that could be associated with a protein of around 20 kDa suggest the presence of at least one novel actinoporin in A. nigrescens. Furthermore, this is the first report of a biochemical activity for this sea anemone. Work is in progress in order to purify and characterize the molecular entities responsible for this HA inhibited by sphingomyelin.

Las actinoporinas son proteínas formadoras de poro, altamente hemolíticas, de aproximadamente 20 kDa, con una elevada afinidad por las membranas que contienen esfingomielina. En el extracto crudo de la anémona marina Anthopleura nigrescens se detectó actividad hemolítica (AH). Con el fin de identificar la presencia de proteínas formadoras de poros, similares a las actinoporinas, se fraccionó y analizó este extracto crudo. Se sometió a cromatografía de filtración en gel de Sephadex G50 medio, y se obtuvieron tres picos resueltos (P-I, P-II y P-III), según su absorbancia a 280 nm. La caracterización funcional del extracto y las fracciones cromatográficas se evaluaron por la AH frente a eritrocitos humanos. El extracto crudo y los picos II y III mostraron AH. Curiosamente la AH del extracto crudo y del pico II fueron inhibidas por vesículas unilamelares pequeñas de fosfatidilcolina: esfingomielina (1:1). Tanto el extracto crudo como P-II revelaron al menos una banda proteica de alrededor de 20 kDa, en SDS-PAGE. La inhibición por esfingomielina de la AH del extracto y la localización de esta propiedad en P-II, podría asociarse con una banda proteica de alrededor de 20 kDa, lo que sugiere la presencia de al menos una actinoporina en A. nigrescens. Este es el primer informe de una actividad bioquímica para esta anémona marina. Se continúa trabajando para purificar y caracterizar las entidades moleculares responsables de esta AH inhibida por esfingomielina.

Isolation and cloning of the Phytolacca americana anti-viral protein PAP-I gene

The pokeweed antiviral protein (PAP) isolated from Phytolacca americana and Phytolacca acinosa plants, inhibits protein translation by catalytically removing a specific adenine residue from the large rRNA of the 60S subunit of eukaryotic ribosomes. In this study, the P. americana PAP-I gene was isolated and sequenced, and further compared to other ribosome-inactivating proteins (RIPs) genes previously reported in GenBank(r). Total DNA was extracted from the late summer leaves of P. americana. A polymerase chain reaction (PCR) 868 bp-long DNA product was obtained, using gene specific primers, based on the expected gene size. The eluted product was purified and cloned into the pTZ57R/T vector, and mobilized into the Escherichia coli strain DH5a. After sequencing, the analysis of the PAP-I PCR product showed 98 to 82 % nucleotide and amino acid 94 to 26 % homologies, respectively, compared to previously reported RIPs. A phylogenetic analysis confirmed that the amplified PAP-I gene corresponds to the single chain Type-I RIP (PAP-I).

La proteína antiviral del ginseng (PAP), aislada de plantas de Phytolacca americana y Phytolacca acinosa, inhibe la traducción proteica mediante la remoción catalítica de un residuo de adenina específico, en la cadena mayor de la subunidad 60S del ARN ribosomal eucariótico. En este estudio se aisló y secuenció el gen PAP-I de P. americana, y posteriormente se comparó con los genes de otras proteínas inactivadoras de ribosomas (RIP), reportadas en GenBank(r). Se extrajo el ADN total de las hojas tardías del verano de las plantas de P. americana y el fragmento de 868 pb correspondiente al ADN del gen se amplificó con el uso de cebadores específicos, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El producto de la PCR eluido se purificó, se clonó en el vector pTZ57R/T, y se movilizó en células de Escherichia coli cepa DH5a. Tras la secuenciación del producto de la PCR del gen PAP-I, la secuencia mostró una homología nucleotídica de 98 a 82 % y aminoacídica de 94 a 26 %, con las RIP reportadas. El análisis filogenético confirmó que el gen amplificado corresponde a la RIP tipo I de simple cadena (PAP-I).

Conference report: "30 years of HIV science. Imagine the future"

This report present major topics and debates of the symposium "30 years of HIV science. Imagine the future". It was organized by the Pasteur Institute, the U.S. National Institutes of Health, Agence Nationale de Recherche sur le Sida (ANRS) and SIDACTION in celebration of the 30th years since the identification of the human immunodeficiency virus (HIV) as causative agent of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Held in Paris, France, it was sponsored by the Pasteur Institute in Paris on May 21-23, 2013. The novel results presented and fruitful discussions at the meeting provided a glance on the goals for HIV research in the near future.

Se describen los temas y debates fundamentales del simposio "30 años de ciencia sobre el VIH. Imaginando el futuro", organizado por el Instituto Pasteur, los institutos nacionales de salud de los Estados Unidos de América, la Agencia Nacional para la Investigación sobre el Sida (ANRS) y SIDACTION, en celebración del tiempo en que se identificó el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) como agente causal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida. Se celebró en París, del 21 al 23 de mayo de 2013, con el auspicio del propio Instituto Pasteur. Los novedosos resultados presentados y las provechosas discusiones proporcionaron una panorámica que favorecerá los objetivos de las investigaciones en un futuro cercano.