Biotecnología Aplicada

Quantitative polymerase chain reaction of gene expression in the preclinical and clinical development for anticancer drugs

En la aparición del cáncer influyen factores físicos, químicos y biológicos que alteran el genoma de los individuos. Esta enfermedad afecta la morbilidad y la mortalidad en países desarrollados y en Cuba. El proceso de desarrollo de medicamentos es largo, costoso y con un índice de fallo mayor en cáncer que en otras enfermedades. Por ello se continúan investigando diagnosticadores con elevada confiabilidad, para conocer el posible éxito de nuevos candidatos terapéuticos, desde las etapas más tempranas del desarrollo preclínico y clínico. Así, la decisión de emplearlo o desecharlo no se tomaría en las etapas finales del desarrollo, cuando se han gastado varios recursos. Los diagnosticadores genómicos son evaluadores indirectos de la respuesta a medicamentos, menos costosos y más fáciles para determinar y específicos que los diagnosticadores proteómicos en el cáncer. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa se ha empleado para determinar la expresión de ácidos ribonucleicos codificantes y la confirmación y validación de diagnosticadores genómicos. En este artículo se discuten su alta sensibilidad y especificidad, las posibilidades de automatización, y su empleo independiente o complementario a tecnologías genómicas de alto flujo, para la obtención de medicamentos anticancerosos en países en desarrollo. La reacción en cadena de la polimerasa puede aplicarse con una adecuada relación beneficio-costo en distintas etapas de este proceso, y en la confección de bases de datos farmacológicas y toxicológicas más confiables. Ello favorecerá el conocimiento de esta enfermedad para la generación de medicamentos más seguros y eficaces.

Cancer starts from changes in the individual’s genome which are caused by physical, chemical or biological factors. This complex disease increases the mortality and morbidity variables in developed countries, and also in Cuba. Anticancer drug development is a long and expensive process, with a failure rate higher than in other diseases. For that reason, some biomarkers are being implemented for a more efficacious prediction of new therapeutic candidates at early phases of preclinical or clinical development. Then, decision making on stopping or proceeding with a biologically active compound does not applies to final phases of development when a great amount of resources has been spent. Genomic biomarkers are surrogate indicators to measure drug response in the cancer, and also cheaper, of easier analysis and more specific than proteomic biomarkers. In this context, the quantitative polymerase chain reaction (qPCR), has been used to determine gene expression and to confirm and validate other genomic biomarkers. Here we discuss its high analytical sensitivity and specificity, and its possible automation for high throughput analysis of the expression of coding RNA. qPCR could be used alone or complementary to high flow genomic technologies for anticancer drug development in developing countries. Its increased use will be determined by an adequate cost-benefit ratio at the different phases, the generation of more reliable pharmacological and toxicological databases and by increasing the knowledge on this disease to obtain safer and more efficacious drugs.

Collection of Salmonella typhimurium strains for genotoxicologic and anti-genotoxicologic evaluation

Homologous recombination is a DNA repair mechanism that additionally generates a biological diversity. Most of our knowledge about it was obtained from assays that used double strand ends as initiators of recombination. The present work is aimed at evaluating homologous recombination in bacteria, using an assay based on the segregation of chromosomal duplication. This assay measures exchanges between sister strands without favoring any pathway. A collection of strains of Salmonella enterica serovar typhimurium deficient in genes coding for proteins involved in homologous recombination was built. We evaluated spontaneous (SSR) and UV-induced segregation rate (UV-ISR). We demonstrated that the absence of RuvC resolvase did not affect SSR, while defects in RecA, RecQ and RecB/RecF decreased it and the lack of SbcCD or RuvAB stimulated it. In RecB null mutants, lesions that are not commonly sensed by RecFOR seem to have been recognized and repaired by this pathway. The methodology supported the corroboration of a RecA-independent pathway in Salmonella and suggests the existence of alternative recombination pathways in recB/recF double mutants.

La recombinación homóloga es un mecanismo de reparación del ADN que adicionalmente genera diversidad biológica. Casi todo nuestro conocimiento acerca de ella proviene de ensayos que emplean extremos de doble cadena como iniciadores de recombinación. En este trabajo se evaluó la recombinación homóloga en bacterias, mediante un ensayo de segregación de duplicaciones cromosomales que mide los intercambios entre cadenas de cromátidas hermanas sin favorecer ninguna ruta de reparación. Se construyó una colección de cepas de Salmonella enterica serovar typhimurium deficiente en genes que codifican proteínas involucradas en la recombinación homóloga. Se evaluó las tasas de segregación espontáneas (SSR) e inducidas por luz ultravioleta (UV-ISR). Se demostró que la ausencia de la resolvasa RuvC no afecta la SSR, mientras que los defectos en RecA, RecQ y RecB/RecF la disminuyen y la carencia de SbcCD o RuvAB la estimulan. En mutantes nulos para RecB, las lesiones que usualmente no son detectadas por el sistema RecFOR parecen ser reconocidas y reparadas por esta vía. La metodología usada permitió corroborar la existencia de una ruta independiente de RecA en Salmonella y sugiere la existencia de rutas alternativas de recombinación para el doble mutante recB/recF.

High glucose burden inhibits EGFR/PI3K/AKT1/mTOR signaling pathway in cutaneous fibroblasts

Diabetic healing failure is the clinical expression of countless molecular and cellular disorders having hyperglycemia as the proximal trigger. The fibroblast is a critical building-block cell type for the healing process. Under high glucose concentrations fibroblasts physiology is perturbed. The epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling system is crucial for different healing events. We examined the effect of high glucose burden on healthy-donor' cutaneous fibroblasts proliferation, so as the EGFR autophosphorylation on a critical tyrosine residue, along with the activation of downstream signaling pathways proximal to cyclin D1 expression. Fibroblasts were cultured in 15 % FBS at either 5 (normal glucose) or 35 (high glucose) mM under standard culture conditions. Concurrent osmotic control was included. After 6 days of incubation under high glucose, doubling time was calculated. Cells suspensions were plated, fixed and immunolabelled with antibodies directed to phosphorylated forms of EGFR (Y1197), AKT1 (S473) and mTOR (S2448), and native forms of PI3K p85 alpha subunit and cyclin D1. The ratio of cells positive to the diaminobenzidine/peroxidase reaction was calculated and its intensity estimated according to published methodologies. High glucose concentration significantly increased doubling time 5-fold, as compared to cells grown in physiological conditions. Hyperglycemia reduced the constitutive EGFR autophosphorylation. Accordingly, PI3K was also significantly attenuated. Downstream switches AKT1 and mTOR were also affected and very significantly on the signal intensity. Cyclin D1 expression was completely abrogated due to high glucose burden. Collectively, these data suggest that high glucose exposure hinders fibroblasts proliferation by disrupting the EGFR/PI3K/AKT1/mTOR/Cyclin D1 axis.

La fisiología de los fibroblastos, esenciales para la cicatrización, se perturba ante altas concentraciones de glucosa. Se estudió el efecto de altas cargas de glucosa sobre la proliferación de fibroblastos cutáneos de donantes sanos a través de la cascada de señalización del factor de crecimiento epidérmico (EGFR): la autofosforilación del EGFR y la activación de intermediarios de la transducción hasta la ciclina D1. Los fibroblastos se cultivaron durante seis días en condiciones estándar con SFB al 15 %, y glucosa a 5 mM (glucosa normal) o 35 mM (glucosa alta). Se incluyó un control osmótico concurrente. Tras seis días se estimó el tiempo de duplicación. Las suspensiones celulares se sembraron, fijaron e inmunomarcaron con anticuerpos específicos contra las formas fosforiladas de EGFR (Y1197), AKT1 (S473) y mTOR (S2448), y las formas nativas de la subunidad p85 alfa de la PI3K y la ciclina D1. Se calculó la proporción de células positivas a la reacción de diaminobenzidina/peroxidasa, y su intensidad según procedimientos estándar. Las altas concentraciones de glucosa multiplicaron en 5 veces el tiempo de duplicación comparado con el de células cultivadas en condiciones fisiológicas. También redujo la autofosforilación constitutiva del EGFR, atenuó significativamente la subsiguiente fosforilación de PI3K y muy significativamente la de sus intermediarios de transducción AKT1 y mTOR. La expresión de la ciclina D1 se abolió ante las altas cargas de glucosa. Los resultados sugieren que la exposición a altas concentraciones de glucosa afecta la proliferación de los fibroblastos al perturbar el eje de transducción EGFR/PI3K/AKT1/mTOR/Ciclina D1.

Application of a colorimetric CTLL-2 cell proliferation assay for the evaluation of IL-15 antagonists

Dysregulated expression of Interleukin (IL)-15 has been associated to several autoimmune and inflammatory diseases. In this sense, some agents that inhibit IL-15 activity have been developed as possible drugs to treat these pathologies. We have been working in two strategies to inhibit IL-15 activity, a peptide (named P8) that binds to the alpha subunit of the IL-15 receptor (IL-15R) and a vaccine based on active immunization with human IL-15 (hIL-15). To measure the biological activity of the IL-15 antagonists we used the proliferation assay in CTLL-2, a cell line that depends on IL-2/IL-15 to proliferate. In the current work we defined the conditions of the assay to determine the half maximal inhibitory concentration (IC50) of the P8 peptide and the neutralizing titers of the sera from monkeys immunized with the anti-IL-15 vaccine. The specificity of the assay for IL-15 was documented using anti-IL-15 and anti-IL-2 specific antibodies. We also examined the specificity of the antagonists of IL-15 in presence of IL-2; neither the peptide nor the sera inhibited the cell proliferation induced by human IL-2. Finally, we evaluated the effect of commercial antibodies anti-hIL-15 and sera from mice immunized with hIL-15 on murine IL-15 (mIL-15). In this case, neither the antibodies nor the sera inhibited mIL-15; therefore, murine models are not useful to evaluate the effectiveness of anti-hIL-15 vaccine.

La expresión no regulada de la interleucina-15 (IL-15) se ha asociado con el desarrollo y patogénesis de varias enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Se han desarrollado numerosos agentes que inhiben la actividad de la IL-15 como posibles fármacos para el tratamiento de estas patologías. Nosotros hemos trabajado en dos estrategias para inhibir la actividad de la IL-15, un péptido (llamado P8) que se une a la subunidad alfa del receptor de IL-15 y una vacuna basada en la inmunización activa con IL-15 humana (IL-15h). La actividad biológica de los antagonistas de IL-15 se midió mediante el ensayo de proliferación en CTLL-2, una línea celular que depende de IL-2/IL-15 para proliferar. En este trabajo se definieron las condiciones del ensayo para determinar la concentración inhibitoria media máxima (CI50) del péptido P8 y los títulos de neutralización de los sueros de monos inmunizados con la vacuna anti-IL-15. La especificidad del ensayo para la IL-15 se demostró usando anticuerpos específicos anti-IL-15 y anti-IL-2. También se examinó la especificidad de los antagonistas de IL-15 en presencia de IL-2, y se demostró que ni el péptido ni los sueros inhiben la proliferación celular inducida por IL-2 humana. Finalmente, se evaluó el efecto de anticuerpos comerciales anti-IL-15h y de sueros de ratones inmunizados con IL-15h sobre la IL-15 murina (IL-15m). Ni los anticuerpos ni los sueros inhiben la IL-15m, lo que indica que los modelos murinos no son útiles para evaluar la efectividad de la vacuna anti-IL-15h. Este ensayo permitió evaluar diferentes estrategias que inhiben la actividad de la IL-15 para su futuro desarrollo como fármacos.

On the negotiation of biotechnology products that include intangible assets

In biotechnology, products negotiations are imposed by the intangible component associated to them, which can be either due to the strength of the patent, its novel technology or the fact that these concern research and development projects, at the different stages of development of a biotech product. This paper covers some general topics on negotiations that are included in any process: negotiation stages, strategies, principles and settings. An explanation is also given on the negotiation of intangible assets: patents, trademarks, technologies and commercial rights, the meaning of upfront fees and royalties on sales. The results of the analysis of a sample of the negotiations in BioCubaFarma (the Cuban biotechnology and pharmaceutical industries group) with intangible assets are given and compared to another study of a sample representing more than 1500 negotiations of biotechnology companies occurring between 1998 and 2003. The conclusions of the comparison show that the upfront fees in this sector are in the same range as the international negotiations of the study taken as a reference. In the case of royalties, the average percentage is very close to the international mean. The analyses show that within the negotiations associated with intangible assets in BioCubaFarma there is a prevalence of licensing agreements for co-development and subsequent marketing, followed by distribution agreements. Finally, the most frequently used business models in the Cuban biotechnology industry are described.

La negociación de los productos biotecnológicos es impuesta por el componente intangible asociado, ya sea por fortaleza de patente, por tener tecnología novedosa o por tratarse de proyectos de investigación y desarrollo, en las diversas etapas del desarrollo de un producto. En este artículo se describen los elementos comunes a cualquier proceso negociador: las etapas de la negociación, las estrategias, los principios y escenarios. Además se ofrece una explicación acerca de la negociación de los activos intangibles: patente, marca, tecnología y derechos comerciales, qué son los pagos precomerciales y las regalías sobre las ventas. Se exponen los resultados del análisis de una muestra de negociaciones con activos intangibles en BioCubaFarma (grupo cubano de las industrias biotecnológicas y farmacéuticas), y se compara con otro estudio de una muestra representativa de más de 1500 negocios de compañías biotecnológicas, sucedidos entre 1998 y 2003. De la comparación se concluye que los pagos precomerciales en el sector se mueven en el mismo rango de las negociaciones internacionales del estudio tomado como referencia. En el caso de las regalías, la media de su porcentaje es muy cercana a la media internacional. El propio análisis arroja que entre los negocios con activos intangibles asociados en BioCubaFarma predominan los acuerdos de licencia para codesarrollo y posterior comercialización, seguidos por los acuerdos de distribución. Finalmente se describen los modelos de negocios más usados en la industria biotecnológica cubana.

Perinatal screening and data processing with the SUMA(r) technology in Cuba

La tecnología SUMA(r) o sistema ultramicroanalítico se emplea en las pesquisas perinatales, la vigilancia epidemiológica y la certificación de la sangre, para posibles enfermedades o malformaciones congénitas. Su empleo soluciona la necesidad de tener medios de diagnóstico en los programas de salud en Cuba. El tamiz perinatal con la tecnología SUMA(r), por ejemplo, es esencial para el buen funcionamiento del Programa Maternoinfantil cubano. Detecta los niveles de la alfafetoproteína en cada embarazada, para determinar posibles alteraciones, hepatitis B o virus de inmunodeficiencia humana, y tratar de evitar su trasmisión al feto o al recién nacido. Los programas posnatales la usan para la pesquisa de hipotiroidismo congénito, fenilcetonuria, hiperplasia adrenal congénita, galactosemia y déficit de biotinidasa en el recién nacido, y tratar de evitar el retraso mental o la muerte. Strips Reader Software, registrado en el Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos (Cecmed), materializa los fundamentos teóricos del diagnóstico SUMA(r). Es una herramienta para el análisis, el cálculo y la interpretación de los resultados de los estuches de diagnóstico y para el procesamiento de los datos que ofrecen los equipos de medición. Constituye una metodología implementada con un algoritmo, que incluye el tratamiento de los ensayos de la tecnología SUMA(r) y ofrece un diagnóstico certero. Esta tecnología cubana ha llegado a varios países latinoamericanos y a Angola. En este artículo se describen algunos elementos relativos al procesamiento de los datos en el tamiz perinatal con la tecnología SUMA(r) y a su soporte informático.

SUMA(r) technology (Ultra Micro Analytical System) is applied to the pre-natal, neo-natal, epidemiological surveillance and blood certification screenings, thus solving the country's needs to own diagnostic means to undertake such programs. It is integrated by diagnostic kits, measurement and software equipment leading to procedures and the know-how. In Cuba, perinatal screening is essential for the functioning of the pre-natal and the post-natal programs within the Mother and Child Program. The Pre-natal program is performed to each pregnant woman: Alphafetoprotein to study alterations during pregnancy, Hepatitis B, and HIV to avoid the transmission of these diseases to the fetus or the newly-born. The Post-natal screening detects Congenital Hyperthyroidism, Phenylketonuria, Congenital Adrenal Hyperplasia, Galactosemia, and Biotinidase Insufficiency to each newly-born, thus avoiding mental retardation, or death. Computation Strips Reader Software support (registered by Cecmed) materializes the theoretical fundaments of SUMA(r) diagnostics; it consists of a tool destined to the analysis, calculus and interpretation of results for the diagnostic kits and the processing of data supplied by the measurement equipment. It is a methodology of our own, implemented in an algorithm, which includes the treatment for the SUMA(r) technology assays, offers work safety and reliability, thus obtaining a safe diagnostics. The system has allowed several countries, such as México, Venezuela, Colombia, Ecuador, Nicaragua, Bolivia, Argentina, and Angola, among others, may have access to it. Some elements related to the processing of data with SUMA(r) technology in perinatal screening, and the computation support contributed by technology for such purposes will be discussed in this work.

Remarks on the Conference HIV pathogenesis, virus versus host, Alberta, Canada, March 9-14, 2014

Combined anti-retroviral therapy has been really efficient in suppressing HIV replication, but it does not cure the infection. This is due to the permanency of integrated viral DNA in the infected cells. To achieve the HIV cure, the interaction between virus and its host needs to be extremely understood. Because of this, scientific community persists in dedicating efforts to profoundly comprehend the pathogenesis of this virus. The present work summaries important aspects discussed in the last meeting HIV-Pathogenesis, Virus vs. Host. It was held in Fairmont Banff Springs, Banff, Alberta, Canada, March 9-14. The conference debated the latest advances in the biology of HIV-1. Topics as virus entry into the cell, into the host, virus exit, virushost genetics and co-evolution, host-virus interactions and responses, reservoirs, latency, reactivation, HIV and central nervous system, animal models and HIV and the microbiome at the mucosa were updated and deeply discussed. In parallel HIV vaccines: Adaptive Immunity and Beyond meeting was celebrated. The event, part of the Keystone Symposia Global Health Series, was a singular opportunity to analyze the state of HIV research and the new challenges in the battle against HIV infection.

La terapia antirretroviral combinada ha sido muy eficiente en suprimir la replicación del VIH, pero no cura la infección. Esto se debe a la presencia de ADN viral integrado en las células infectadas. Para lograr la cura del VIH, debe entenderse profundamente la interacción entre el virus y su hospedero. Es por ello que la comunidad científica dedica esfuerzos a comprender en detalle la patogénesis de este virus. El presente trabajo resume aspectos relevantes discutidos en la Conferencia Patogénesis del VIH, Virus contra Hospedero, la cual se celebró en Fairmont Banff Springs, Banff, Alberta, Canadá, entre el 9 y el 14 de marzo del año 2014. En ella se discutieron los últimos avances en la biología del VIH como: la entrada del virus a la célula, entrada al hospedero, la salida del virus, genética virus-hospedero y co-evolución, interacciones virus-hospedero y respuestas, reservorios, latencia, reactivación, VIH y sistema nervioso central, modelos animales así como la microbioma en la mucosa. El evento se celebró de manera simultánea con la Conferencia Vacunas VIH: Más allá de la inmunidad adaptativa. Ambos escenarios constituyeron una oportunidad magnífica para analizar el estado de la investigación del VIH y los nuevos retos en la batalla contra la infección.

Rational design of an antitumor peptide based on the 32-51 region of the Limulus anti-LPS factor protein obtained from a chemical library

In previous work, we identified the peptide comprising amino acids 32-51 on the antimicrobial protein limulus anti-LPS factor (LALF) from Limulus poliphemus, based on its capacity to bind to the bacterial lipopolysaccharide (LPS). In this study, we designed a chemical peptide library by alanine scanning from the sequence of the LALF32-51 peptide. Four new peptides, named L-2, L-8, L-12 and L-20 by the Ala residue substituted in the given position of the LALF32-51 peptide, were identified as retaining their penetrating activity but also showing antitumor effects when subcutaneously administered in female C57Bl/6 mice after the implantation of malignant TC-1 lung epithelial cells. They significantly increased animal survival (p < 0.05) as compared to LALF32-51. The substitution of Tyr residue to Ala at position 2 in the peptide sequence enhanced the cytotoxic effect, while residues Phe8, Lys12 and Trp20 were essential for the antitumor activity. Moreover, the administration of the L-2 peptide significantly reduced tumor growth in comparison to PBS- or L-20 peptide-treated lung TC-1 cells in C57Bl/6 mice. L-2 was found to deregulate the tumor cell cycle and induces apoptosis, through mechanisms affecting glycolytic and protein biosynthesis pathways. It also significantly increased survival in human colon cancer LS-174T xenotransplanted nude mice for up to 32 days, two of the animals being tumor free. The L-2 peptide could serve as peptide-based prototype drug with potential to reduce tumor load or could be coadministered with conventional chemotherapy. This research granted the 2013 Award of the Cuban National Academy of Sciences.

En este estudio se diseñó una biblioteca química de péptidos mediante el barrido de alanina del péptido LALF32-51, derivado de la proteína antimicrobiana factor anti-LPS de Limulus poliphemus (LALF) con capacidad de unión al lipopolisacárido bacteriano (LPS). Se identificaron cuatro nuevos péptidos, L-2, L-8, L-12 y L-20 con el residuo Ala en la posición indicada en cada caso, que retuvieron la penetrabilidad celular original y mostraron actividad antitumoral al ser administrados en ratones C57Bl/6 a los que previamente se implantó tumores malignos TC-1 de células epiteliales de pulmón. Los péptidos incrementaron significativamente la supervivencia de los animales en comparación con el LALF32-51 (p < 0.05). La sustitución por Ala en la posición 2 incrementó el efecto citotóxico, y en sustitución de los residuos Phe8, Lys12 y Trp20, evidenció la importancia de estos para la actividad antitumoral del péptido. La administración del L-2 redujo significativamente el crecimiento tumoral respecto al tratamiento con PBS o con L-20 en células TC-1 de ratones C57Bl/6. Este péptido desreguló el ciclo celular e indujo apoptosis en las células tumorales, mediante mecanismos que afectaron a las rutas de la glicólisis y la biosíntesis de proteínas, e incrementó significativamente a 32 días la supervivencia de ratones desnudos xenotrasplantados con células LS-174T de cáncer de colon humano. El péptido L-2 puede ser un prototipo de fármaco peptídico con potencial para reducir la carga tumoral o que se pueda coadministrar con la quimioterapia convencional. Este trabajo mereció el Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba para el año 2013.