Revista de Salud Animal

ALGUNOS CONCEPTOS RELACIONADOS CON LOS ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS (OGMS)

Hoy resulta un hecho cierto, una de las promesas de la Biotecnología: la obtención de nuevos alimentos a partir de manipulaciones de genes que confieren a estos, nuevas propiedades. Sin embargo, su uso ha creado una serie de preocupaciones con respecto a los posibles riesgos que pueden representar para el hombre y para el medio ambiente por lo que ha sido necesario establecer un fuerte marco regulatorio y la necesidad de implementar técnicas que permitan su detección con alto grado de sensibilidad y especificidad. En el presente artículo se hace un análisis de la situación actual de los alimentos OGM y su bioseguridad.

Today, one of the promises of Biotechnology: the obtaining of new foods from manipulations of genes conferring them new properties, is a real fact. Nevertheless, their use has created some concerns with respect to the possible risks they can represent for humans and environment. That is why, it has been necessary to establish a strong regulatory frame and the necessity to implement techniques allowing their detection with high sensitivity and specificity degree. In the present review, the current situation of the GMO foods, their detection and their biosafety are analyzed.

¿CÓMO SUPERAR LA MEMBRANA CELULAR?

Con el propósito de poder introducir moléculas en el interior de la célula, superando su barrera natural, se han desarrollado diferentes procedimientos de gran utilidad en los estudios de biología molecular y celular, entre los que podemos citar: Técnicas de permeabilización celular, Técnicas de Microinyección, Técnicas Transfección celular y Técnicas de Transducción. La elección de uno u otro método depende en gran medida del objetivo final del experimento y de la disponibilidad de equipamiento adecuado. En esta revisión se abordan los métodos de laboratorio empleados para la introducción de moléculas en el interior de las células y se discuten las ventajas y desventajas de los mismos.

In order to introduce molecules into cells, different useful procedures have been developed in molecular and cellular biology studies. Among them we have: permeabilization, microinjection, cellular transfection, and transduction methods. The selection of the best method depends on the experiment final purpose and the equipment available. In this review we approach the laboratory methods used to introduce molecules into cells with a special emphasis in their advantages and disadvantages.

DISEÑO DE UN ENSAYO DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PARA LA DETECCIÓN DE Herpesvirus bovino tipo 1

Se describe el diseño de un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de herpesvirus bovino tipo 1 (HVB-1). Este se basó en la amplificación de una porción del gen tk viral, para lo cual se ensayaron diferentes concentraciones de los cebadores, de cloruro de magnesio y diferentes temperaturas de alineamiento. Además, se evaluaron los parámetros de desempeño analítico, sensibilidad y especificidad, con resultados satisfactorios. Bajo las condiciones óptimas se logró la amplificación de la banda de 202 pb esperada y se demostró la utilidad del ensayo para la identificación de aislados.

The design of a Polymerase Chain Reaction (PCR) assay for the detection of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) was described. This one was based on the amplification of a portion of the viral tk gene, for which different concentrations of primers, magnesium chloride and different annealing temperatures were tried. In addition, the parameters of analytical performance, sensitivity and specificity were evaluated with satisfactory results. Under the optimal conditions, the amplification of the band 202 pb expected was obtained, and the utility of the test for the identification of isolates was demonstrated.

RELACIÓN ENTRE EL TAMAÑO DE ESTRUCTURAS FETALES Y EL TIEMPO DE GESTACIÓN EN BÚFALAS DE RÍO

Se analizó un total de 28 búfalas en edades comprendidas entre 4 y 8 años, con un peso promedio de 580 a 690 kg. El conceptus fue examinado transrectalmente cada 7 días usando un equipo de ultrasonografía ALOKA-SSD-500, tiempo Real modo B, acoplado a un transductor lineal de 5 MHz. El estudió se realizó a partir del décimo día postmonta, donde se registró el comienzo del primer latido cardíaco, así como la detección por vez primera del saco amniótico. Semanalmente se midió el largo del conceptus y de la vesícula gestacional hasta el día 73. El embrión se observó a los 22.5 ± 3.5 días/ promedio y midió 6 mm hasta 46 mm de largo desde su aparición hasta los 73 días. El primer latido cardiaco se detectó a partir del día 28. El crecimiento de la vesícula gestacional en el área de la localización del embrión fue desde 5 mm en el día 22.5 ± 3.5 hasta 116 ± 3.8 mm del día 60. Se concluye que estos parámetros pueden ser utilizados para monitorear el desarrollo fisiológico de la gestación en búfalas de Río de la raza Bufalypso.

A total of 28 Buffalypso buffaloes with ages between 4 and 8 years old, and weight average from 580 to 690 kg was used in this study. The conceptus was examined every 7 days using a Ultrasound ALOKA-SSD-500 Real time B Mode equipped with a linear transducer of 5 MHz. The study was carried from the tenth day postbreeding, registering the beginning of the first heartbeat, as well as detection for first time of the amniotic vesicle. Conceptus and gestational vesicle long (until the day 73) was registered. Embryo was observed for the first time between 19 to 23 days, as average to the 22.5 3.5 days and its measurement was 6 mm until 46 mm on the day 73. The first heartbeat was detected in the 28th day. The gestational vesicle growth in the area of the embryo localization was from 5 mm in the day 22.5 ±3.5 up to 116 ±3.8 mm in the day 60. It is concluded that these parameters can be used for monitoring the pregnancy physiological development in Buffalypso water buffaloes.

**VARIACIÓN DE PARÁMETROS BIOLÓGICOS EN Anocentor nitens (ACARI: IXODIDAE) EN RELACIÓN CON EL HOSPEDERO**

Un aspecto importante en el estudio de un parásito es conocer cómo varían sus parámetros biológicos en dependencia del hospedero sobre el cual se desarrolla. Se trabajó con dos grupos de hembras repletas de Anocentor nitens, 93 de ellas obtenidas de bovinos y 99 de equinos. Las adultas se pesaron en una balanza analítica y se dispusieron en subgrupos a dos temperaturas 26°C y 32°C y cuatro humedades relativas 100, 80, 75.5 y 70%, para un total de ocho combinaciones de temperatura y humedad relativa para las garrapatas de bovinos e igual número de combinaciones para las garrapatas de equinos; se colocaron de 10 a 12 hembras por variante. En todos los grupos se determinó la eficiencia de la puesta (peso de la puesta/ peso de la hembra repleta, en porcentaje) y la duración de la pre-eclosión (desde la caída de la hembra repleta hasta la emergencia de las primeras larvas). Se comparó la eficiencia de la puesta en garrapatas de equinos y bovinos por un análisis de varianza trifactorial, donde los factores fueron temperatura, humedad relativa y especie hospedera; un análisis similar se realizó para la duración de la pre-eclosión. Para la comparación múltiple de medias se realizó la prueba de Duncan, tanto para la eficiencia de la puesta como para la pre-eclosión. El hospedero influyó en el peso que alcanzó la hembra en la repleción y en su eficiencia reproductiva. La duración de la pre-eclosión fue similar en las garrapatas de ambos hospederos.

An important subject of parasite biology is the influence of host on biological parameters. The work was carried out with two groups of engorged Anocentor nitens ticks, one of them fed on bovines ( 93 ticks) and the other on equines (99 ticks). The ticks were weighed in an analytical balance. Each group was divided in eight subgroups (10 to 12 ticks per subgroup) and incubated at two temperatures, 26 °C and 32°C and four relative humidities, 100, 80, 75.5 and 70 %. In each subgroup, laying efficiency (total egg mass weight/female weight, in percentage) and pre-eclosion period (from the beginning of incubation to the eclosion of the first larvae) were studied. The layer efficiency of the two main groups was compared by a three factor variance analysis, being the factors temperature, relative humidity and host species. A similar test was carried out to compare pre-eclosion. Duncan test was employed for multiple mean comparisons in both variables. The host species had an influence on the weight of engorgement and on the laying efficiency. Pre-eclosion was not afected by the host.

DIFERENCIAS DE PESO ENTRE Boophilus microplus (IXODOIDEA:IXODIDAE) DE BRASIL Y DE CUBA

Weights of engorged females and recently molted adults Boophilus microplus (both females and males) from Cuba and Brazil were compared by means of t-Student tests. It was observed that Brazilian ticks were always significantly heavier than those from Cuba. Some comments about the possible causes, significance of observation and further researches to be performed are offered.

Key words: ticks; weight; Boophilus; Ixodoidea; Ixodidae

Se comparó el peso de hembras repletas y adultos recién mudados (hembras y machos) de Boophilus microplus de Cuba y de Brasil mediante pruebas de t de Student. Se observó que las garrapatas de Brasil fueron siempre significativamente más pesadas que las de Cuba. Se comenta sobre las posibles causas y significado de este fenómeno y de las futuras investigaciones a realizar.

CLONAJE MOLECULAR Y EXPRESIÓN DEL GEN QUE CODIFICA PARA LA PROTEÍNA ESTRUCTURAL DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD INFECCIOSA DE LA BOLSA, VP3

El virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (IBDV), un miembro de la familia Birnaviridae, es un virus ARN de doble cadena, capaz de causar considerables pérdidas económicas al inducir destrucción de la bolsa, inmunosupresión y alta mortalidad en pollos jóvenes. La cápsida del virus está formada por las proteínas estructurales VP2 y VP3. Se amplificó por PCR el gen vp3 (870pb), a partir del vector pcDNA3-Poly que contiene el gen que codifica para la poliproteína (pVP2-VP4-VP3) del virus. El producto de PCR se clonó en el plásmido pQE30 y se expresó en la cepa M15 de E. coli a altos niveles como una proteína de fusión con una cola de hexahistidina. Así se obtuvo una proteína antigénicamente activa, como se demostró por Western-Blot con un anticuerpo policlonal contra el virus, con un peso molecular aproximado de 32kDa. Se describió un protocolo para extraer la proteína en forma soluble, acoplado a un eficiente sistema de purificación en un solo paso, basado en la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados, mediante el cual se obtuvo un producto con un 90% de pureza. En conejos se generaron sueros de altos títulos de anticuerpos contra la VP3 recombinante capaces de reconocer tanto a la proteína recombinante, como a la proteína nativa del virus. Son necesarios experimentos posteriores para evaluar el potencial de estos anticuerpos en el monitoreo de la expresión de la VP3 o la poliproteína del virus en otros sistemas heterólogos.

Infectious bursal disease virus (IBDV), a member of the Birnaviridae family, is a double stranded RNA virus that causes considerable economic losses in the poultry industry by inducing bursal destruction, immunosuppression and high mortality in young chickens. Viral capsid is formed by two structural proteins, VP2 and VP3. The vp3 gene (870pb) was amplified by PCR from the vector pcDNA3-Poly containing the gene that encodes for virus polyprotein (pVP2-VP4-VP4). The PCR product was cloned into pQE30 vector. The cloning was screened by PCR using vp3 primers. The gene was expressed as a his-tag fusion protein in M15 E. coli strain. The recombinant protein molecular weight was about 32kDa. The protein was recognized by Western-Blot using an antibody against the virus. Using an ion metal affinity chromatography procedure, a 90% pure recombinant product was obtained. In rabbits, high-titer antibodies against the recombinant VP3, able of recognizing both, the recombinant and native VP3, were obtained. The potential use of these antibodies for VP3 or virus polyprotein expression screening in heterologous systems should be further evaluated.

MULTIPLICACIÓN DE UN AISLAMIENTO CUBANO DEL VIRUS DE LA GASTROENTERITIS TRANSMISIBLE EN DIFERENTES LÍNEAS CELULARES

In this study we report a wide range of cells from different species, in which a Cuban TGE isolate multiplies. Both primary cultures and continuous cell lines from different species were used. We found out that 11 from the 13 kinds of cultures assessed were sensitive to the Cuban isolate, which not only showed an expected affinity to cells from porcine origin, but also it was able to replicate and produce a cytopathic effect in cells from bovine, hamster, monkey and quail origin.

En esta investigación reportamos un amplio rango de células de diferentes especies donde se multiplica un aislado cubano del virus de TGE, para lo cual se utilizaron tanto cultivos primarios como líneas celulares continuas, originadas de distintas especies animales. Se determinó que 11 de los 13 tipos de cultivos evaluados fueron susceptibles a la multiplicación del aislado cubano, el cual no mostró afinidad única por las células de origen porcino, ya que fue capaz de multiplicarse y producir efecto citopático en células de bovino, hámster, mono y codorniz.

**EVALUACIÓN DE LA CORTEZA DE Rhizophora mangle L. CON FINES BIOMÉDICOS PROCEDENTES DE LA ZONA OCCIDENTAL DE CUBA**

Cuban mangroves constitute the 5% of the country surface and they are distributed in the whole coast of the island. One of the species represented is Rhizophora mangle L. (red mangrove). From the bark of this plant, new drugs for human and veterinary use have been obtained. All the areas studied in the western region showed values of soluble substances (>14.5 mg/ml); ash (< 12%); total tannins (>6 mg/ml) and percentage of polymerized polyphenolic compounds (PPC) (>90%). Rhizophora mangle bark can be collected in every season. It is stable for more than one year when being stored in polyethylene sacks in a fresh place at room temperature (25 ± 5°C) with a relative humidity between 70-90%.

Los manglares cubanos constituyen el 5% de la superficie del país y se encuentran distribuidos en todo el litoral de la isla, una de las especies representada es Rhizophora mangle L. (mangle rojo) y a partir de la corteza de esta planta, se han obtenido nuevos medicamentos para uso humano y veterinario. Todas las zonas estudiadas en la región occidental mostraron valores de sólidos solubles totales(>14.5 mg/ml); ceniza (< 12%); taninos totales (>6 mg/ml) y porcentaje de compuesto polifenólico polimerizado (>90%) La corteza de Rhizophora mangle L. puede recolectarse en cualquier época del año y es estable por más de un año cuando se almacena en sacos de polietileno en un lugar fresco a temperatura ambiente (25 ± 5°C) con una humedad relativa entre 70-90%.

MODELACIÓN POR HOMOLOGÍA DE LA CATEPSINA B DE Fasciola hepatica

Se aborda la modelación por homología de una proteína que puede ser blanco potencial en la terapia de la fasiolosis. La catepsina B de Fasciola hepatica es una cisteína proteasa de excreción-secreción presente en los estadios juveniles del parásito. En una primera fase de este estudio proponemos un modelo tridimensional por homología de la catepsina B, utilizando como moldes catepsinas B de humano y rata (1PBH, 2PBH y 3PBH, 1MIR) del PDB (protein data bank). Se chequeó su calidad por el WHAT IF y se obtuvo una energía final total de -6750.96 KJ/mol por el campo de fuerza GROMOS96. Además se identificaron su sitio activo (Cys 104, His 275, Asn 295) y los aminoácidos que lo estabilizan por puentes de hidrógeno (Val 107, Phe 250, Gly 302), así como se predijo su estructura secundaria. El modelo tridimensional puede emplearse para realizar tamizaje virtual utilizando programas de docking y bases de datos de compuestos químicos virtuales del tipo "aceptores de Michael".

Cathepsin B was selected as a possible new therapeutic target of Fasciola hepatica. This is a cystein excretion protease present in the early phases of the parasite. First, we propose a three-dimensional model by homology of the cathepsin B of F.hepatica, by using as templates cathepsins B of human and rat (1PBH, 2PBH and 3PBH, 1MIR) from PDB (protein data bank). Its quality was checked by WHAT IF and a total final energy was -6750.96 KJ/mol as measure by GROMOS96. The active site (Cys 104, His 275, Asn 295) and amino acids involved in its stabilization by hydrogen bonds (Val 107, Phe 250, Gly 302), were identified. Also its secondary structure was predicted. The three-dimensional model could be employed in order to perform virtual screening by means of docking programs and data bases of virtual chemical compounds of the type "Michael acceptors".

ESTUDIO PRELIMINAR DE LA COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DEL SURFACTANTE PULMONAR DE CERDOS JÓVENES

La búsqueda de surfactantes exógenos constituye actualmente una prioridad debido a la alta morbilidad y letalidad del Síndrome del Dificultad Respiratoria del Recién Nacido y a la alta eficacia demostrada por la terapia de reemplazo con estos productos, fundamentalmente, los de origen natural. Teniendo en cuenta que la composición y función del surfactante pulmonar difiere entre los vertebrados en dependencia de la anatomía pulmonar, fisiología respiratoria y que la calidad de este varía con la edad de los animales, en el presente trabajo abordamos una caracterización bioquímica y biofísica general del surfactante pulmonar de origen porcino obtenido de animales jóvenes, con vistas a evaluar su calidad. Los resultados permiten afirmar que el surfactante pulmonar procedente de animales jóvenes reúne las características bioquímicas generales similares al resto de los naturales heterólogos empleados en la clínica, como son un alto contenido de fosfatidilcolina, específicamente su fracción disaturada (DPPC), bajos niveles de lisofosfatidilcolina, niveles de proteínas adecuados, que permitieron demostrar su excelente actividad biofísica.

The search of exogenous surfactants constitutes currently a priority due to the high morbidity and lethality of the Neonatal Respiratory Distress Syndrome (NRDS) and the high effectiveness demonstrated by the replacement therapy with these products mainly those from natural origin. Taking in mind that composition and function of the natural lung surfactant differ among vertebrates depending on the pulmonary anatomy and respiratory physiology and that its quality varies with the age of the animals, in the present work a biochemical and biophysical characterization of a pig lung surfactant from young and adult animals was studied in order to evaluate the quality of these surfactants. The results showed that the lung surfactant from young animals has the general biochemical characteristics similar to the rest of the natural lung surfactant used in the clinic practice. Such characteristics are high levels of dipalmitoylphospatidylcholine, low levels of lysophosphatidylcholine, and adapted protein levels to allow its excellent biophysical activity.