Revista de Salud Animal

SOME GUIDELINES FOR ORGANIZING AN AVIAN INFLUENZA EPIDEMIOLOGICAL SURVEILLANCE STRATEGY

La explosiva y casi simultánea aparición de la influenza aviar (IA) en múltiples países, ha sido interpretada por organismos sanitarios internacionales como evidencia de la debilidad de los sistemas de vigilancia y alerta temprana para advertir el peligro de introducción y difusión de la enfermedad. Los países y regiones pueden adoptar estrategias para la vigilancia de la IA más o menos complejas, en dependencia de los sistemas de vigilancia epidemiológica preestablecidos, las características de la industria avícola, los factores de riesgo identificados, y los recursos disponibles, entre otras consideraciones; pero es indiscutible la necesidad de fortalecer tanto la vigilancia pasiva como activa. El nuevo perfil de la IA ha aumentado la disponibilidad de las técnicas y medios para la vigilancia, cuya selección para establecer un algoritmo de diagnóstico efectivo tiene ciertas complejidades. El manejo de la prevención, y eventual control, de situaciones de desastres sanitarios por enfermedades transfronterizas como la IA, colocan a los servicios veterinarios en la necesidad de organizar la estrategia para la vigilancia epidemiológica con el propósito de aumentar las capacidades de alerta y respuesta rápida, incluso desde el nivel técnico-administrativo local. En este artículo se reseñan algunas pautas para establecer la estrategia de vigilancia de la IA.

The explosive and almost simultaneous appearance of Avian Influenza (AI) in multiple countries worldwide has been interpreted as evidence of weakness of the surveillance and early warning systems for noticing AI introduction and spread hazards. Countries or regions can adopt more or less intensive surveillance systems depending on the surveillance systems pre-established, poultry industry characteristics, risk factors assessed and resources available. However, it is unquestionable the need of enhancing either passive or active surveillance. The new AI profile has increased the availability of techniques and means for surveillance whose selection has certain complexities for establishing an effective diagnostic algorithm. The prevention management and control of eventual sanitary disasters demand from the Veterinary Services to have an epidemiological surveillance strategy in order to increase the capacities of alert and early responses at local level. In this paper, some guidelines for organizing an Avian Influenza Epidemiological Surveillance System are pointed out.

**A MULTIVATIATE ANALYSIS OF Anocentor nitens (IXODOIDEA: IXODIDAE): NON-PARASITIC PHASE/[title] [title language=es]ANÁLISIS MULTIVARIADO DE Anocentor nitens (IXODOIDEA: IXODIDAE): FASE NO PARASITARIA**

Multivariate statistical methods are useful tools complementary to classic univariate methods. In biology, they are used in several scenarios where data structure, classification and grouping are necessary. Nevertheless, it seems they have not been employed in the study of non-parasitic phase of ticks or any other arthropod. In this paper, the influence of different incubation conditions was studied in groups of 12-15 individuals in each of the 24 combinations of six temperatures 24, 26, 28, 30, 32, and 34ºC and four relative humidities 100, 80, 75.5 and 70% over the cycle variables of Anocentor nitens looking for establishing the most suitable environmental conditions to increase or decrease ticks performance and to apply these knowledges to zoogeography. According to the results, it seems that the best conditions to raise these ticks in laboratory are between 26-30ºC and 100% relative humidity.

La estadística multivariada es una poderosa herramienta complementaria de la clásica estadística univariada. En biología ha sido empleada en diferentes situaciones cuando se hace necesario conocer la estructura de los datos, agruparlos y clasificarlos. Sin embargo, al parecer no se ha empleado con anterioridad en el estudio de la fase no parasitaria de alguna garrapata o de algún otro artrópodo. En este artículo se estudia la influencia de las condiciones de incubación en grupos de 12-15 individuos en cada una de las 24 combinaciones de seis temperaturas 24, 26, 28, 30, 32, and 34ºC y cuatro valores de humedad relativa 100, 80, 75.5 y 70%, sobre las variables del ciclo de Anocentor nitens, con el fin de establecer cuáles son las condiciones más o menos adecuadas para el desarrollo de esta garrapata y aplicar estos conocimientos a la zoogeografía. De acuerdo con los resultados experimentales, las condiciones más favorables para criar estos ácaros en el laboratorio están entre 26-30ºC y 100% de humedad relativa.

MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION OF A FRAGMENT OF THE GENE CODIFYING FOR THE PROTEIN ERNS OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS

Classical swine fever virus (CSFV), belonging to the genus Pestivirus of the Flaviviridae family, is an enveloped positive stranded RNA virus highly contagious that can cause a fatal disease, characterized by fever, leukopenia and hemorrhage, with substantial economic losses. There is a great demand for a marker vaccine against CSFV. C, Erns, E1, and E2 are the structural proteins of the virus. E2 is the best candidate to be incorporated in vaccine, while Erns becomes an ideal candidate as an antigen in a differential diagnostic test. A synthetic fragment of the Erns gene (codifying for aa 109-160) was subcloned into pET28a vector. The cloning was screened by restriction analysis. The gene was expressed as a his-tag fusion protein in BL21 (DE3) E. coli strain. The recombinant polypeptide formed aggregates of about 7.9; 15.8; 23.7; 31.6; 39.5; 47.5 and 55.3kDa. The protein was not recognized by Western blot using an antibody against the virus. Using an ion metal affinity chromatography procedure, a 90% pure recombinant product was obtained. The potential use of this antigen for detection of CSFV antibodies should be further evaluated.

El virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), perteneciente al género Pestivirus de la familia Flaviviridae, es un virus ARN positivo, altamente contagioso capaz de causar una enfermedad fatal caracterizada por fiebre, leucopenia y hemorragia, con considerables pérdidas económicas. Existe una gran demanda de una vacuna marcadora contra CSFV. C, Erns, E1 and E2 son las proteínas estructurales del virus. E2 es el mejor candidato para ser incorporado a una vacuna, mientras Erns resulta entonces un candidato ideal como antígeno en un ensayo de diagnóstico diferencial. En el vector pET28a se subclonó un fragmento sintético del gene que codifica para Erns (codificante para los aa 109-160). El clonaje se monitoreó por análisis de restricción. El gen se expresó como una proteína de fusión a histidina en la cepa BL21(DE3) de E. coli. El polipéptido recombinante formó agregados de aproximadamente 7.9; 15.8; 23.7; 31.6; 39.5; 47.5 y 55.3kDa. La proteína no fue reconocida por anticuerpos contra el virus por Western blot. Con el empleo de la cromatografía de afinidad a iones metálicos se obtuvo un producto recombinante con un 90% de pureza. Más adelante debe ser evaluado el empleo potencial de este antígeno para la detección de anticuerpos contra CSFV.

ISOLATION OF SWINE TRANSMISSIBLE GASTROENTERITIS VIRUS IN CELL CULTURES

La gastroenteritis transmisible (TGE) es una enfermedad de los cerdos, infecciosa, aguda y altamente contagiosa; causada por un virus de la familia Coronaviridae, género Coronavirus. En nuestro país, a partir del año 2003 se comenzaron a presentar brotes de síndrome diarreico con las características clínico epizotiológicas de la enfermedad de TGE, pero para lograr la confirmación del diagnóstico era necesario aislar el virus en cultivos celulares a partir de animales enfermos, seguido de una identificación en aquellos cultivos que presentaran efecto citopático, para lo cual era necesario desarrollar una metodología para el aislamiento viral, ya que para este virus ha sido reportado con anterioridad que el aislamiento en células resulta muy difícil de lograr. En esta investigación se desarrolló una metodología para el aislamiento del virus de TGE. Los aislamientos obtenidos durante la evaluación de la técnica fueron identificados como positivos a través de la aplicación de inmunoperoxidasa indirecta sobre las células infectadas con un anticuerpo monoclonal comercial específico anti TGE.

Transmissible gastroenteritis (TGE) is an infectious, acute and highly contagious disease in swine. It is caused by a virus belonging to the Coronaviridae family, Coronavirus genus. Some outbreaks starting with diarrheic symptoms with the clinical characteristics of TGE disease have been present in our country since 2003. But for having the confirmation of the diagnostic, it was necessary to isolate the virus in cell cultures from sick animals, followed by an identification in those cell cultures with cytopatic effect. That is why, it was necessary to develop a methodology for the virus isolation, since for this virus, it has been previously reported that isolation in cells is very difficult to obtain. In this research, a methodology was developed for the virus isolation. The isolates obtained during the technique evaluation were identified as positive by indirect immunoperoxidase in cells with an anti TGE specific commercial monoclonal antibody

EFFECT OF NATURAL MATING AND THE USE OF DIFFERENT TYPES OF SEMEN ON THE PRODUCTIVITY OF SOW

Se evaluó el efecto de la monta natural y el uso de diferentes tipos de semen sobre la productividad de 160 cerdas, se conformaron cuatro lotes de 40 hembras cada uno con el siguiente manejo: 1) Monta natural (MN); 2) Inseminación a nivel cervical con semen diluido refrigerado de origen nacional (SDRN); 3) Inseminación a nivel uterino con semen diluido refrigerado de importación (SDRI); y 4) Inseminación a nivel uterino con semen congelado de importación (SCONGI). La sincronización de las hembras se realizó mediante el destete de los lechones a los 21 días de lactancia en promedio, siendo la detección del estro dos veces al día de 9:00 a 11:00 a.m., y de 16:30 a 18:00, con la ayuda de un macho. Los promedios de fertilidad nos indican que el grupo SDRN tuvo el mejor porcentaje con 85.0%, comparado con el de MN, SDRI y SCONGI (77.5%, 57.5% y 65.7% respectivamente), determinándose una diferencia estadística significativa (P>0.05) entre el grupo SDRN y el SDRI. Lo mismo se observa con relación al número de lechones nacidos por camada que fue mejor con SDRN (11.4), que con MN, SDRI y SCONGI (10.7, 9.3 y 6.9 respectivamente), observándose una diferencia estadística significativa (P>0.05), entre SCONGI con relación a MN, SDRN y SDRI, determinándose una diferencia de 4.5 lechones menos por camada de lo obtenido con SCONGI con relación al SDRN. Se concluye que independientemente de donde se deposite el semen congelado, este tendrá un menor porcentaje de fertilidad con relación al semen refrigerado y monta natural, sucediendo lo mismo con relación al número total de lechones nacidos por camada.

The effect of natural mating and the use of different types of semen were assessed on the productivity of 160 sows by forming four lots of 40 with the following arrangement: 1) Natural mating (MN); 2) Insemination on a cervical level with diluted and refrigerated semen from national origin (SDRN); 3) Insemination at uterine level with diluted and refrigerated imported semen (SDRI) and 4) Insemination at a uterine level with imported frozen semen (SCONGI). The synchronization of the sows was carried out by the weaning of the piglets with an average of 21 days of breast-feeding, detecting oestrus twice a day (9:00 to 11:00 and from 16:30 to 18:00) with the aid of a male pig. The fertility average results indicate that the SDRN group reached the best percentage with 85%, compared to the MN, SDRI and SCONGI (77.5%, 57.5% and 65.7% respectively), determining a considerable statistic difference (P>0.05), between the SDRN and SDRI groups. The same was observed in relation to the number of piglets born per litter, which was better with SDRN (11.4) than with MN, SDRI and SCONGI (10.7, 9.3 and 6.9 respectively), showing a considerable statistic difference (P>0.05) between SCONGI in relation to MN, SDRN and SDRI, determining a difference of 4.5 piglets less per litter than when obtained with SCONGI in relation to SDRN. It is concluded that no matter where the frozen semen is deposited for insemination, it will have a lower percentage of fertility in relation to refrigerated semen and natural mating, and the same occurs in relation to the total number of piglets born per litter.

OCCURRENCE OF AFLATOXIN M₁ IN RAW, ULTRAPASTEURIZED AND ORGANIC MILKS PRODUCED AND MARKETED IN MEXICO

Muestras de leche procedentes del Altiplano Mexicano (9 cruda, 20 ultrapasteurizada y 15 orgánica) fueron analizadas para determinar la presencia de aflatoxina M1 empleando columna de extracción de fase sólida (C18), prederivatización con ácido trifluoracético y cromatografía líquida acoplada a un detector fluorescente. Los resultados mostraron que el 59% de las muestras presentaron niveles de aflatoxina M1 y todos los casos se encontraron por encima del límite máximo de residuo de 0.05 µg/Kg propuesto por la Unión Europea. Las medianas de aflatoxina M1 encontradas en muestras de leche cruda, ultrapasteurizada y orgánica fueron 16.21; 16.1 y 23.1 µg/Kg respectivamente. El porcentaje de muestras por encima del límite máximo de residuo fue menor en leche de producción orgánica (20%) comparada con las leches crudas y ultrapasteurizadas que estuvieron por encima del 50 y 60% respectivamente.

Milk samples coming from the central zone of Mexico (9 raw, 20 ultrapasteurized (UHT) and 15 organic) were surveyed for determining the presence of aflatoxin M1, using a solid phase extraction column (C18), prederivatization with trifluoracetic acid and liquid chromatography coupled to a fluorescence detector. Analytical results showed that the 59% of the samples was contaminated with aflatoxin M1, and all the cases were above the maximum level of 0.05 µg/Kg set by the European regulations for aflatoxin M1 in liquid milk. The medians of aflatoxin M1 found in raw, ultrapasteurized and organic milk samples were 16.21; 16.1 and 23.1 µg/Kg respectively. The percentage of samples above the maximum limit of residual was smaller in organic milk production (20%) compared with the raw and ultrapasteurized milks that were respectively above the 50 and 60%.

DETECTION OF ANTIMICROBIAL RESIDUES IN ANIMAL TISSUES AND TETRACYCLINES IN BONES OF PIGS

Se investigó la presencia de residuos de antimicrobianos en tejidos y tetraciclinas en huesos de cerdos en el Matadero Municipal de la zona Metropolitana de Guadalajara, México. El estudio se realizó en tres etapas por dos métodos diferentes. La primera etapa tuvo como propósito investigar la frecuencia de cerdos positivos a tetraciclinas y arrojó que de 277 canales examinados 47% fueron positivos. En la segunda se realizó la detección visual de fluorescencia en muestras de fémur, húmero y costilla de cerdos. De las 172 muestras de hueso analizadas 81% fueron positivas. En la tercera se investigó la presencia de residuos de antimicrobianos en tejidos por el método microbiológico de las tres placas. De los 62 cerdos estudiados, 50% fueron positivos, 27,4% negativos y 22,6% dudoso, resultaron a su vez positivas en riñón 41,9%, en músculo 54,8%, y en hígado 66,1%. Los resultados obtenidos indicaron que es elevado el porcentaje de animales donde se detectaron tetraciclinas y sustentan que el envío al matadero de animales con residuos de antimicrobianos es frecuente.

The presence of antimicrobial residues in tissues and tetracyclines in bones of pigs was researched in the slaughter house of the Metropolitan Zone of Guadalajara, Mexico. The study was organized in three stages using two different methods. The first stage researched the frequency of tetracyclines in pigs. From 277 pig carcasses tested, the 47% was positive to tetracyclines. In the second stage, the fluorescence visual detection in samples of femur, humerus and rib of pigs was conducted. From 172 bone samples, the 81% was positive. In the third stage, the presence of antimicrobial residues in tissues was researched using the three- plate microbiological method. From 62 pigs analyzed, the 50% was positive, the 27,4% negative and the 22,6% was uncertain. Kidney, muscle and liver samples were 41,9%, 54.8% and 66,1% positive respectively. The incidence of antimicrobials in contaminated animals detected in this study showed evidences that slaughter is commonly carried out in animals containing antimicrobial residues at the Guadalajara's slaughter house.

DETERMINATION OF AIVLOSIN IN FEEDSTUFFS BY HIGH PERFOMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Un procedimiento se desarrolló por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para determinar Aivlosin en alimentos destinados a diferentes categorías productivas de la crianza del cerdo. La extracción del analito se realizó con acetonitrilo y se concentró cinco veces cuando fue inferior a 20 ppm. El extracto se analizó por HPLC con una columna de fase reversa C18, un detector UV (280 nm) y una mezcla de acetonitrilo: acetato de amonio 0.15M: ácido acético en una proporción de 45:45:10 v/v/v, como fase móvil. Los resultados de la validación mostraron una linealidad entre 5-80 µg/ml, que responde a una ecuación general de Y=-2.60+1.72X con un coeficiente de regresión de 0.999(p<0.05) y una variación del intervalo de confianza de la pendiente entre 1.57-1.87. El límite de detección y de cuantificación fue de 4 µg/g y 12 µg/g respectivamente, cuando se concentró la muestra cinco veces; mientras la muestra aplicada directamente presentó un límite de detección de 42 µg/g. La recuperación promedio expresada en porcentaje fue de 63±7.3 y 99±6.5 cuando se concentró y se aplicó de forma directa respectivamente. La precisión del método se midió por el coeficiente de variación en ambos procedimientos, el cual fue inferior al 15%. Todas las muestras analizadas cumplieron con la especificación de calidad que brinda el fabricante.

A procedure was developed by high perfomance liquid chromatography (HPLC) in order to determine Aivlosin in feedstuffs with destination to different productive categories of pigs. Aivlosin was extracted with acetonitrile and concentrated five times when the concentration was inferior to 20 ppm . The extract was analyzed by HPLC using a reverse phase column C18 with UV detection (280 nm) and acetonitrile:amoniun acetate 0.15M:acetic acid (45:45:10v/v/v) as eluent. The validation results showed a linearity between 5-80 µg/ml with a general equation of Y= 2.60 +1.72X, where the regression coefficient was 0.999 (p < 0.05) with a variation of the confidence interval of the slope between 1.57-1.87. Limits of detection and quantification were 4 and 12 µg/g respectively when the sample was concentrated five times. While the sample applied directly presented a limit of detection of 42 µg/g. Average recovery of Aivlosin was 63±7.3 and 99±6.5% when the sample was directly applied and concentrated. The precision of the method measured through the variation coefficient in both procedures was inferior to 15%. All the samples analyzed fulfilled the quality specification offered by the producer.

DETERMINATION OF CHLORTETRACYCLINE IN FEEDSTUFFS BY HIGH PERFOMANCE LIQUID HROMATOGRAPHY (HPLC)

Se desarrolló un procedimiento por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) para determinar clortetraciclina en alimentos destinados a diferentes categorías productivas de la crianza del cerdo. La extracción del analito se realizó con una solución de acetona ácida. El extracto se analizó por HPLC con una columna de fase reversa C18 y un detector UV (340 nm) con una mezcla de dimetilformamida al 27% como fase móvil. Los resultados de la validación mostraron una linealidad entre 50-1000 µg/mL que responde a una ecuación general de Y=0.23X-2.62 con un coeficiente de regresión de 0.996 (p<0.05) y una variación del intervalo de confianza de la pendiente entre 0.23-0.24. El límite de detección y el de cuantificación fue de 33µg/g y 50 µg/g respectivamente. La recuperación promedio expresada en porcentaje fue de 90.2±7. La precisión del método en ambos procedimientos fue inferior al 15%. Todas las muestras analizadas entre 300-450 µg/g cumplieron con la especificación de calidad que brinda el fabricante, no así la concentración de 150 µg/g que muestran valores entre 66-123 ug/g para un 66±14% con respecto al valor real.

A procedure was developed by High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) in order to determine chlortetracycline in feedtuff destined to different productive categories of pigs´ breeding. Chlortetracycline was extracted with acid acetone solution. The extract was analyzed by HPLC using a reverse phase column C18 with UV detection (340 nm) and dimethylformamide to 27% as eluent. The validation results showed a linearity between 50-1000 µg/mL with a general equation of Y= 0.23X _2.62, where the regression coefficient was 0.996 (p < 0.05) with a variation of the interval of trust of the slope between 0.23-0.24. Limits of detection and quantification were 33.and 50 µg/g respectively. Average recovery of chlortetracycline was 90.2±7.0%.The precision of the method in both procedures was inferior to 15%. All the samples analyzed between 300-450 µg/g fulfilled the quality specification offered by the producer, while the samples with 150 ug/g did not complete their specification showing values among 66-123 ug/g.

**DIFLUOROMETHYLORNITHINE AND Bursera fagaroides AQUEOUS EXTRACT ON MURINE LYMPHOMA L5178Y MODEL IN BALB/C RATS: COMPARISON OF ITS EFFECT ON THE METABOLISM OF POLYAMINES**

El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto del extracto acuoso de Bursera fagaroides y Difluorometilornitina (DFMO), aplicados de forma individual y combinados, sobre los tejidos sanos en el modelo de linfoma murino L5178Y y específicamente sobre el metabolismo de las poliaminas (PAs), Putresina (Pu), Espermidina (Spd) y Espermina (Spm). Mediante cromatografía de intercambio iónico se determinaron los niveles de Pu en orina como indicadores de la evolución del tumor, mientras por radioinmunoensayo se cuantificó la actividad de la ODC renal. Los resultados obtenidos sugieren que no se combine la ingestión de algún tipo de té o brebaje preparado con dicha planta cuando se administre DFMO, dado su efecto estimulador del desarrollo tumoral, contrario al efecto anticáncer del extracto hidroalcohólico de la misma planta.

The aim of present work was to study Bursera fagaroides watery extract effect and Difluoromethylornithine (DFMO), applied individually or combined on healthy tissues and specifically on Polyamines (PAs) Putrecsine (Pu), Spermidine (Spd) and Spermine (Spm) metabolism in murine lymphoma L5178Y model. By means of ionic exchange chromatography, Pu levels in urine were determined as tumor evolution indicators, while renal ODC activity was quantified using radioimmunoassay. The results obtained suggest that the aqueous extract from Bursera fagaroides is a tumor stimulator, showing the opposite effect of the hidroalcoholic extract.

RAPID DETECTION OF SWINE TRANSMISSIBLE GASTROENTERITIS VIRUS BY NESTED POLYMERASE CHAIN REACTION

The aim of this study was to develop a nested PCR for the rapid detection of TGEv. The primers were designed from the highly conserved regions of several sequences of this virus included in the analysis. With the purpose of achieving a good technical specificity, sequences of porcine epidemic diarrhoea virus (PEDv) were included in the design. This virus belongs to the same viral family and it has a close genetic relationship with TGEv. Since both viruses produce the same clinical signs, it was very important to get primers which not amplify PEDv. With the external primers, the amplification of a fragment of the expected size (441 pb) in all the samples evaluated by RT-PCR was obtained, but there was a very low intensity. In the second round (nested PCR), with the internal primers, the amplification of a fragment of the expected size of 168 pb was shown, with a very good concentration. It has been considered that when using nested PCR, TGEv detection sensitivity increased in isolates with low viral concentration.

El objetivo de este estudio fue desarrollar una PCR anidada para la detección rápida del virus de TGE. Los cebadores fueron diseñados a partir de regiones altamente conservadas de varias secuencias de este virus incluidas en el análisis. Con el fin de lograr una buena especificidad de la técnica se incluyeron en el diseño, secuencias del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDv), el cual pertenece a la misma familia viral y posee una estrecha relación genética con el virus de TGE. Como ambos virus producen los mismos signos clínicos fue importante obtener cebadores que no amplificaran el PEDv. Con los cebadores externos se obtuvo la amplificación de un fragmento de la talla esperada de 441 pb en todas las muestras evaluadas por RT-PCR, pero de muy baja intensidad. En la segunda amplificación (PCR anidado), con los cebadores internos, se mostró la amplificación de un fragmento de la talla esperada de 168 pb, con una buena concentración. Consideramos que con el PCR anidado se incrementó la sensibilidad de la detección del virus de TGE en aislados con baja concentración viral.