Revista de Salud Animal

**Genotyping of the kappa-casein and leptin genes in Cuban water buffalo by PCR-RFLP**

Genetic analysis of loci affecting production and reproduction traits in livestock animals make possible the evaluation of animal breeding values using molecular markers. The aim of this study was to detect polymorphisms in the leptin and k-casein genes of a Cuban water buffalo population to provide markers useful for associating studies. Genomic DNA from 68 unrelated Cuban buffaloes, uncontrolled crossbreds of river (Buffalypso) and swamp (Carabao) animals, was analyzed using PCR-RFLP. Fragments of leptin and ê-casein genes were amplified and digested with Bsa AI and Hind III/Taq I, respectively. All the amplified samples were monomorphic BB after digestion with Hind III/Taq I. Genotypic frequencies found in the leptin gene with Bsa AI were 0.47 (AA), 0.42 (AG) and 0.11 (GG). The population was in HWE (p=1.0000), possibly because there was not selection for this locus on it. The F IS estimate (0.0212) showed no inbreeding in the population regarding this locus. He (0.436) and Ho (0.426) values were below 0.5 (50%), indicating low genetic variation in this locus in the population. PCR-RFLP detected the two genetic variants described for the leptin gene A1620G. However, a higher number of animals and SNPs in the leptin and/or other genes should be analyzed for a more accurate estimate of the genetic diversity in this population. DNA sequencing should be assayed by nucleotide sequence analysis to detect the new A and B variants of k-casein reported in buffalo.

El análisis genético de loci, que controla caracteres productivos y reproductivos, hace posible la evaluación del valor genético en el ganado con el uso de marcadores moleculares. El objetivo de este estudio fue detectar polimorfismos en los genes de la leptina y la k-caseína en búfalos cubanos, para proveer marcadores útiles en estudios de asociación. Se amplificaron por PCR fragmentos de los genes de la leptina y la ê-caseína que se digirieron con Bsa AI y Hind III/Taq I, respectivamente. Todas las muestras amplificadas resultaron monomórficas BB tras la digestión con Hind III/Taq I. Las frecuencias genotípicas en el gen de la leptina fueron, 0.47 (AA), 0.42 (AG) y 0.11 (GG). La población se encontró en equilibrio de Hardy-Weinberg (p=1.0000), posiblemente, porque no está ocurriendo selección para dicho locus. El F IS estimado (0.0212) mostró que no existe endogamia en la población cuando se considera este locus. Los valores de He (0.436) y Ho (0.426) estaban por debajo de 0,5 (50%), lo que indica que existe una baja variabilidad genética para este locus en la población. La PCR-RFLP permitió detectar las variantes genéticas descritas para A1620G en el gen de la leptina. Sin embargo, se deben analizar un mayor número de animales y SNPs, en este u otros genes, para estimar con mayor certeza la diversidad genética en esta población. Es necesario el uso de la secuenciación para detectar las nuevas variantes A y B de la k-caseína que se han descrito en búfalos a través de esta técnica.

Evaluation of the implementation of the bovine brucellosis control program in Manabi Province, Ecuador

Con el objetivo de evaluar el nivel de aplicación de las medidas establecidas en el Programa nacional de control de la brucelosis bovina en la provincia Manabí, el cual tiene un carácter voluntario, se aplicó una encuesta epidemiológica en 20 unidades afectadas y 20 unidades no afectadas por la enfermedad, seleccionadas al azar, en el periodo de noviembre de 2014 a marzo de 2015. Los elementos que se tuvieron en cuenta para su evaluación fueron: uso de la vacunación, asistencia veterinaria, investigación serológica de la masa periódicamente, vigilancia epidemiológica, eliminación de reactores positivos, control sanitario de ingreso y egreso de animales, medidas de bioseguridad de los hatos y educación sanitaria. A los datos obtenidos se le calculó el porcentaje de cumplimiento de los diferentes aspectos contemplados en el programa y se comparó el nivel de aplicación entre los rebaños afectados y los no afectados con el uso de la prueba Chi cuadrado y el paquete estadístico en línea VassarStats.net. Se evidenció un bajo cumplimiento de las medidas establecidas en el programa; solo se comportó de manera adecuada la asistencia veterinaria, que se cumple en más del 50% de los hatos estudiados. Se evidenció un mejor comportamiento de los indicadores asistencia veterinaria e investigación de los animales antes de su entrada al hato en los no afectados (p £ 0,05). También se pudo observar que el 100% de los hatos que se vacunan no están afectados por la enfermedad. El estudio realizado demostró que en la provincia Manabí existe un bajo nivel de cumplimiento de las medidas contempladas en el programa de control de Brucelosis bovina, aspecto que se presenta de forma más marcada en aquellos rebaños que se encuentran afectados por la enfermedad.

In order to assess the level of implementation of the National Program for Bovine Brucellosis control in the province Manabí, an epidemiological survey was conducted in 20 affected and 20 not affected herds selected randomly from November 2014 to March 2015. The elements taken into account for evaluation were: use of vaccination, veterinary care, systematic serological test, elimination of positive reactors, epidemiological surveillance, sanitary control of entry and exit of animals, biosecurity, and sanitary education. From the data obtained, the compliance percentage of the different aspects covered by the program was calculated, and the level of application between the affected and unaffected herds were compared using the Chi-square test and the statistical package online VassarStats.net. In the unaffected herd, it was evident a better performance (p £ 0,05) of the indicators veterinary care and research of animals before they entered the herd. It was also observed that 100% of the vaccinated herds were not affected by the disease. The study showed that in Manabí province there is a low level of compliance with the measures contained in the control program of bovine brucellosis, something that happens more markedly in those herds affected by the disease.

Antimicrobial activity of Lactobacillus spp. strains against pathogens causing bovine mastitis

El tratamiento de la mastitis bovina con el uso de antibióticos genera residuos en la leche, por lo que afecta la calidad de los subproductos lácteos destinados a la alimentación de la población. Las bacterias ácido lácticas se han propuesto como una alternativa para evitar el uso de antibióticos. Se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro por difusión sobre capas de agar y difusión en disco del sobrenadante de seis cepas de Lactobacillus spp. contra patógenos productores de mastitis bovina. Después de la neutralización con NaOH, de los tratamientos térmico (100ºC y 121ºC durante 5 min) y enzimático al sobrenadante libre de células, se comprobó que la actividad antagonista de tres cepas se mantuvo activa. Se cuantificaron las sustancias inhibitorias como el ácido láctico (1,08- 2,68 g.l-1) y el peróxido de hidrógeno (0,05 - 0,26 g.l-1). Los resultados mostraron que cuatro cepas tienen potencial inhibitorio ante cepas patógenas de Staphylococcus spp. productoras de mastitis; se destacó la cepa ML5 por tener mayores halos de inhibición (54-65 mm) ante patógenos de aislados clínicos como Staphylococcus chromogenes y Staphylococcus hyicus, por lo que es un candidato potencial para ser evaluado en la prevención de la mastitis bovina.

Treatment of bovine mastitis with antibiotic generates residues in milk that affects the quality of dairy products for the population feeding. The lactic acid bacteria have been proposed as an alternative to avoid use of antibiotics. The in vitro antimicrobial activity of six strains of Lactobacillus spp. was evaluated against bovine mastitis pathogens by diffusion on agar layers and disk diffusion of the supernatant. After neutralization with NaOH and heat (100 and 121°C for 5 min) and enzymatic treatments, the antagonistic activity of the cell-free supernatants of the three strains studied remained active. The inhibitory substances lactic acid (1.08 - 2.68 g.l-1) and hydrogen peroxide (0.05 - 0.26 g.l-1) were quantified. Four strains showed inhibitory potential against pathogenic strains of Staphylococcus spp. causing mastitis. The strain ML5 stood out for having greater inhibition halos (54-65 mm) against clinical isolates of pathogens such as Staphylococcus chromogenes and Staphylococcus hyicus, and, thus, showed to be a potential candidate to be evaluated in the prevention of bovine mastitis.

Reference values of the hematological parameters in the white-tailed deer (Odocoileus virginianus ustus) at the Cotopaxi National Park

Con el objetivo de determinar los valores de referencia para los parámetros hematológicos en el venado cola blanca (Odocoileus virginianus ustus) en el Parque Nacional Cotopaxi, Ecuador, se utilizaron 36 animales, 17 machos y 19 hembras, entre tres y cinco años de edad. Se determinaron los indicadores hematológicos, sus parámetros de referencia y el efecto del sexo y de la comarca sobre los mismos. Se utilizaron la prueba de normalidad (W de Shapiro-Wiks) y la de bondad de ajuste (c²) para determinar el tipo de distribución de los datos. En las variables con distribución normal se calcularon los valores de referencia para 1,65 de desviación estándar y, cuando el ajuste a la distribución normal no fue satisfactorio, se calcularon los límites de tolerancia para el 90% de la población. El efecto del sexo y de la comarca sobre los indicadores hematológicos se evaluó mediante un análisis de varianza multifactorial. La hemoglobina, el hematocrito y las constantes corpusculares tuvieron valores superiores a los publicados para otras subespecies en América, mientras que el conteo total de eritrocitos fue inferior. La serie leucocítica tuvo valores similares, excepto en los neutrófilos que fueron menores. La mayoría de los indicadores tuvieron distribución normal o se ajustaron satisfactoriamente a la misma (p>0,05). El sexo y la comarca no tuvieron efectos sobre los indicadores hematológicos (p>0,05). Se concluye que el perfil hematológico difiere de otras subespecies y no se afecta por el sexo y la comarca, por lo que los intervalos de referencia determinados para estos animales pueden ser utilizados en estas condiciones.

In order to determine the reference values for the hematological parameters of the white-tailed deer (Odocoileus virginianus ustus) at the Cotopaxi National Park, Ecuador, 36 animals, 17 males and 19 females, between 3 and 5 years of age, were used. The hematological parameters, their reference values and the effect of the sex and the district on them were determined. The descriptive statistic of the parameters was determined. The Shapiro-Wilk test of normality and the the chi-square (c²) goodness-of-fit test were used to determine the type of distribution of the data. In variables with normal distribution, the reference values for ± 1.65 standard deviations were calculated, and when the adjustment to normal distribution was not satisfactory, the limits of tolerance for 90% of the population were calculated. The effect of sex and the district on the hematological parameters were evaluated by means of a multifactorial analysis of variance. The erythrocytic series showed higher values than those reported for other sub species in America; however, the leukocytic series, except in the neutrophils, had similar values. The majority of the parameters had a normal distribution or fit to it satisfactorily (p>0.05). Sex and the district had no effect on the hematological parameters (P>0.05). It is concluded that the hematological profile of the white-tailed deer differs from the profile of other sub species and is not affected by sex or the district, and, therefore, the intervals of reference determined for these animals can be used under these conditions.

**Prevalence of Mollicutes in Cell Cultures: experience in Cuba**

Different mollicutes species of the Mycoplasma and Acholeplasma genera can contaminate the cell cultures and raw materials commonly used in the manufacture of a variety of biological and therapeutical products. In this study, the presence of mollicutes was detected in 19 of 50 cell culture samples analyzed using PCR and microbiological cultures. The species most frequently detected was M. fermentans (31.5%), followed by A. laidlawii (26.3%), M. orale (15.7%), M. hyorhinis (15.7%), and M. salivarium (10, 5%). A. laidlawii was present as the infecting agent only in 10.5% of the samples. These results showed the main species of contaminants, which suggested mollicutes multiple origin in the source of infection.

Diferentes especies de mollicutes, de los géneros Mycoplasma y Acholeplasma, pueden contaminar los cultivos celulares y las materias primas que se utilizan comúnmente en la fabricación de una variedad de productos biológicos y terapéuticos. En el presente estudio se detectó la presencia de mollicutes en 19 de 50 muestras analizadas de cultivo celular a través de PCR y cultivo microbiológico. Las especies detectadas con más frecuencia fueron M. fermentans (31,5%), seguido por A. laidlawii (26,3%), M. orale (15,7%), M. hyorhinis (15,7%) y M. salivarium (10,5%). A. laidlawii estaba presente como el agente infectante solo en 10,5% de las muestras. Estos resultados muestran las principales especies de mollicutes contaminantes, lo que sugiere un origen múltiple en la fuente de infección.

Cryopreservation and storage of Mycoplasma spp.

La criopreservación tiene como principio mantener la viabilidad y la funcionabilidad celular a temperaturas bajas, por lo que entender y aplicar adecuadamente la criopreservación del material biológico es fundamental en laboratorios y bancos de células. En el caso de los micoplasmas, el mantenimiento de cultivos viables no es solo una cuestión operacional, sino que constituye un factor esencial en el buen desempeño del trabajo en el laboratorio. Por tal motivo, este trabajo tuvo como objetivo evaluar la viabilidad de cepas de micoplamas conservadas, por congelación, en diferentes matrices y con varios agentes criopreservantes. Para el estudio se utilizó un cultivo de 5,1x10(8)UFC/ml de Mycoplasma hyorhinis (seleccionado como cepa tipo), el cual se inoculó en matrices de cultivo celular y líquido ascítico. Ambos tipo de muestras se conservaron a -70ºC y -20ºC con o sin el empleo de agentes criopreservantes; en este caso, 5% de glicerol y 2.5% de dimetilsulfóxido. A los 3, 30, 60 y 90 días poscongelación se comprobó su viabilidad a través de la siembra en medio Hayflick líquido y sólido. Como resultado se obtuvo que en las matrices congeladas a -20ºC y -70ºC y con criopreservantes, Mycoplasma hyorhinis se mantuvo viable por un periodo de 90 días, no así en las matrices que no contenían criopreservantes: el comportamiento fue variable en dependencia de la temperatura. Se concluye que la adición de agentes criopreservantes (5% de glicerol o 2.5% de dimetilsulfóxido) preserva la viabilidad de los micoplasmas en las matrices estudiadas durante la congelación y el posterior almacenamiento; también la temperatura de -20ºC puede ser utilizada por aquellos laboratorios que carecen de equipamiento con -70ºC para la conservación de muestras por un periodo de tres meses, tiempo diseñado para estudios interlaboratorios.

Cryopreservation has as a principle to maintain cell viability and functionality at low temperatures; thus, to understand and properly implement cryopreservation of biological material is essential in laboratories and cell banks. In the case of mycoplasmas, maintenance of viable cultures is not only an operational issue, but also an essential factor in the good performance of the laboratory work. Therefore, this study aimed to assess the viability of mycoplasma strains preserved by freezing, in different matrices and several cryopreserving agents. For the study, it was used a culture of Mycoplasma hyorhinis (selected as type strain) with 5,1x10(8)UFC/ml, which was inoculated into cell culture matrices and ascetic liquid. Both types of samples were stored at -70ºC and -20ºC by using or not cryopreserving agents; in this case, 5% glycerol and 2.5% dimethylsulfoxide were used. At 3, 30, 60 and 90 days postfreezing, mycoplasma viability was checked by growing them in liquid and solid Hayflick's media. As a result, it was found that in the matrices frozen at -20ºC and -70ºC and cryopreserving, Mycoplasma hyorhinis remained viable for 90 days, but not in the matrices containing no cryopreserving, where the behavior was variable depending on the temperature. It was concluded that the addition of cryopreserving agents (5% glycerol or 2.5% dimethylsulfoxide) preserved the viability of mycoplasmas in the matrices studied during freezing and subsequent storage; also the temperature of -20ºC can be used by those laboratories lacking equipment with -70ºC to store samples for three months, period of time designed for interlaboratory studies.

Effect of dietary inclusion of microencapsulated probiotics on some zootechnical parameters in red tilapia fingerlings (Oreochromis sp.)

El empleo de probióticos en la alimentación acuícola es una de las estrategias para disminuir el consumo de antibióticos en los sistemas intensivos y mitigar los impactos sobre el medio ambiente. El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de la inclusión en la dieta de probióticos microencapsulados sobre algunos parámetros zootécnicos en alevinos de tilapia roja (Oreochromis sp.). Se empleó una dieta con y sin probióticos, ambas con 42% de proteína bruta, 86% de digestibilidad y la energía de 4765.8 Kcal/Kg; a la que contenía probióticos se le incluyó 1% de probióticos microencapsulados. Los experimentos se realizaron en la estación experimental de la Corporación Universitaria Lasallista. A los alevinos de ambos grupos, con y sin probióticos, se les midió el peso y la talla. Se compararon estadísticamente algunas variables zootécnicas como son la conversión alimentaria (CA), la tasa de crecimiento específica (TCE), la ganancia de peso (GP), la ganancia de talla (GT) y el porcentaje de sobrevivencia. El estudio permitió asegurar que los peces que consumieron la dieta con probióticos, bajo condiciones experimentales, tuvieron mejor desempeño en los parámetros zootécnicos analizados.

The use of probiotics in aquaculture is one of the strategies to reduce consumption of antibiotics and mitigate the impacts on the environment. The purpose of this research was to evaluate the effect of the dietary inclusion of microencapsulated probiotics on some zootechnical parameters in red tilapia fingerlings (Oreochromis sp.). At the experimental station of the University Corporation Lasallina, two separated groups of fingerlings were given a diet with 42% of crude protein, 86% of digestibility and energy 4765,8 Kcal/Kg, but to one of the groups, 1% of microencapsulated probiotics was included. The fry of both groups were weighted and measured at three times, and the zootechnical variables such as feed conversion (FC), specific growth rate (SGR), weight gain (WG), size gain (SG), and survival percentage were statistically analyzed. The results showed p<0.05 statistical significance and confirmed that the fish fed with probiotics had a better performance of the parameters analyzed.

**The screw worm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae): a problem in animal and human health**

El Gusano Barrenador del Ganado (GBG) continúa siendo un problema veterinario y humano en América del Sur y parte del Caribe. Con el objetivo de actualizar el tema, sobre la base de las investigaciones de los últimos seis años, se revisó el acervo informativo relacionado existente y se comparan y discuten algunos resultados de los autores de este artículo con lo encontrado en dicho marco. Los estudios sobre el agente han versado sobre su biología, epidemiología, papel zoonósico, el control y la resistencia a insecticidas. En el tema se han realizado estudios de las diferencias en las alas del agente y algunos insectos afines, como un buen marcador para la identificación; la elaboración de una clave para la identificación de las larvas del primer estadio del ectoparásito; la obtención de evidencias de que las poblaciones del insecto migraron de norte a sur en el continente americano, al final del último máximo glacial y, posteriormente, en la transición entre el Pleistoceno y el Holoceno; la valoración de las pérdidas económicas causadas por el insecto en miles de millones de dólares ($ 0.34) en Brasil; el estudio de tres cebadores diferentes que mostraron polimorfismos (intraespecífico) para muestras procedentes de México, Costa Rica, Panamá, Jamaica y Brasil; el uso de otros dos cebadores (CR92A1 y J1A2) que permitieron discriminar, con éxito, entre Cochliomyia hominivorax y C. macellaria; la asociación entre la carga de Rhipicephalus microplus y la ocurrencia de miasis por C. hominivorax, con un riesgo relativo de la enfermedad en el ganado con alta carga de garrapatas de 3,85; nuevos casos de miasis humana (en cabeza, asociado a Pediculus humanus capitis, maxilar y otras localizaciones) en diferentes lugares de las áreas donde abunda el agente; evidencia de la ineficacia de la ivermectina y abamectina en la prevención de la miasis escrotal en toros; la presencia de mutaciones del gen E3, en asociación con la resistencia a los insecticidas; diferentes tipos de dietas y métodos de control genético.

The New World Screwworm (NWS) continues being a veterinarian and human problem in South America and part of the Caribbean. In order to update this matter based on the research of the last six years, the wealth of existing information was reviewed, and some results of the authors of this paper were compared and discussed with those results found in this framework. Studies on the agent have been focused on its biology, epidemiology, zoonotic role, the control and insecticide resistance. In this subject, studies have been carried out on the differences in the wings of the agent and some related bugs as a good identification marker; the development of a key for the identification of the ectoparasite first stage larvae; obtaining of evidence about the migration of insect populations from north to south in the Americas at the end of the last glacial maximum and then in the transition between the Pleistocene and the Holocene; the assessment of economic losses caused by the insect, in billions of dollars ($ 0.34) in Brazil; the polymorphisms (intraspecific) shown by three different primers for samples from Mexico, Costa Rica, Panama, Jamaica, and Brazil; the use of two other primers (CR92A1 and J1A2) which allowed to discriminate successfully between Cochliomyia hominivorax and C. macellaria; the association between Rhipicephalus microplus y charge and the occurrence of screwworm myiasis by C. hominivorax, with a relative risk of screwworm in cattle with a high tick load of 3.85; new cases of human myiasis (in head, associated with Pediculus humanus capitis, maxillary, and in other anatomical locations) in different places of the areas where the agent abounds; evidences of ivermectin and abamectin ineffectiveness in preventing bull scrotal myiasis; the presence of E3 gene mutations associated with insecticide resistance, different types of diets and methods of genetic control.

Evaluation of an electrical conductivity portable device as an alternative for subclinical mastitis detection

The use of efficient methods for the early diagnosis of subclinical mastitis is of great importance in milk production. By using an electrical conductivity meter (EC), the efficiency of subclinical mastitis diagnosis was evaluated in dairy farms in northern Parana, Brazil, and the results were compared with those obtained by using the California Mastitis Test and the Somatic Cell Count (SCC). Samples from 941 quarters of 259 cows of the Holstein and Jersey breeds were analyzed in four dairy farms between June and July 2014. The EC method correctly evaluated 54.8% of the samples (264 samples with subclinical mastitis) and 250 without infection when compared with the diagnosis by CMT. Of the 445 samples diagnosed as positive by EC, 19.7% were classified by CMT with score 2 and 24.7% with score 3. Of the samples with negative results (496), most of them had scores 0 and 1 (50.4% and 21.4 %). The correlations between EC and SCC (r = 0.14) and EC and CMT (r = 0.17) were positive but low, which generated false positive and false negative results of subclinical mastitis in the herd.

El uso de métodos eficientes para el diagnóstico rápido de la mastitis subclínica es de gran importancia en la producción de leche. Mediante el empleo de un medidor de conductividad eléctrica (CE), se evaluó la eficacia del diagnóstico de mastitis subclínica en granjas de leche del norte de Paraná, en Brasil, y se compararon los resultados con la Prueba de California para Mastitis (CMT, del inglés California Mastitis Test) y con el conteo de células somáticas (CCS). Se analizaron 941 cuartos mamarios, obtenidos de 259 vacas de las razas Holstein y Jersey en cuatro granjas lecheras, entre junio y julio de 2014. La CE evaluó correctamente 54,8% de las muestras (264 muestras con mastitis subclínica) y 250 sin infección en comparación con el diagnóstico de CMT. De las 445 muestras diagnosticadas como positiva para EC, 19,7% se clasificaron por la CMT, con una puntuación de 2 y 24,7% con una puntuación de 3. Entre los resultados negativos (496 muestras), la mayoría de las muestras tuvieron una puntuación entre 0 y 1 (50,4% y 21,4%). Hubo una correlación positiva (p <0.001); sin embargo, resultó baja entre CE y CCS (r = 0.14) y CE y CMT (r = 0.17), por lo que generaron resultados falsos positivos y falsos negativos de la mastitis subclínica en el hato.