Revista de Salud Animal

Standarization of a SYBR Green-I based real time RT-PCR assay for the detection of equine influenza virus

ABSTRACT Equine influenza is an acute respiratory infection of horses, donkeys, mules and zebras. Nowadays, the reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and real-time RT-PCR (rRT-PCR) assays are being widely used in diagnostic laboratories as a more sensitive alternative to virus isolation for the detection of equine influenza virus. The purpose of this study was to standardize an rRT-PCR, based on SYBR Green-I coupled with melting curve analysis for the detection of equine influenza virus (gene M) and the typing of hemagglutinin gene (HA). Sensitivity and specificity of the assay (gene M) were evaluated. In terms of the matrix gene copy number, the detection limit was 4.5 gene copies/μl of in vitro transcribed RNA. The linear range obtained for the transcript in the assay genered a typical standard curve from 107 until 100 gene copies/µl in terms of RNA copy number. The correlation coefficient (R2) was 0.99 for the RNA copies detected in nuclease free water and the error of standard curve was 0.0139. The rRT-PCR assay showed to be specific for equine influenza virus. No specific amplification curves were obtained with any of the other viruses tested such as equine viral arteritis, equine herpesvirus-1 and equine herpesvirus-4. The assay showed amplification and specific melting curves when the second set of primers against HA gene was evaluated. Thus, the proposed SYBR Green-I based rRT-PCR assay for the detection of equine influenza virus can be used in case of a possible emergency of this agent in Cuba.

RESUMEN La influenza equina es una infección respiratoria aguda de los caballos, burros, mulas y cebras. Actualmente, los ensayos de reverso transcripción acoplados a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR) están siendo ampliamente usados en los laboratorios de diagnóstico, como una alternativa más sensible al aislamiento viral, para la detección del virus de influenza equina. El objetivo de este estudio fue estandarizar un ensayo de rRT-PCR, basado en SYBR Green-I acoplado a análisis de curvas de disociación para la detección del virus de influenza equina (gen M) y la tipificación del gen de la hemaglutinina (HA). Se evaluaron la sensibilidad y la especificidad del ensayo (gen M). En términos de números de copias del gen de la matriz, el límite de detección fue de 4,5 copias del gen/μL del ARN transcripto in vitro. El rango lineal obtenido para el transcripto en el ensayo generó una curva estándar desde 107 hasta 100 copias del gen/µL en término de número de copias de ARN. El coeficiente de correlación (R2) fue de 0,99 para las copias de ARN detectadas en agua libre de nucleasas. El error de la curva estándar fue de 0,0139. El ensayo de rRT-PCR mostró ser específico para el virus de influenza equina. No se obtuvieron curvas de amplificación específicas con los otros virus evaluados, como son arteritis viral equina, herpesvirus equino-1 y herpesvirus equino-4. El ensayo mostró amplificación y curvas de disociación específicas cuando se evaluó la segunda pareja de cebadores contra el gen de la hemaglutinina. Así, el ensayo propuesto de rRT-PCR, basado en SYBR Green-I para la detección del virus de influenza equina, puede ser usado en caso de una posible emergencia de este agente en Cuba.

Effect of Lactobacillus plantarum as a probiotic in weaning pigs

RESUMEN En la presente investigación se evaluó el efecto de la aplicación del probiótico Lactobacillus plantarum en la alimentación de cerdos al destete sobre el consumo de alimento, la ganancia media de peso, la conversión alimenticia, la presencia de diarrea y los indicadores hematológicos. Se utilizó un diseñó de bloque completamente al azar donde se utilizaron 24 cerdos de 26 días de edad con tres tratamientos (T): T1: control (sin probiótico), T2: 10 mL y T3: 20 mL del probiótico por animal, con concentración 1x109 UFC/mL, adicionado en el alimento diariamente hasta los 70 días de edad. No se encontró efecto significativo entre los diferentes grupos en los indicadores de peso al final del experimento, en la ganancia de peso y en el consumo de alimento; sin embargo, hubo diferencia en la conversión alimenticia del grupo T1 con respecto a los restantes. La presencia de diarrea mostró diferencia significativa (p≥0,01) en los animales del grupo control (T1) con un incremento del porcentaje de las diarreas (57,14 %), mientras que en T2 y T3 mostró disminución de las diarreas (28,57 % y 14,28 %, respectivamente). Los mejores resultados de los indicadores bioproductivos fueron: consumo de alimento en T3 (9,77 kg); peso final T3 (40,77 kg); ganancia de peso T3 (4,66 kg); conversión alimenticia T3 (1,58 kg). Los indicadores hematológicos estuvieron dentro de los valores normales de la especie porcina. Se concluye que los animales presentaron una mejor condición de salud con la aplicación de probióticos.

ABSTRACT In this research, the effect of the application of the probiotic Lactobacillus plantarum was evaluated in the feeding of weaning pigs taking into account the feed intake, average weight gain, feed conversion rate, presence of diarrhea and hematological indicators. A randomized complete block design (RCB) was used in 24 pigs of 26 days of age with three treatments (T): T1: control (without probiotic), T2: 10 mL and T3: 20 mL (1x109 CFU / mL) of the probiotic per animal, added to the feed daily up to 70 days of age. At the end of the experiment, there was not a significant effect found among the different groups regarding the weight indicators: weight gain and feed intake; however, there was a difference regarding feed conversion rate on T1 group with respect to the rest. With regard to diarrhea indicator, there was a significant difference (p≥0.01) in the animals belonging to the control group (T1), with an increase in percentage (57.14 %); while T2 and T3 groups showed a decrease in diarrhea (28.57 % and 14.28 %, respectively). The best results of the bioproductive indicators were in T3: feed intake (9.77 kg), final weight (40.77 kg), weight gain (4.66 kg), and feed conversion rate (1.58 kg). The hematological indicators were within the normal values of the porcine species. It is concluded that the animals presented a better health condition with the application of probiotics.

Strategy against the fly Haematobia irritans and the tick Rhipicephalus microplus with the use of Effipro Bovis in a bovine herd

RESUMEN El control de poblaciones de parásitos que afectan los rebaños bovinos resulta una necesidad imperiosa en áreas tropicales, donde la presencia de ectoparásitos constituye una seria amenaza para la salud animal. La garrapata Rhipicephalus microplus, al igual que la mosca Haematobia irritans, ocasionan cuantiosos daños económicos, por lo que el control de ectoparásitos en los animales adquiere cada vez mayor importancia y da lugar a una demanda de agentes químicos para un control eficaz que puedan ser utilizados de forma segura, tanto para los animales como para el medio ambiente. El presente estudio tuvo como objetivo determinar la efectividad del Fipronil (Effipro Bovis) en el control de R. microplus y H. irritans sobre el ganado bovino bajo condiciones de campo, aplicando la rotación de los potreros como estrategia de lucha. El estudio se realizó en un rebaño de 14 animales de las razas Holstein y mestizo de Holstein F1, naturalmente infestados. Los animales tuvieron la dualidad de grupo control y tratado; estos se evaluaron antes y después del tratamiento. Se realizaron tres ensayos consecutivos, donde se aplicó tratamiento con Effipro Bovis, cada vez que se alcanzaban niveles de infestación por encima de 10 garrapatas por animal. Como resultado del primer ensayo, hubo una reducción de la intensidad de infestación a 0,9 garrapatas por animal (97,6 %) y, para H. irritans, 0,8 moscas por animal (99,1 %). En las primeras 24 horas se observó un alto porcentaje de control en las poblaciones de garrapatas R. microplus y, en los días siguientes al tratamiento, de moscas H. irritans. El producto Effipro Bovis mantuvo controladas las poblaciones de garrapatas R. microplus por 35 días y controló las poblaciones de mosca H. irritans por 84 días, con un tratamiento intermedio de producto a los 42 días de la aplicación del tratamiento.

ABSTRACT The control of parasite populations affecting cattle herds is an urgent need in tropical areas, where the presence of ectoparasites is a serious threat to animal health. The tick Rhipicephalus microplus as well as the fly Haematobia irritans cause considerable economic damages, so the control of ectoparasites in animals has been very important, demanding the use of chemical agents for an effective and safe control either for animals or for the environment. The objective of this study was to determine the effectiveness of Fipronil (Effipro Bovis) in the control of R. microplus and H. irritans in cattle under field conditions, applying field rotation as a strategy. The study was carried out in a herd of 14 animals: Holstein and mestizo Holstein F1 naturally infested. Animals were divided into the control and treated group; all of them evaluated before and after treatment. Three consecutive trials were conducted, applying the treatment with Effipro Bovis, each time infestation levels were reached above 10 ticks per animal. As a result of the first trial, there was a reduction in infestation intensity to 0.9 ticks per animal (97.6 %) and, for H. irritans, 0.8 flies per animal (99.1 %). A high control percentage was observed in the populations of ticks R. microplus in the first 24 hours, and flies H. irritans in the days following the treatment. The product Effipro Bovis kept controlled R. microplus populations for 35 days and H. irritans for 84 days, with an intermediate treatment of the product 42 days after the application.

Antibacterial activity of essential oils from plants grown in Cuba on Salmonella enterica strains

RESUMEN Las infecciones por Salmonella spp. (salmonelosis) son la segunda causa mayoritaria de enfermedades transmitidas por alimentos a nivel mundial. Ante la creciente emergencia de cepas resistentes a antibióticos, se buscan alternativas para el tratamiento; los aceites esenciales son productos que se destacan por sus potencialidades como antimicrobianos. El objetivo de este trabajo fue determinar la actividad antibacteriana de aceites esenciales de plantas cultivadas en Cuba sobre cepas de Salmonella enterica. Los aceites esenciales se obtuvieron por hidrodestilación o expresión. Se realizó la evaluación de la acción antibacteriana de 15 aceites por difusión en agar; se seleccionaron los promisorios y se les determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) y mínima bactericida (CMB) por la técnica de diluciones seriadas. Los aceites esenciales de Ocimum gratissimum L., Lippia graveolens (Kunth) y Thymus vulgaris L. inhibieron el crecimiento de las cepas de Salmonella enterica, incluyendo cepas resistentes a antibióticos. Los valores de CMI y CMB de los aceites oscilaron entre 0,5 mg/mL y 1 mg/mL, respectivamente. Estos aceites esenciales son candidatos promisorios para el desarrollo de productos antibacterianos destinados al control de la salmonelosis.

ABSTRACT Infections caused by Salmonella spp. (salmonellosis) are very frequent, being the second major cause of foodborne diseases worldwide. Given the growing emergence of antibiotic-resistant strains, alternatives are sought for treatment using essential oils as products that stand out for their potential as antimicrobials. The objective of this work was to determine the antibacterial activity of essential oils from plants grown in Cuba on Salmonella enterica strains. The essential oils were obtained by hydrodistillation or expression. The evaluation of the antibacterial action of 15 oils was carried out by agar diffusion. The promising ones were selected and the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) were determined by the serial dilution technique. The essential oils of Ocimum gratissimum L., Lippia graveolens (Kunth) and Thymus vulgaris L. inhibited the growth of Salmonella enterica strains, including antibiotic-resistant strains. MIC and MBC values of the oils ranged between 0.5 mg/mL and 1 mg/mL. These essential oils are promising candidates for the development of antibacterial products for the control of salmonellosis.

Main morphological alterations in ovine oocytes matured in vitro

RESUMEN El ovocito es indispensable para el desarrollo embrionario de un organismo. Actualmente, su calidad se evalúa considerando parámetros morfológicos que permiten identificar alteraciones que comprometen el desarrollo del embrión. Sin embargo, en ovocitos de ovino, hasta el momento, no se han reportado anormalidades morfológicas. El objetivo del presente trabajo fue determinar la frecuencia y el tipo de alteraciones morfológicas en ovocitos de borrega. Para ello se realizaron 10 colectas, de las que se obtuvieron 567 ovarios procedentes de hembras sacrificadas en rastro y, mediante aspiración folicular, se lograron 2 374 ovocitos; todos ellos fueron madurados in vitro. De acuerdo a los criterios de la Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR), 798 ovocitos (33,6 %) se clasificaron de morfología normal y 1 576 (66,4 %) presentaron diferentes alteraciones morfológicas, como citoplasma granuloso (32,6 %), citoplasma incompleto (21,1 %), espacio perivitelino aumentado (11,7 %), presencia de vacuolas (11,6 %), ovocitos degenerados (8,9 %), alteraciones de la zona pelúcida (7 %), exudados citoplasmáticos (4,7 %), dimorfismo del cuerpo polar (0,3 %) y alteraciones producidas por la técnica de manejo, como la ausencia de zona pelúcida (2,1 %). Se concluye que, dada la alta tasa de anormalidades morfológicas en los ovocitos de ovinos madurados in vitro, es importante su minuciosa selección para obtener mejores resultados en el desarrollo embrionario in vitro.

ABSTRACT The oocyte is indispensable for the embryonic development of an organism. Its quality is currently evaluated considering the morphological parameters that allow identifying the alterations that compromise the development of the embryo. So far, no morphological abnormalities have been reported in sheep oocytes. The objective of this study was to determine the frequency and type of morphological alterations in them. For this, 10 collections were carried out, of which 567 ovaries were obtained from slaughtered females and 2 374 oocytes were obtained by follicular aspiration; all of them matured in vitro. According to the criteria of the Association for the Study of Reproductive Biology (ASEBIR), 798 oocytes (33.6 %) were classified as normal morphology and 1 576 (66.4 %) presented different morphological alterations, as granular cytoplasm (32.6 %), incomplete cytoplasm (21.1 %), increased perivitelline space (11.7 %), presence of vacuoles (11.6 %), degenerated oocytes (8.9 %), abnormalities of the pellucid zone ( 7 %), cytoplasm exudates (4.7 %), polar body dimorphism (0.3 %), and alterations produced by the management technique, like the absence of pellucid zone (2.1 %). It is concluded that, given the high rate of morphological abnormalities in the in vitro maturation of oocytes, their detailed selection is important to obtain better results in the in vitro embryonic development.

Identification of gastrointestinal strongyles in goats in localities of Sumbe municipality, Angola

RESUMEN Con el objetivo de identificar los géneros de estrongílidos gastrointestinales de caprinos, se colectaron muestras de heces fecales directamente de la ampolla rectal, en cuatro localidades del municipio Sumbe, provincia Kwanza-Sul, litoral centro de Angola. Se realizó la observación morfológica de las larvas infectantes (L3) y se identificaron cinco géneros de estrongílidos: Haemonchus, Ostertagia, Oesophagostomum, Trichostrongylus y Cooperia que se presentaron en una proporción de 52 %, 36 %, 5 %, 4 % y 3 %, respectivamente, con predominio del género Haemonchus, seguido de Ostertagia y otros estrongílidos en menor proporción, con presencia de infección mixta.

ABSTRACT In order to identify the genus of gastrointestinal strongyles in goats, faecal stool samples of goats were collected directly from the rectal ampulla, in four localities of Sumbe municipality, Kwanza-Sul province, in the central part of Angola. The morphological observation of the infective larvae was carried out (L3), and five strongyles were identified: Haemonchus, Ostertagia, Oesophagostomum, Trichostrongylus, and Cooperia, showing a proportion of 52 %, 36 %, 5 %, 4 %, and 3 %, respectively. Haemonchus genus predominated, followed by Ostertagia and other strongyles in smaller proportion, with the presence of mixed infection.

New trends in the diagnosis of animal viral diseases

RESUMEN El diagnóstico y control de las enfermedades virales de importancia económica ha progresado de forma notable en la última década, gracias a la aplicación de las tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y a las diferentes aplicaciones de la misma, como son la reacción de PCR basadas en la detección de fluorescencia en tiempo real (rPCR), la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y las técnicas basadas en la secuenciación de ácidos nucleicos. Estos enfoques permiten la amplificación, la cuantificación simultánea y el análisis de secuencias de ácidos nucleicos, donde se combinan rapidez con elevadas sensibilidad y especificidad; sus beneficios con relación a los ensayos de PCR convencional o de punto final incluyen, además de un elevado rango dinámico, reducido riesgo de contaminación cruzada, capacidad para ser escalados y cuantificación precisa de la diana, lo que permite la determinación de la carga viral.

ABSTRACT The diagnosis and control of economically important viral diseases have progressed significantly in the last decade due to the application of polymerase chain reaction (PCR) technologies, as well as various applications thereof such as the PCR reaction based on the fluorescence detection in real time (rPCR), the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and the sequencing techniques based on nucleic acids. These approaches allow the amplification, simultaneous quantification and sequence analysis of nucleic acids, combining high speed with sensitivity and specificity, the benefits related to the conventional or endpoint PCR assays, a high dynamic range, a reduced cross contamination, the ability to be scaled, and the precise quantification of the target, allowing the determination of the viral load.

Antibacterial activity of essential oils obtained from plants of Cuban origin against Streptococcus suis

RESUMEN El objetivo de este trabajo fue determinar la actividad antibacteriana de aceites esenciales obtenidos de plantas de origen cubano sobre Streptococcus suis serotipo 2. Los aceites esenciales de Ruta chalepensis L., Piper auritum Kunth, Ocimum sanctum L. y Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake se obtuvieron por hidrodestilación empleando un equipo Clevenger. La actividad antibacteriana de cada aceite esencial se evaluó por el método de difusión en agar; como control se utilizó Ciprofloxacina. Todos los aceites esenciales evaluados inhibieron el crecimiento de S. suis. Los aceites de R. chalepensis y P. auritum evidenciaron la mayor actividad antibacteriana, superior a la de la Ciprofloxacina. Los tratamientos con los aceites esenciales obtenidos de O. sanctum y M. quinquenervia mostraron una actividad moderada en la inhibición del crecimiento de la bacteria. Los aceites esenciales de R. chalepensis y P. auritum poseen potencial para el desarrollo de nuevos antimicrobianos destinados al control de S. suis.

ABSTRACT The aim of this work was to determine the antibacterial activity of essential oils obtained from plants of Cuban origin against Streptococcus suis serotype 2. The essential oils from Ruta chalepensis L., Piper auritum Kunth, Ocimum sanctum L., and Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake were obtained by hydrodistillation using a Clevenger type-apparatus. The antibacterial activity of each essential oil was evaluated by the agar diffusion method and Ciprofloxacin was used as control. All the evaluated oils inhibited the growth of S. suis. The essential oils from R. chalepensis and P. auritum showed the highest activity, superior to that of Ciprofloxacin. The treatments with the essential oils obtained from O. sanctum and M. quinquenervia lightly inhibited the bacterium. The essential oils from R. chalepensis and P. auritum have potential for the development of new antimicrobials to control S. suis.

Reproductive biotechnology applied to the Bubalus bubalis genetic improvement in Cuba

RESUMEN El presente trabajo se realizó con el objetivo de establecer una metodología para la obtención de embriones en Bubalus bubalis en condiciones tropicales. Se trabajó con ovarios de hembras bufalinas faenadas de 66±6 meses de edad y 475±25 kg de peso, de los que se extrajeron los complejos cúmulo-ovocitos inmaduros por el método de punción folicular de los folículos que presentaban diámetros menores de 3 mm, entre 3 y 5; los mayores de 5mm con una aguja de 18 G adosada a una jeringuilla de 10 mL. La maduración in vitro se realizó en medio TCM199 y se evaluó mediante la condensación de la cromatina y la presencia del primer cuerpo polar. La fertilización in vitro se hizo en medio Talp-Fértil utilizando pastillas de semen bubalino congelado, a una concentración de 4x106 spz/mL. Los embriones se cultivaron sobre una monocapa de células del cúmulo en medio SOFaa. Se contabilizaron 8,02 folículos/ovario de diferentes diámetros con una relación folicular según su diámetro de 53,01 %, 28,23 % y 18,75 %. Se obtuvo 3,93 CCO/ovario de recolección y, a partir de estos, se maduró el 58 %, pasaron a la fertilización en grupos de 25 a 35 ovocitos por 400 µL de medio, llegando al 38,79 % de clivaje y 17 % de embriones bubalinos que desarrollaron adecuadamente hasta blastocito. A partir de estos resultados se concluye que el protocolo más apropiado para la mejora genética de la especie es la combinación de la técnica de punción folicular de los ovarios, seguido de la maduración de los ovocitos durante 24 horas en condiciones similares a las del bovino, pero fertilizados con 4x106 spz/mL, seguido de cultivo en medio SOFaa.

ABSTRACT The present work was aimed at establishing a methodology for obtaining Bubalus bubalis embryos under tropical conditions. The study was focused on ovaries of slaughtered buffalo females of 66 ± 6 months of age and 475 ± 25 kg of weight, from which the immature cumulus-oocyte complexes were extracted by the follicular puncture method, having diameters less than 3 mm, between 3mm and 5mm; and those greater than 5 mm using an 18 G needle attached to a 10 mL syringe. In vitro maturation was carried out in TCM199 medium and it was evaluated by chromatin condensation and the presence of the first polar body. In vitro fertilization was performed in Talp-Fertile medium using frozen buffalo semen tablets, at a concentration of 4x106 spz/mL. Embryos were cultured on a monolayer of cumulus cells in SOFaa medium. There were 8.02 follicles/ovary with different diameters: 53.01 %, 28.23 % and 18.75 %. There were 3.93 COC/collection ovaries and, from them, the 58 % was matured. They passed to the fertilization stage in groups of 25 to 35 oocytes per 400 μL of medium, reaching 38.79 % of cleavage and 17 % of buffalo embryos, which developed properly until reaching the blastocyst stage. Based on these results it is concluded that the most appropriate protocol for the genetic improvement of the species is the combination of the follicular puncture method, followed by the maturation of the oocytes for 24 hours under conditions similar to those of cattle, but fertilized with 4x106spz/mL, followed by cultivation in SOFaa medium.