Revista de Protección Vegetal

Advances in the diagnosis of bacteriol wilt (Ralstonia solanacearum): current situation in Cuba and perspectives

La marchitez bacteriana causada por Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi, es una devastadora enfermedad que afecta a varios cultivos de importancia económica a nivel mundial. La capacidad de supervivencia del patógeno y la ocurrencia de infecciones latentes hace que el diagnóstico tenga una importante función en la prevención de la enfermedad. El objetivo de este trabajo fue realizar una revisión crítica de las técnicas diseñadas para su diagnóstico y analizar los factores que influyen en el desempeño de las mismas. Los métodos como el cultivo in vitro y las pruebas de patogenicidad son laboriosos, dependen de la interacción planta-patógeno y tardan en arrojar los resultados. Las técnicas basadas en principios serológicos y en la detección de ácidos nucleicos permiten la detección sensible y automatizada del patógeno; sin embargo, la serología depende de la calidad de los anticuerpos y las técnicas moleculares son afectadas por sustancias inhibidoras presentes en las muestras y por la especificidad de los oligonucleótidos. El análisis de la probabilidad post-test en función de la prevalencia, permite decidir con mayor precisión las técnicas apropiadas para el diagnóstico. El uso combinado de técnicas basadas en diferentes principios biológicos aumenta la fiabilidad del diagnóstico, y se recomienda para los procedimientos de cuarentena y certificación de material de importación que se realizan en Cuba. El empleo de una nueva técnica requiere de la comprobación de su robustez mediante ensayos intra e interlaboratorios, antes de ser implementada en los sistemas de diagnóstico.

Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi, is a devastating plant disease that affects several crops of worldwide economic importance. The pathogen ability for surviving in different environments and causing latent infections becomes an accurate diagnosis as a key point for the disease prevention. The aim of this work was the critical review of these techniques and the analysis of those factors affecting their performance parameters. Traditional methods based on in vitro cultures and pathogenicity tests are laborious, dependent of plant pathogen interactions and slow for obtaining the results. Advanced techniques based on serological principles and nucleic acid detection allow the automated and sensitive pathogen detection, but serology depends on antibody quality and molecular techniques are limited by oligonucleotide specificity and presence of inhibitory substances in the samples. Post-test probability analysis in function of the prevalence provides a higher accuracy in the decision making about the appropriate techniques for diagnosis. Combined use of several techniques based on different biological principles increases diagnosis reliability, and is therefore recommended for quarantine and certification of plant material imported by Cuba. The inclusion of a new technique into a diagnosis scheme requires a previous exhaustive testing of its performance with inter and intra laboratories evaluations.

Interspecific competition between Heliothis virescens (F.) and Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera: Noctuidae) in the chickpea crop **(Cicer arietinum L.)**

Heliothis virescens (F.) y Spodoptera frugiperda Smith se presentan simultáneamente sobre el cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.) alimentándose ambas del follaje, por lo que fue objetivo del presente trabajo determinar cómo se articulan sus poblaciones. Para ello, durante las campañas 2008-2011, se realizaron muestreos del tipo sistemático con frecuencia semanal durante el ciclo del cultivo en las variedades Nacional 29 y JP- 94, en tres unidades productivas de la provincia Las Tunas (Cuba). En cada muestreo se evaluó la abundancia y frecuencia relativa de ambos lepidópteros sobre 50 plantas por parcela. Se observó una disminución en ambos indicadores de las poblaciones de S. frugiperda a favor de H. virescens, lo que indicó el empleo del modelo de Lotka-Volterra de competencia interespecífica con el que se determinó la capacidad de carga, tasa intrínseca de incremento y el coeficiente de competición de ambas. Se elaboraron las isóclinas generadas por el modelo logístico. Se corroboró que las diferencias en la abundancia de estas especies en el cultivo responden a una competencia interespecífica por explotación de los recursos. Los resultados obtenidos constituyeron base para la estimación de 0,5 a 1 larva por planta como índice de señalización de H. virescens en garbanzo.

Systematic samplings were conducted in the chickpea varieties Nacional 29 and JP-94 in three production units of Las Tunas province, Cuba, with a weekly frequency during each crop growing season from 20082011. The relative abundance and frequency of Heliothis virescens (F.) and Spodoptera frugiperda Smith were evaluated on 50 plants per plot in each sampling. S. frugiperda populations were observed to decline in favor of H. virescens. The carrying capacity, the intrinsic rate of increase and the coefficient of competition of both species were determined using the Lotka-Volterra model of interspecific competition. The isoclines generated by the logistic model were determined. It was corroborated that the differences in the abundance of these species on the crop are a response to an interspecific competition for exploitation of resources. The results obtained were the base for the estimation of 0.5 to 1 larva per plant as a signaling index of H. virescens in chickpea.

**Intraspecific variability of Phytophthora palmivora Butler (Butler) strains isolated from avocado (Persea americana Mill.) orchards on Cuba**

Se utilizaron en el estudio ocho cepas de Phytophthora palmivora Butler (Butler) obtenidas de jardines de aguacateros de la región occidental de Cuba, y se describieron los patrones de crecimientos de las colonias en medio agar papa dextrosa (PDA), agar zanahoria (AZ), agar jugo vegetal V8 (AV8) y agar malta (AM), así como los tipos de esporangios presentes. Se evaluó la variabilidad intraespecífica de los aislamientos en base a las dimensiones de los esporangios y de sus papilas. Las cepas mostraron un patrón de crecimiento de las colonias uniforme en cada uno de los cuatro medios de cultivo, aracnoide en los medios PDA y AM y estrellado en AV8 y AZ. Se observó una amplia diversidad en los tipos de esporangios, generalmente ovoides-elipsoides, obpiriformes, esféricos y distorsionados y con pedicelos cortos (2-5 µm), aspectos que se corresponden con la especie P. palmivora. Las dimensiones de los esporangios oscilaron entre 25 µm y 80 µm (promedio 48,8 µm ± 9,1 µm) de largo y 17,5 µm a 52,5 µm de ancho (promedio 31,8 µm ± 5,5 µm). Las papilas alcanzaron de 2,5 µm a 10 µm de largo (promedio 5,7 µm ± 1,7 µm) y entre 2 µm y 10 µm de ancho (promedio 6,5 µm ± 1,6 µm). El Análisis de Componentes Principales demostró la existencia de variabilidad en las dimensiones de los esporangios y las papilas, en base al largo y ancho de los esporangios, la relación largo/ancho de los mismos, el ancho de las papilas y la relación largo/ancho de las papilas.

The colony patterns were described for eight P. palmivora strains isolated from avocado orchards located in the western Cuban region, that were grown on potato dextrose agar (PDA), malt extract agar (AM), V8 agar (AV8) and carrot agar (AZ). The sporangia shapes observed in the P. palmivora strains were also described. The intraspecific variability was evaluated based on the size of sporangia and papillae. The strains showed a uniform colony pattern on each of the culture media used, arachnoid on PDA and AM media and stellate on AV8 and AZ media. A wide diversity of types of sporangia was observed, mostly ovoid-ellipsoid, obpyriform, spherical and distorted with short pedicels (2-5 µm). Sporangia shape ranged between 25 µm and 80 µm long (average 48,8 µm ± 9,1 µm) and 17,5 µm to 52,5 µm in breadth (average 31,8 µm ± 5,5 µm) with prominent papillae ranging from 2,5 µm to 10 µm long (average 5,7 µm ± 1,7 µm) and between 2 µm to 10 µm in breadth (average 6,5 ± 1,6 µm). The Principal Component Analysis showed a great variability considering both the sporangia and papillae sizes with the length and breadth of the sporangia and their ratio, the width and the length/breadth ratio of the papillae as the most variable characters.

Induction of defence mechanisms in tomato (Solanum lycopersicum L. cv. Amalia) plants by essential oils

Se estudió el efecto de diferentes aceites esenciales en la inducción de mecanismos defensivos en tomate (Solanum lycopersicum L. cv. Amalia). Las plantas se asperjaron con diferentes aceites e inductores como el Bion, y se tomaron muestras de hojas a las 24, 72 y 144 horas posteriores a la aspersión. Se determinó la concentración de proteínas totales, así como la actividad enzimática específica de peroxidasas, polifenoloxidasas, fenilalanina amonio liasas y quitinasas. Los aceites esenciales obtenidos a partir de subproductos de la industria de cítricos y de melaleuca (Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake) indujeron las mayores actividades enzimáticas de peroxidasas, polifenoloxidasas y quitinasas. El ácido jasmónico y los fosfolípidos fueron los responsables de la inducción de fenilalanina amonio liasas.

In this work, the effect of different essential oils was evaluated using tomato cv. Amalia plants. The plants were sprayed with different oils and inductors as Bion, and leave samples were taken at 24, 72 and 144 hours after spray. Total protein concentration and specific enzymatic activities of peroxidases, polyphenoloxidases, phenylalanine ammonia lyase and chitinases were determined. The essential oils obtained from citric fruit scraps and Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake induced higher peroxidases, polyphenoloxidases and chitinases enzymatic activities. Jasmonic acid and phospholipids were responsible for phenylalanine ammonia lyase induction.

Antagonism of Trichoderma spp. isolates against Didymella bryoniae (Fuckel) Rehm

El presente trabajo tuvo como objetivo determinar los modos de acción de aislamientos de Trichoderma spp. frente a Didymella bryoniae (Fuckel) Rehm, mediante la técnica de cultivo dual. Se evaluaron la competencia por el sustrato, el micoparasitismo y la antibiosis de aislamientos de Trichoderma asperellum Samuels (Ta.), Trichoderma harzianum Rifai (Th.) y Trichoderma sp. (T.). A partir de las 72 horas, todos los aislamientos presentaron efecto inhibitorio del crecimiento del patógeno superior al 50%. Los aislamientos Ta. 12, Ta. 79, Ta. 85 y T. 81 crecieron más del 75% del área de la placa, por lo que se ubicaron en la clase 1 de la escala de Bell. La velocidad de crecimiento de los dos últimos aislamientos aumentó a partir de las 72h, lo que pudiera estar relacionado con compuestos atrayentes, emanados por el patógeno. Los mejores indicadores de parasitismo los presentaron los aislamientos Th. A-34 y Ta. 85 con tres tipos de interacción hifal (enrollamiento, vacuolización y penetración). Los metabolitos volátiles producidos por Th. A-34, Ta. 79 y Ta. 85 y no volátiles emanados de Th. A-34, Ta. 79 y T. 81, inhibieron el crecimiento del patógeno desde las 72h. De acuerdo a los modos de acción exhibidos, los aislamientos Th. A-34 y Ta. 85 se perfilan como posibles candidatos a ingredientes activos de bioplaguicidas, lo que requiere de su evaluación en el control de D. bryoniae en condiciones de campo.

The aim of this work was to determine the action modes of Trichoderma spp. against Didymella bryoniae (Fuckel) Rehm. The competition by the substrate, antibiosis and mycoparasitism of Trichoderma asperellum Samuels (Ta), Trichoderma harzianum Rifai (Th) and Trichoderma sp. (T.) was assessed by the dual culture method. After 72 hours, all the isolates showed an inhibitory effect over the pathogen growth higher than 50%. The isolates Ta. 12, Ta. 79, Ta. 85 and T. 81 grew more than 75% of the plate area; thus, they were placed in the class 1 of Bell's scale. The growth rate of the two latter isolates increased from the 72 h, which could be related to attractive compounds emitted by the pathogen. Th A-34 and Ta. 85 presented the best indicators of parasitism with three types of hyphal interaction (coiling, vacuolization and penetration). The volatile metabolites produced by Th-34, Ta. 79 and Ta. 85 and those non-volatile emanating from Th A-34, Ta. 79 and T. 81 inhibited the pathogen growth from the 72h. According to the modes of action exhibited by the different isolates, Th A-34 and Ta. 85 were chosen as the best isolates for the control of D. bryoniae. They are emerging as potential candidates for biopesticide active ingredients, although their evaluation in the control of D. bryoniae under field conditions is required.

Compatibility of four pesticides belonging to different chemical groups with Lecanicillium (Verticillium) lecanii (Zimm.) Zare & Gams)

El objetivo del presente trabajo fue determinar la compatibilidad de cuatro formulados plaguicidas de diferentes grupos químicos (imidacloprid, metamidofos, dicofol y abamectina), con el hongo entomopatógeno Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & Gams cepa Y-57. Los ensayos se realizaron in vitro con concentraciones de los productos de 10, 100, 200, 500, 1000 y 2000 mg.L-1, evaluándose la inhibición del crecimiento de la colonia del hongo en medio sólido, así como, el efecto de los productos químicos sobre la capacidad esporulativa y la germinación de los conidios. Dicofol se clasificó como muy tóxico (T=8,6), metamidofos ligeramente tóxico (T=52,69), y abamectina e imidacloprid resultaron compatibles con el hongo entomopatógeno, con valores de T > 60. Dicofol inhibió totalmente la germinación de los conidios del hongo a todas las concentraciones estudiadas y metamidofos a partir de la dosis de campo, mientras que abamectina e Imidacloprid no produjeron afectación.

The objective of the present work was to determine the compatibility of four formulated pesticides of different chemical groups (imidacloprid, methamidophos, dicofol, and abamectin) with the entomopathogenic fungus Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & Gams) strain Y-57. The assays were carried out in vitro with the following concentrations of the pesticides: 10, 100, 200, 500, 1000 and 2000 mg.L-1. Growth inhibition of the fungus colony on solid media, as well as the effect on the spore production capacity and conidia germination were evaluated. Dicofol was classified as very toxic (T=8,6), methamidophos as lightly toxic (T=52,69), and abamectin and imidacloprid were compatible with the entomopathogenic fungus, with values of T> 60. Dicofol inhibited the conidia germination totally at all the studied concentrations and methamidophos from the field dose (1000 mg.L-1). No effect was observed with abamectin or Imidacloprid.

**Effect of the essential oil of Piper auritum Kunth and its components against Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson and Xanthomonas campestris pv campestris (Pammel) Dowson**

El objetivo de este trabajo fue identificar el(los) componente(s) del aceite esencial de Piper auritum asociado(s) al efecto antibacteriano sobre Xanthomonas albilineans y Xanthomonas campestris pv. campestris. El aceite esencial de P. auritum se obtuvo por hidrodestilación empleando un equipo Clevenger. Se realizó la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) por el método de las diluciones seriadas frente a ambas bacterias. Se identificaron los componentes responsables de la actividad biológica mediante el análisis por CG/EM y evaluación de la actividad antibacteriana de las fracciones del aceite esencial, obtenidas por cromatografía seca. El aceite mostró una fuerte actividad antibacteriana con CMI y CMB de 0,12 y 0,25 mg.ml-1 frente a X. albilineans y X. campestris pv. campestris, respectivamente. El principal componente responsable de la actividad biológica observada fue el safrol; sin embargo, el aceite esencial en su conjunto reúne todos los requisitos para ser utilizado como antibacteriano promisorio.

The aim of this study was to identify the component (s) of the essential oil of Piper auritum associated with the antibacterial effect against Xanthomonas albilineans and Xanthomonas campestris pv. campestris. The essential oil of P. auritum was obtained by hydrodistillation in a Clevenger type apparatus. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum Bactericidal Concentration (MBC) against both bacteria were determined by the method of serial dilutions. The components responsible for the biological activity were identified by fractionating the essential oil by dry chromatography, and the fractions were investigated by GC / MS and tested against the above mentioned bacteria. This oil has a strong antibacterial activity with MIC and MBC of 0,12 and 0,25 mg.ml-1 against X. albilineans and X. campestris pv. campestris, respectively. The principal component responsible for the observed biological activity was safrole; however, the whole essential oil met all the requirements for being used as a promissory antibacterial agent.

Optimization of the amplification by PCR of the endoglucanase gene in Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi

El esquema de clasificación actual del agente etiológico de la marchitez bacteriana (Ralstonia solanacearum) se basa en el análisis de la secuencia del gen de la endoglucanasa de esta bacteria. El objetivo de este estudio fue optimizar la amplificación por PCR de este gen. Las condiciones de PCR fueron predeterminadas in silico con el empleo del programa OLIGO versión 7.53. Se estimó el efecto de la concentración celular en la eficiencia de la amplificación con diluciones seriadas de suspensiones bacterianas de R. solanacearum. Se evaluó un protocolo de PCR de dos pasos con el empleo del kit comercial GoTaq® DNA Polimerasa para los ensayos in vitro. La concentración celular fue un factor crítico para la amplificación con un valor óptimo de 10(8) UFC.ml-1. En el protocolo estandarizado se redujeron los tiempos en los ciclos de desnaturalización inicial y extensión final y se combinaron las etapas de hibridación y la extensión en un solo paso, por lo que resultó un protocolo más corto que el original. El análisis filogenético de la secuencia de este gen, permitirá estudiar la diversidad de los aislados cubanos de R. solanacearum, establecer relaciones con aislados de otras regiones geográficas y perfeccionar las estrategias de manejo de la enfermedad.

The current classification scheme of the causal agent of the bacterial wilt Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi is based on the analysis of the endoglucanase gene sequence of the bacterium. The objective of this paper was to optimize the PCR amplification of this gene. PCR parameters were determined using the OLIGO software version 7.53 for in silico analyses. The effect of cell concentration on amplification efficiency was assessed by using serial dilutions of R. solanacearum suspensions. For the in vitro assays, a two step-PCR protocol was evaluated with the GoTaq® DNA Polimerasa kit. The cell concentration was a critical factor on amplification efficiency with an optimal value of 10(8) CFU.ml-1. Time was reduced for the initial denaturalization and final extension phases and hybridization and extension were combined in a single step resulting in a 57 minute shorter-PCR program than the original protocol. The phylogenetic analysis of this gene sequence will allow performing diversity studies of Cuban isolates of R. solanacearum, establishing comparative relationships with isolates of other geographical locations and updating the disease management strategies.

Natural enemies associated to Raoiella indica Hirst (Acari: Tenuipalpidae) in Santiago de Cuba

El presente trabajo tuvo como objetivo identificar los enemigos naturales asociados a poblaciones de Raoiella indica Hisrt (Acari: Tenuipalpidae) en zonas de Santiago de Cuba y para ello se realizaron muestreos mensuales durante dos años a especies de plantas hospedantes. Se colectaron, anotaron e identificaron los enemigos naturales presentes y se determinó la frecuencia de aparición de los mismos. Amblyseius largoensis Muma fue el único representante de la familia Phytoseiidae y se encontró en el 74% de las plantas hospedantes seguido por Chrysopa cubana Hagen (Neuroptera: Chrysopidae), Sterthprus sp., Scymnus sp. (Coleoptera: Coccinellidae) y Orius insidiosus Say (Hemiptera: Anthocoridae) con 42,8; 28,5; 19,1 y 14.2% respectivamente. A. largoensis fue el más frecuente seguido de C. cubana en el 100% y 54,1% de los muestreos realizados respectivamente.

A research to identify the natural enemies associated with Raoiella indica Hisrt (Acari: Tenuipalpidea) was carried out in Santiago de Cuba. Samples were taken monthly from different species of R.indica host plants during two years The natural enemies were collected, recorded and identified; their frequency of appearance was also determined. Amblyseius largoensis Muma was the only representative of the family Phytoseiidae and it was observed in 74% of the host plants, followed by Chrysopa cubana Hagen (Neuroptera: Chrysopidae), Stethorus sp., Scymnus sp. (Coleoptera: Coccinellidae), and Orius insidiosus Say (Hemiptera: Anthocoridae), with 42.8%, 28.5%, 19.1% and 14.2%, respectively. This phytoseid mite was also the most frequent species together with C. Cubana, they were found in 100% and 54.1% of the samples.

Effect of arbuscular mycorrhizas and Meloidogyne spp. on tomato (Solanum lycopersicum L.)

El estudio se desarrolló en la Universidad de Granma (Cuba) en el período comprendido de octubre/2007 a enero/2008, para determinar los efectos de las micorrizas arbusculares y Meloidogyne spp., en el cultivo del tomate (Solanum lycopersicum L.) cv. Vyta. Se utilizaron siete tratamientos, consistentes en aplicaciones simples y combinadas de un concentrado de cepas nativas y no nativas de micorrizas (Glomus mosseae (Gerdemann y Trappe) y Glomus sp. (Schenck y Smith), incluyendo un testigo y dos niveles poblacionales de Meloidogyne spp., con 30 repeticiones, los cuales se establecieron sobre un diseño completamente aleatorizado en condiciones semi-controladas, con arreglo factorial. Se utilizaron macetas de 2 kg de capacidad, que contenían un sustrato estéril, compuesto por una mezcla de suelo y estiércol ovino en proporción 3:1 v:v y una población de Meloidogyne spp. procedente de Granma. Se evaluaron las variables: índice de agallamiento e indicadores del crecimiento de las plantas: altura promedio (cm), masa seca promedio (g) y el rendimiento (kg.planta-1) a los 60 días después de la inoculación del nematodo. Los datos fueron procesados mediante un análisis de varianza y comparación de medias por la prueba del rango múltiple de Duncan (p<0,05). Los mejores resultados para los indicadores del crecimiento se obtuvieron cuando se aplicó el concentrado de cepas nativas y su combinación con Glomus mosseae y Glomus sp., y el menor índice de infestación del nematodo (1,5 huevos-juveniles infestivos (Ji).g-1 de sustrato). Sin embargo; al incrementar la concentración del inóculo a 2,5 huevos-juveniles infestivos (Ji).g-1 de sustrato, no hubo efecto significativo de las micorrizas arbusculares en la reducción de los daños producidos por Meloidogyne spp.

This study was carried out at the University of Granma (Cuba) from October 2007 to January 2008 in order to determine the effect of arbuscular mycorrhizas and Meloidogyne spp. on tomato (Solanum lycopersicum L.), var. Vyta. Seven treatments of single or combined applications of native and non-native strains(Glomus mosseae (Gerdemann and Trappe), and Glomus sp. (Schenck and Smith), of arbuscular mycorrhizas and an uninoculated control) and two levels of Meloidogine spp. were included in a completely randomized design set up in a factorial arrangement with thirty replicates under semi-controlled conditions. Two kg plastic pots containing a sterile substrate with a mixture of soil and ovine manure in a 3:1 v:v. ratio, as well as a population of Meloidogyne spp. from Granma were used. The gall index and plant growth parameters such as average height (cm), average dry weight (g) and crop yield (kg.plant-1) were evaluated 60 days after nematode inoculation. The data were analyzed by an analysis of variance and the means compared by Duncan's multiple range test (p<0,05). The results indicated that the plant growth parameters evaluated were higher when the native strain was combined with Glomus mosseae and Glomus sp. and the nematode infection level (1,5 eggs.g-1 substrate) was the lowest. However, when the inoculum concentration was increased to 2,5 eggs.g-1 substrate, no significant effect of the arbuscular mycorrhizas on the reduction of the damages produced by Meloidogyne spp. were observed.

Response surface methodology to evaluate stability of a biological control agent in storage conditions

Se evaluaron 8 formulaciones elaboradas según combinación de polvo puro del hongo nematófago Pochonia chlamydosporia var. catenulata IMI SD 187, uso de zeolita como relleno (50%, 80%, 90%) y sellaje (ausencia o presencia de aire atmosférico), y se modificaron las condiciones de almacenamiento (4°C ó 25°C), para un total de 16 tratamientos. Para cada tratamiento, se midió el porcentaje de humedad y la concentración de hongo viable (UFC.g-1). Para identificar estabilidad se empleó la prueba no paramétrica de Friedman comparando cuatro momentos de evaluación (inicio, 15, 30 y 45 días). Mediante un análisis de componentes principales se identificaron los factores de mayor incidencia en la germinación de clamidosporas. Finalmente, por medio de la metodología de superficie respuesta se obtuvo la combinación de porcentaje de relleno de zeolita y temperatura de almacenamiento que favoreció la germinación. En todos los tratamientos el porcentaje de humedad permaneció por debajo del 10%, pero en solo 6 tratamientos la concentración de hongo viable se mantuvo estable. El oxígeno y nitrógeno del aire no modificaron significativamente los resultados. Se localizó un punto de máxima germinación de clamidosporas con el empleó de 30 a 40% de zeolita como relleno, almacenando el producto a 15°C. Se propuso un diseño compuesto central 10+2x2+2 para validar el proceso.

Eight formulations elaborated according to combinations of the pure powder of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia var. catenulata IMI SD 187, zeolite as additive at 50%, 80% or 90%, sealing in absence or presence of atmospheric air, and storage at 4°C or 25°C, for 16 treatments were evaluated. For each treatment, the percentage of humidity and the concentration of viable fungi (UFC.g-1) were measured; for stability identification, Friedman's non-parametric test was used comparing four evaluation times (beginning, 15, 30 and 45 days). By means of the principal component analysis, the main factors influencing chlamydospore germination were identified. Finally, using the response surface methodology, a maximum of germination percentage was identified. In all the treatments, the humidity percentage remained below 10%, but the concentration of viable fungi was stable only in six treatments. Results were not significantly modified by the presence of air in the packages. A point of maximum chlamydospore germination was reached using 30 to 40% of zeolite and the storage at 15°C. A compound central design 10+2x2+2 was recommend to validate the process.

**Molecular identification of Cuban isolates of Mycosphaerella fijiensis Morelet**

El objetivo del presente trabajo consistió en identificar molecularmente aislados de Mycosphaerella fijiensis Morelet, obtenidos de hojas de bananos infectadas del cultivar susceptible Grande naine. Para la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizaron oligonucleótidos específicos (MF137 y R635) para M. fijiensis correspondientes a las regiones del ADN ribosomal (ADNr). Los nueve aislados mostraron una banda de aproximadamente 1018 pb, la que correspondió con el tamaño esperado. Este resultado constituye el primer informe de la identificación molecular de aislados monoascospóricos de M. fijiensis en Cuba. Esto podría contribuir al establecimiento de colecciones de cultivos de este hongo fitopatógeno adecuadamente identificadas.

The aim of this work was to identify isolates of Mycosphaerella fijiensis Morelet obtained from infected leaves of Grande naine. Specific oligonucleotides (MF137 y R635) for M. fijiensis were used to amplify the ADNr (ITS1) by the polymerase chain reaction (PCR). A band of approximately 1018 pb corresponding with the expected size was observed in the nine isolates. This is the first report of molecular identification of Cuban M. fijiensis monoascosporic isolates and this result will help to establish appropriately identified culture collection.

Effect of four essential oils on Fusarium sp.

En este trabajo se determinó la actividad antifúngica in vitro, de cuatro aceites esenciales, sobre tres aislados de Fusarium spp. (F2 y F5 de Fusarium solani (Martius) Appel & Wollenweber emend. Snyder & Hansen y F3 de Fusarium redolens Wollenweber), patógenos en el cultivo del tomate (Solanum lycopersicum L.) en Cuba. El bioensayo se realizó según un diseño completamente aleatorizado y se utilizó el método de discos de papel de filtro inoculados con los aceites, colocados en contacto directo con los discos de los aislados de Fusarium. Se evaluó el crecimiento radial de los hongos hasta las 96 horas. El aceite de Piper auritum Kunth (caisimón de anís) provocó total inhibición en el crecimiento de los aislados del fitopatógeno; por su parte, el aceite de Piper aduncum subsp. ossanum (C. DC.) Saralegui (platanilllo de Cuba) demostró poseer alto poder fungistático. El aceite de Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake (melaleuca) produjo poca inhibición del crecimiento en los tres aislados, y el de Citrus sinensis L. Osbeck (naranjo dulce) (a la concentración evaluada) no inhibió ningún aislado, lo que limita el posible uso de estos en la práctica. El aceite de caisimón de anís, resultó ser el más destacado, se recomienda continuar investigando sus propiedades para el control de fitopatógenos.

In this work, the antifungal activity of four natural extract essential oils was determined in vitro on three isolates of Fusarium spp (F2 and F5 of Fusarium solani (Martius) Appel & Wollenweber emend. Snyder & Hansen and F3 of Fusarium redolens Wollenweber), pathogens in the tomato (Solanum lycopersicum L.) crop in Cuba. The bioassay was performed as a completely randomized design using the method of filter paper disks inoculated with the oils placed in direct contact with the discs of the Fusarium isolates. The fungal radial growth was evaluated for up to 96 hours. The Casimon of anise (Piper auritum Kunth) oil produced complete growth inhibition of the isolates; meanwhile, the oil from the platanillo of Cuba (Piper aduncum subsp. ossanum (C. DC) Saralegui) showed to have a high fungistatic power. Melaleuca oil (Melaleuca quinquinervia (Cav) ST Blake showed little growth inhibition in the three isolates, whereas any of the isolates was inhibited by Citrus (Citrus sinensis L. Osbeck) at any of the concentration tested, which limits the possible use of these in the practice. The Casimon of anise oil was the most prominent, and it is recomended to be further nvestigated for its properties for the control of plan pathogens.

New host of phytoplasmas in Cuba

Diagnosis and characterization of diseases and some alternative for their management in crops of economic importance

**Investigation, develop and innovation of Pochonia chlamydosporia var.catenulata as a microbial agent for the control of root knot nematodes**