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Genes HLA en una muestra de la población cubaGenes cubana

Los antígenos codificados por los genes HLA tienen una gran importancia para el trasplante así como constituyen marcadores genéticos para estudios antropológicos y están asociados a diversas enfermedades en cuya etiopatogenia pueden estar involucrados mecanismos inmunológicos. En este estudio se determina la distribución de los alelos HLA en la población cubana de Ciudad de La Habana, como área cosmopolita. Fueron tipados 129 donantes de sangre sanos (70 blancos, 42 mestizos y 17 negros) por la técnica de tipaje de ADN para los alelos HLA -A, B, C y DRB1 mediante PCR y tipaje de oligonucleótidos. El análisis de la frecuencia génica (FG) de cada locus mostró los resultados siguientes: HLA -A * 0201 (12,3%),* 0301 (8,07%), * 2301 (7,8%), * 2402 (7,8%), * 0101 (6,7%) y * 2902 (6,4%): HLA - B * 35 (9,7%), B * 44 (9,33%), B * 07 (8,89%) y B * 53 (7,6%): HLA - C * 04 (17,35%),* 07 (15,5%),* 0702 (7,20%), * 0602 (6,77) y *0802 (5,9%): HLA - DR * 02 (14,61%),* 04 (14,1%), * 0701 (12,82%), * 0103 (12,25%), * 03 (11,9%), * 11 (11,9%), * 13 (11,51%) y * 01 (6,72%). Se encontró una frecuencia elevada en la distribución de un grupo de alelos, lo que podría estar en relación con ciertas combinaciones que confieran ventajas evolutivas contra patógenos, respondiendo a los llamados genes de protección para ciertas enfermedades en nuestra población.

The antigens coded by the HLA genes have a great importance in transplantation, and as genetic markers for anthropological studies, and they are associated to diverse illnesses, in whose pathogenic immunology mechanisms they could be involved. In this study, the distribution of HLA alleles was determined in the Cuban population of Havana City, as a cosmopolitan area 129 healthy blood donors were studied (70 whites, 42 mixed blood (black x white) and 17 blacks), by DNA typing for HLA-A, B, C and DRB1 alleles using PCR and oligonucleotide typing. The gene frequency analysis (GF) of each locus showed the following results: HLA-A * 0201 (23,2%), * 0301 (15,5%), * 2301 (14,7%), * 2402 (14,7%), * 0101 (13,1%) and * 2902 (12,4%): HLA-B * 35 (18,6%), * 44 (17,8%), * 07 (17%) and * 53 (14,7%): HLA-C * 04 (31,7%), * 07 (28,6%), * 0702 (13,9%), * 0602 (13.1) and * 0802 (11,6%): HLA-DR * 02 (27,1%), * 04 (26,3%), * 03 (22,4%), * 11 (22,4%), * 13 (21,7%) and * 01 (13,9%). A high frequency in the distribution of a group of alleles was found. This fact could be related to combinations that give evolutionary advantages against pathogens in our population.

Conservación por congelación de Bordetella pertussis y Corynebacterium diphtheriae, empleados en la producción de vacunas para uso humano

En el presente estudio se evaluó el método de congelación a -70ºC para la preservación de Bordetella pertussis y Corynebacterium diphtheriae. Para verificar el sustento de los cultivos se realizó un adecuado control de calidad, que incluyó comprobación de pureza, viabilidad y estabilidad de las propiedades de interés. En este trabajo se probaron diferentes formulaciones. Se seleccionó la que arrojó los mejores resultados y se realizó un estudio de mantenimiento de las características evaluadas durante el tiempo. Para medir determinados parámetros se realizaron procesos a escala industrial, empleándose para esto un biorreactor Chemap de 35 L. Se tomaron como referencia los valores obtenidos por las cepas conservadas por liofilización. De esta forma se buscaron alternativas y soluciones a problemas presentados en su conservación. Los resultados obtenidos sugieren la posible inclusión en el Programa de Mantenimiento establecido.

In this study the method of -70ºC freezing, for the preservation of Bordetella pertussis and Corynebacterium diphtheriae, was evaluated. An adequate quality control, which included purity, viability and stability testing of the main characteristics, was carried out to verify culture maintenance. For this study different formulations were tested. The one with the best results was selected and a study of maintenance of the characteristics was evaluated through time. In order to measure certain parameters, some industrial scale processes were performed, using a 35 L Chemap bio-reactor. The values obtained from lyophilization-preserved strains were taken as a reference. Thus, the search for alternatives and solutions to problems in their preservation was carried out. The results obtained suggest their possible inclusion in the already established Maintenance Program.

Guía para la estandarización de técnicaGuía técnicas inmunoenzimáticas en ensayos de vacunas

Se realizó una revisión sobre la estandarización de técnicas inmunoenzimáticas para ensayos preclínicos y clínicos de vacunas, elaborándose una guía práctica. Se analizan los principios a usar y los pasos a seguir para la optimización de un ensayo, incluyendo la preparación de estándares y controles. Se exponen nuestras experiencias.

The standardization of enzyme immunoassays, for use in evaluation of pre-clinical and clinical vaccine trials, was reviewed. A practical guide was made. The immunoassay principles and the assay optimization step - including the preparation of standards and controls - are analyzed. Our experience is presented.

Restauración en el Inmunoblotting de proteínas de Neisseria meningitidis dañadas por calor y agentes reductores

En este trabajo se utilizaron cinco detergentes para restaurar las proteínas de membrana externas (PME) del meningococo dañadas por el efecto del calor y de agentes reductores utilizados en el Inmunoblotting. La acción de los detergentes fue evaluada en la solución de lavado, en el diluente de la muestra y del conjugado. Las bandas de proteínas, reconocidas por la IgG del suero, fueron identificadas usando un conjugado anti IgG humana peroxidasa. Los antígenos reconocidos por el control positivo se corresponden con las proteínas P1, P3, P4 y P5 atendiendo a su peso molecular. Además, fueron reconocidas bandas de 80, 70, 24 kDa y otra con peso mayor a 150 kDa. En general el reconocimiento de todas las PME, excepto esta última de alto peso molecular (APM), se vieron favorecidas con la utilización del Tween 20, con el que se logró un incremento del número y la intensidad de las bandas así como la disminución de los fondos con respecto al resto de detergentes evaluados (Empigen BB, Triton X-100, Nonidet NP-40 y CHAPS). El reconocimiento de la proteína de APM (>150 kDa) se vio afectado por la presencia de detergente como el Tween 20 y Empigen BB. Los lavados con Tween 20 constituyeron los pasos más importantes en la renaturalización de los sitios de unión de la IgG a las PME.

Five different detergents for restoration of IgG antibody binding were studied in the washing steps and in the buffer solution used for the dilution of the conjugate and samples. Binding of human serum IgG antibodies to outer membrane protein (OMP) was detected with class-specific peroxidase-conjugated human antibodies. The positive control reacted with those proteins whose molecular weight corresponded approximately to P1, P3, P4 and P5. Proteins of 80 kDa, 70 kDa and 24 kDa and another protein of >150 kDa were also recognized. Our studies indicated that Tween 20 was the best detergent for restoration of OMP antigenicity, except for the 150 kDa protein. Tween 20 achieved a greater number and intensity of bands and a lower background with respect to Empigen BB, Triton X-100, Nonidet NP-40 and CHAPS. The use of detergents affected the antigenicity of the 150 kDa protein. Washing with Tween 20 were the most important steps for restoration of IgG antibody binding sites of heat-denatured OMPs.

Desarrollo de biomodelos para la evaluación de la inmunidad secretora contra M. tuberculosis en ratones Balb/c

Poco se ha estudiado acerca del papel de los anticuerpos específicos, presentes en las secreciones del aparato respiratorio, en la defensa contra patógenos intracelulares, como es el caso de las micobacterias causantes de la tuberculosis en el hombre: Micobacterium tuberculosis, bovis y africanum. Con el objetivo de desarrollar modelos adecuados para evaluar el posible papel de la inmunidad secretoria en la defensa contra la tuberculosis, se desarrollaron dos modelos animales con la utilización de un anticuerpo monoclonal IgA dirigido contra la proteína de 16 kD de M. tuberculosis y M. bovis. En el primer modelo se inocularon ratones Balb/c, por vía subcutánea al nivel de la nuca, con diferentes cantidades de células del hibridoma TBA61, productor de la IgA específica. En un segundo modelo, se inoculó por vía intraperitoneal líquido ascítico correspondiente a este hibridoma obtenido en ratón. En ambos casos se determinó, a diferentes tiempos, la concentración del monoclonal en saliva y sólo en suero para el segundo. En los dos modelos se demostró el paso del monoclonal a la saliva, donde alcanzó la máxima concentración: a los 21 días en los animales inoculados con el hibridoma, y a las 2 horas en saliva y suero en los animales inoculados con el líquido ascítico. Se sugiere, por su sencillez y mayor inocuidad, el uso del segundo modelo para la realización de estudios de reto por vía mucosal.

The role of specific antibodies found in the respiratory tract secretion, in the defense against intracellular pathogens like mycobacterium causing tuberculosis in man (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum), has not been studied deeply enough. With the purpose of developing suitable experimental models aimed at the assessment of the secretory immunity role in the defense against tuberculosis, two experimental models were developed using IgA monoclonal antibodies directed against the M. tuberculosis and M. bovis. 16 kDa protein. In the first model Balb/c mice were subcutaneously inoculated in the neck with different amounts of TBA61 hibridome cells, which produce the specific IgA. In a second model, this hibridome’s ascitic fluid, obtained from mice, was intraperitoneally inoculated. In both cases, we determined, in different moments, the monoclonal concentration in saliva and only in the second one; we determined the concentration in serum. In the two models we demonstrated the monoclonal’s pass to the saliva, reaching its maximum concentration at 21 days in the animals inoculated with the hibridome and at two hours in saliva and serum in the animals inoculated with ascitic fluid. Due to its simplicity and innocuousness, we recommend the use of the second model for challenging experiments through the mucosal way.