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Size fragmentation of Neisseria meningitidis grupo C polysaccharide for their use in conjugated vaccine

Las infecciones meningocócicas son una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo. Los serogrupos B y C son los responsables de la mayoría de los casos reportados en muchos países e incluso en países desarrollados. Las vacunas meningocócicas que contienen al polisacárido capsular purificado del meningococo C inducen en adultos protección por la presencia de anticuerpos bactericidas en sueros, pero son pobremente inmunogénicos en niños pequeños y pueden inducir tolerancia. La inmunogenicidad de los polisacáridos o sus fragmentos puede ser mejorada por la conjugación a proteínas transportadoras. El objetivo de este estudio fue obtener oligosacáridos C (Os-C) a partir de la depolimerización del polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C (Ps-C) por hidrólisis ácida, calor y peryodato de sodio y evaluar la conservación de sus propiedades antigénicas mediante un ELISA de inhibición. Se determinó la pérdida de grupos O-acetilos, así como, la talla molecular relativa por filtración en gel y se observaron diferencias significativas entre los OS-C obtenidos en cada método. Las propiedades antigénicas fueron dependientes del tamaño molecular de los Os-C, así como de la presencia de los grupos O-acetilos en los oligosacáridos. Los Os-C obtenidos por la hidrólisis ácida mostraron similares propiedades antigénicas a las del polisacárido.

Meningococcal infections are an important cause of morbidity and mortality worldwide. Serogroups B and C strains are responsible for most cases in the developed world. Meningococcal vaccines containing purified serogroup C capsular polysaccharide induce protective serum bactericidal antibodies in adults, but are poorly immunogenic in young children and may induce tolerance. The immunogenicity of polysaccharide or its fragments can be improved by conjugation to a protein carrier. In this study the purified meningococcal C polysaccharide (Ps-C) was depolimerized by acid hydrolysis, heat and sodium peryodate, to obtain oligosaccharides (Os-C) and it was evaluated the integrity of their antigenic properties by inhibition ELISA. The molecular size was determined by gel filtration and the loss of O-acetyl groups was evaluated. Significant differences between the molecular size of the OS-C and the values of O-acetyls were obtained by different depolimerization method. The antigenic properties were dependent on the molecular size and the O-acetyls groups. Oligosaccharides obtained by acid hydrolysis showed the same antigenic properties as PS-C.

Validation of the ELISA for quantifying capsular anti-polysaccharide IgG of Neisseria meningitidis of the serogroup C in mice sera

Se desarrolló un ensayo inmunoenzimático de fase sólida (ELISA) indirecto para cuantificar anticuerpos IgG específicos antipolisacárido C en ratón, utilizando un prerrecubrimiento con Poli-L-lisina y luego el polisacárido capsular de Neisseria meningitidis serogrupo C (Instituto Finlay, La Habana, Cuba), para evaluar la respuesta inmune contra este componente en candidatos vacunales en estudios preclínicos. Como conjugado se utilizó anti-IgG ratón conjugado a fosfatasa alcalina, el cual se une a los anticuerpos antipolisacárido C producidos en ratones. La reacción es evidenciada por la degradación del sustrato p-nitrofenilfosfato. La detectibilidad del ensayo fue de 123,74 U/mL y la especificidad fue alta. La precisión interensayo, intraensayo y total, así como las desviaciones de la recuperación, linealidad y paralelismo no sobrepasaron el 10%. El ELISA permitió cuantificar los anticuerpos antipolisacárido C inducidos en ratones tanto por candidatos vacunales conjugados, como por la vacuna VA-MENGOC-BC y el polisacárido C sin conjugar.

An indirect enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) was developed to determine antibody anti-polysaccharide C mouse IgG. Polystyrene plates precoating with poly-L-lysine, then Neisseria meningitidis group C polysaccharide (Finlay Institute, Havana, Cuba) was used to evaluated the immune response against this component in a candidate vaccine in pre-clinical studies. Alkaline phosphatase conjugate was used for recognizing mouse antibodies against polysaccharide C. The enzymatic reaction is evidenced by using the specific substrate p-nitrophenylphosphate. The detection limit of the assay was 123,74 U/mL, the specificity of assay was high. Intra-and interassay lack of precision, parallelism, linearity, and recovery were ± 10% of the expected values.

Coating of ELISA plates with vaccine antigens

Se describe un procedimiento de sensibilización de placas para ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) con antígenos vacunales. Se define como concentración óptima de sensibilización aquella donde se alcanza la mayor densidad óptica con los sueros estándares y la menor con los sueros negativos y el blanco reactivo. Como modelo se emplean ensayos indirectos correspondientes a los antígenos de captura: toxoide tetánico, diftérico y la vesícula de membrana externa de meningococo B, materia prima activa de la vacuna antimeningocócica VA-MENGOC-BC. Esta metodología permite alcanzar un mayor recubrimiento de la fase sólida, lo cual incrementa la sensibilidad de los ensayos. La ocupación de espacios libres en la placa se hizo más evidente con antígenos de menor peso molecular, como los toxoides diftérico y tetánico.

A procedure for coating ELISA plates with vaccine antigens is described. The optimum coating concentration was that achieving the highest absorbance for the standard sera and the lowest for the negative controls and the reagent blank. Indirect ELISA is used as model. Tetanus and diphtheria toxoids, and meningococcal B outer membrane vesicle, active principle of the meningococcal vaccine VA-MENGOC-BC, were used as capture antigens. That procedure increases sensitivity of the assays due to coating optimization. The saturation of possible free spaces was more evident with the lowest molecular weight antigens, such as diphtheria and tetanus toxoids.