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Biomodelo para la evaluación de cepas atenuadas como candidatos vacunales contra el cólera humano. I: Estudio de la virulencia, capacidad de colonización y adherencia a la mucosa intestinal

El cólera continúa siendo en muchos países un problema para la salud humana, manteniéndose como una enfermedad epidémica o endémica que afecta tanto a niños como adultos y causa la muerte en casos no tratados. Una vacuna viva oral contra esta enfermedad puede ser la solución. En el presente trabajo se seleccionó y aplicó un biomodelo para la evaluación de cepas atenuadas genéticamente de Vibrio cholerae como candidatas vacunales contra el cólera. La virulencia, capacidad de colonización y adherencia a la mucosa intestinal de las cepas fueron evaluadas mediante el uso de ratones neonatos de 2 a 4 días de nacidos de la línea Balb/c, con un peso entre 1,5-2 g. Los resultados obtenidos con este biomodelo demostraron que las cepas atenuadas genéticamente son no virulentas, colonizan y se adhieren a la mucosa intestinal. Se concluye que el biomodelo utilizado permite la evaluación y selección de cepas candidatas para vacunas vivas orales contra el cólera.

Cholera is still a human health problem in many countries. It is an epidemic or endemic disease affecting both children and adults that causes death of untreated cases. A live oral vaccine could be the solution against this disease. In the present study a biomodel was selected and applied for the evaluation of genetically attenuated Vibrio cholerae strains as vaccine candidates. The virulence, colonizing capacity and adherence to the intestinal mucosa of the strains were evaluated using 2-4 day-old neonatal Balb/c mice, weighing from 1.5-2 g. The results obtained with this biomodel showed that genetically attenuated strains are not virulent, colonize and adhere to the intestinal mucosa. The conclusion was that the biomodel used allows the evaluation and selection of candidate strains for live oral cholera vaccines.

Interacción del componente pertussis de células completas con los antígenos tetánico, Haemophilus influenzae tipo B y hepatitis B en ensayos de potencia para vacunas combinadas

Las vacunas combinadas permiten un grado de aceptación mayor entre la población, dado que se requiere de menos inmunizaciones para proteger contra las enfermedades infecciosas. Sin embargo, esto ha generado nuevos retos, ya que se han reportado numerosas interacciones entre los diferentes antígenos que conforman estas vacunas. El propósito del presente trabajo fue evaluar la interferencia potencial del componente pertussis de células completas sobre los ensayos para determinar la actividad biológica de otros antígenos como toxoide tetánico, Haemophilus influenzae tipo b (Hib) y hepatitis B. Para ello se estudiaron mediante ensayos de potencia vacunas combinadas que contenían estos antígenos y se compararon con vacunas monovalentes. A su vez se prepararon adyuvaciones experimentales cuya composición permitió estimar adecuadamente la extensión y naturaleza de la interacción entre componentes. Se obtuvo que el componente pertussis incrementó significativamente la actividad biológica de Hib y tétanos, aunque esto puede depender mucho del modelo animal y el diseño experimental utilizado. En cuanto al antígeno de hepatitis B se demostró que pertussis inhibía la potencia de este antígeno, tanto in vitro como in vivo, aunque por mecanismos diferentes y de forma no significativa.

Combined vaccines have a higher level of acceptance in the population because fewer immunisations are required for protection against infectious diseases. Nevertheless, new challenges have appeared due to the report of some interference among the antigens included in such vaccines. The aim of this paper was to evaluate whole-cell Pertussis (wP) interference in potency tests with other antigens like tetanus, Haemophilus influenzae type b (Hib) and hepatitis B. For that purpose, we evaluated combined vaccines and compared them with the respective monovalent vaccines. Likewise, we prepared experimental formulations with different antigen combinations to evaluate the extent and nature of the interference caused by wP. We obtained a significant increase of the tetanus and Hib biological activities when both antigens are combined with wP, although it depended on the animal model and the experimental design used. On the other hand, wP decreased both the in vivo and in vitro potency of HB in a non-significant way.

Purificación de lipopolisacárido de Neisseria meningitidis a partir de una fracción colateral del proceso de producción de VA-MENGOC-BC®

El trabajo tuvo como objetivo purificar lipopolisacáridos (LPS) de Neisseria meningitidis a partir de una fracción colateral del proceso de producción de la vacuna antimeningocócica VA-MENGOC-BC®, el sobrenadante que se obtiene del paso de ultracentrifugación durante el proceso de extracción de las proteínas de membrana externa del meningococo. La purificación se realizó mediante precipitación con etanol al 80%, extracción de las proteínas con fenol al 90% entre 65-70 ºC y ultracentrifugación fraccionada a 105,000 g. Se obtuvieron tres lotes de LPS, en total 1,069 g, con un contenido de proteínas, ácidos nucleicos y ácido sálico respecto al LPS de 0,5%, 0,3% y 2,2% (m/m) respectivamente. La evaluación por cromatografía mostró una alta integridad molecular, con valores de constante de distribución reproducibles (0,36-0,38) y una posible asociación del ácido siálico al LPS. Se apreció homogeneidad en el perfil electroforético de los tres lotes y alta actividad endotóxica. El LPS purificado fue identificado fundamentalmente como del inmunotipo L3,7,9. El procedimiento de purificación empleado permite aprovechar una fracción colateral del proceso de producción de la vacuna, es escalable, no incluye métodos cromatográficos, y posibilita la obtención de gran cantidad de LPS de Neisseria meningitidis, no disponible en el mercado, con elevada pureza y alta actividad endotóxica.

The work aimed at purifying lipopolysaccharides (LPS) of Neisseria meningitidis from a collateral fraction of the antimeningococcal BC vaccine, VAMENGOC-BC®. production process, the supernatant obtained from the ultra centrifugation stage during the proteins extraction process of the meningococcus outer membrane. The purification was carried out by precipitation 80% ethanol, protein extraction with 90% phenol from 65-70 ºC and fractional ultra centrifugation at 105 000 g. Three lots of LPS were obtained, in total 1.069 g, with a content of proteins, nucleic acids and sialic acid in respect to the LPS of 0.5%, 0.3% and 2.2% (m/m) respectively. The assessment by chromatography showed a high molecular integrity. with constant valves of reproducible distribution (Kd 0.36 - 0.38) and a possible sialic acid association to the LPS. Homogeneity was observed in the electrophoretic profile of the three lots and a high endotoxic activity. The purified LPS was mainly identified as the inmunotype L3,7,9. The purification procedure used allows making use of a collateral fraction of the vaccine production process, it is scalable, it does not include chromatographic methods and makes easy the obtainment of large quantity of LPS of Neisseria meningitidis, wihich it is non available on the market, with high purity and high endotoxic activity.

Utilidad del modelo animal ratón-pulmón para evaluar la virulencia de posibles cepas vacunales de Shigella spp

Shigella flexneri y Shigella sonnei, como cualquier otra especie del género Shigella, se sitúan entre los principales agentes etiológicos de las enfermedades diarreicas agudas, sobre todo aquellas que ocurren en los países en vías de desarrollo, aunque por la baja dosis infectante de este enteropatógeno no se excluyen los países desarrollados. Esta situación conlleva a la elaboración de vacunas para prevenir esta enfermedad y la necesidad de un modelo animal que pruebe la eficacia protectora e inmunogénica de posibles candidatos vacunales contra la shigellosis, situación que ha motivado numerosos estudios por la dificultad de demostrar la enteropatía intestinal en los monos y humanos. Lo anteriormente expuesto, más la capacidad de Shigella spp para mostrar resistencia a los antimicrobianos, motivó la realización de este trabajo. En el mismo se constató la utilidad del modelo animal ratón-pulmón para evaluar la virulencia de candidatos vacunales a partir de este microorganismo. Se utilizó la técnica de inoculación intranasal con una concentración entre 107 y 109 UFC de cepas de Shigella flexneri y Shigella sonnei. Por todos los resultados obtenidos con el modelo animal ratón-pulmón se concluyó que este modelo puede ser eficiente para los estudios preclínicos de cualquier candidato vacunal a partir de Shigella spp.

ABSTRACT Shigella flexneri and Shigella sonnei, as other species of Shigella, are among the main etiological agents of acute diarrhoeal diseases worldwide, specially in developing countries, although we do not exclude developed ones, because of their low infective dose, between 10 and 100 colonies. This leads to the preparation of vaccines to prevent this illness and the need for an animal model to demonstrate the protective and immunogenic effectiveness of the shigellosis candidate vaccines. Many studies have been carried out since the intestinal enteropathy is difficult to demonstrate in monkeys and humans. The aforementioned and the capacity of Shigella sp to become resistant to antibiotic treatments motivated our study. In it we demonstrated the usefulness of the mouse-lung animal model to evaluate the virulence of vaccine candidates. Intranasal inoculation with Shigella flexneri and Shigella sonnei in concentration on between 107 and 109 CFU was used. The conclusion was that the lung-mouse animal model can result efficient for preclinical studies of any Shigella spp vaccine candidate.