Vaccimonitor

In vitro study of protein release from AFCo1 and implications in mucosal immunisation

Adjuvant Finlay Cochleate 1 (AFCo1) is a Proteoliposome-derived cochleate obtained from Neisseria meningitidis serogroup B. Transformation of proteoliposomes into AFCo1 potentiates the immune response on Neisseria antigens when it is administered by intranasal or intragastric (i.g) routes. However, the i.n route has been demonstrated to be more effective. The aim of this work is to evaluate in vitro the protein release from AFCo1, in simulated gastric fluid (SGF) or simulated nasal fluid (SNF) using a microdissolution test and to provide support for the results found when AFCo1 was administered by i.g or i.n routes in BALB/c mice. Results showed that dilution of AFCo1 in simulated gastric fluid affects the delivery of Neisseria protein antigens because they were released from cochleate structures faster than when simulated nasal fluid was used. In conclusion, conditions simulating gastric environment affect the delivery of protein antigens from AFCo1 and this result could partially explain why i.n administration is more effective in vivo than i.g immunisation.

El cocleato adyuvante Finlay (AFCo1) 1 es derivado de un proteopolisoma de Neisseria meningitidis serogrupo B. La transformación de los proteoliposomas en AFCo1 potencia la respuesta inmune de los antígenos de Neisseria cuando se administra por vía intranasal o intragástrica. Se ha demostrado, sin embargo, que la vía intranasal es más efectiva. Los objetivos de este trabajo fueron evaluar in vitro la liberación de proteínas del AFCo1 en líquido nasal o gástrico simulado, usando para ello la prueba de microdisolución y apoyar los resultados obtenidos cuando se administró AFCo1 por vía intranasal o intragástrica en ratones BALB/c. Los resultados demostraron que la dilución de AFCo1 en líquido gástrico o nasal simulado afecta la distribución de los antígenos de proteína de Neisseria , ya que estos se liberaron de las estructuras de cocleatos más rápido cuando se utilizó líquido nasal. Se concluyó que las condiciones que simulan el entorno gástrico afectan la distribución de los antígenos de proteínas de AFCo1 y este resultado puede explicar parcialmente porqué la administración intranasal es más efectiva in vivo que la inmunización intragástrica.

Molecular exclusion chromatography as methodology for the purification of bacteriophages

La cromatografía de exclusión molecular puede ser usada para purificar fagos filamentosos, el virus bacteriano más usado en la tecnología de presentación de péptidos y proteínas en la superficie de los fagos. El bacteriófago, luego de ser precipitado del sobrenadante de cultivo con polietilenglicol, fue aplicado a una columna de Sepharose CL-4B de 100 cm de altura, usando como fase móvil solución tampón fosfato (PBS). Se obtuvo un 61,3% de recobrado del fago total aplicado y, mediante el análisis por SDS-PAGE, se verificó la pureza de estas preparaciones. La cromatografía de exclusión molecular es una metodología atractiva para la obtención de preparaciones de bacteriófagos con alta pureza.

Molecular exclusion chromatography can be used to purify filamentous phages which are the most commonly used virus in phage display technology of peptides and proteins. Bacteriophages were precipitated from culture supernatant using polyethylene glycol and they were loaded in a 100 cm high CL-4B Sepharose matrix using phosphate buffer as mobile phase. We recovered 61.3% of total phage loaded. SDS-PAGE analysis showed a high purity of these preparations. Molecular exclusion chromatography is an attractive alternative method for purifying filamentous phages.

IgY antibodies in latex-agglutination assay

Los anticuerpos aviares (IgY) presentan algunas ventajas con relación a los anticuerpos IgG de mamíferos, debido a su fácil obtención y purificación y su bajo costo de producción. El objetivo de este trabajo fue estudiar la factibilidad de acoplar anticuerpos IgY a partículas de poliestireno y evaluar su desempeño en ensayos de látex-aglutinación en lámina. Para este propósito se utilizó como modelo la detección del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Gallinas Leghorn se inmunizaron con el ingrediente farmacéutico activo que se utiliza en la elaboración de la vacuna recombinante cubana Heberbiovac-HB. Los anticuerpos obtenidos se purificaron y emplearon en la preparación de reactivos de látex-aglutinación (0,8 µm) para la detección del HBsAg, los cuales se evaluaron con 50 muestras de suero frente a un reactivo comercial similar. Los resultados se evaluaron de satisfactorios. Se demostró la factibilidad de acoplar anticuerpos aviares a partículas de látex y se abre una perspectiva al empleo de este tipo de ensayo para el diagnóstico rápido de diversas enfermedades.

Avian antibodies (IgY) display some advantages in relation to the mammalian IgG antibodies due to its easy procedure for generation and purification and besides for its lower production cost. The objective of this work was to analyze the feasibility of binding IgY antibodies to polystyrene particles and to evaluate its performance in latex-agglutination tests in slide. For this purpose, the detection of hepatitis B surface antigen (HBsAg) was used as a model. Leghorn hens were immunized with the active pharmaceutical ingredient (MPA) used in the manufacturing of the Cuban recombinant vaccine Heberbiovac HB . The obtained antibodies were purified and used in the preparation of the latex particles (0.8 µm) for the detection of the HBsAg by agglutination. The performance of the test was evaluated with 50 serum samples against similar commercial reagent. The results obtained were satisfactory and demonstrated the feasibility of binding such avian antibodies to latex particles. These results open a perspective to the use of this type of assay for the rapid diagnostic of many diseases.

Standardization of immunoenzimatic assays (ELISA) for the quantitative determination of IgG antibodies elicited by an-outer-membrane-vesicle vaccine from Neisseria meningitidis serogroups A and W₁₃₅

La enfermedad meningocócica es una afección invasiva, de amplia incidencia mundial, cuyo agente causal es la bacteria gramnegativa Neisseria meningitidis . Existen vacunas polisacarídicas sin conjugar o conjugadas, contra cuatro de los cinco serogrupos responsables del 95% de los casos en el mundo. Para el serogrupo B, cuyo polisacárido es pobremente inmunogénico, se han evaluado varios candidatos vacunales producidos a base de vesículas de membrana externa. La determinación de la actividad bactericida y la cuantificación de IgG por ELISA han sido los métodos más utilizados en la medición de la respuesta inmune generada por vacunas contra la meningitis meningocócica. El segundo de estos métodos es utilizado en el Instituto Finlay como ensayo de inmunogenicidad para la liberación de lotes de VA-MENGOC-BC® . Como parte de una colaboración con investigadores noruegos, se trabaja en la obtención de un candidato vacunal contra los serogrupos A y W 135 , basado en vesículas de membrana externa. En el presente trabajo se describe la estandarización de un ELISA para ser utilizado en la evaluación de la respuesta inmune del candidato vacunal bivalente.

Invasive meningococcal disease constitutes a worldwide health problem. Gram negative bacteria, Neisseria meningitidis is the causal agent of this disease. Plain or conjugated polysaccharide vaccines are available against four of five serogroups responsible of more than 95% of cases in the world. Because serogroup B polysaccharide is non immunogenic, some vaccine candidates, based on outer membrane proteins have been obtained and evaluated in clinical trials. Bactericidal activity determination and ELISA IgG have been used to evaluate immune response generated by antimeningococcal vaccines. The latter has been used, as potency test, to release VA-MENGOC-BC® vaccine lots, produced at Finlay Institute. As a result of the collaboration with Norwegian researchers, a vaccine candidate based on outer membrane proteins against serogroups A and W 135 , has been obtained and evaluated in animal models. The current work describes the standardization of an ELISA method to be used in the immune response evaluation of the bivalent vaccinal candidate.

Serological evaluation of active-passive immunization for the prophylaxis of perinatal transmisión of hepatitis B

La administración conjunta de gammaglobulina antihepatitis B y la vacuna se recomienda mundialmente para prevenir la transmisión perinatal en hijos de madres HBsAg(+). Se evaluó la inmunización pasiva-activa a los tres días, 7 y 18 meses de vida, como forma preventiva de esta transmisión. Se estudiaron 87 sueros de hijos de madres HBsAg(+), tomados a los 3 días, 7 y 18 meses de nacidos, para un total de 261 muestras. A los recién nacidos se les administró una dosis de inmunoglobulina humana antihepatitis B cubana (Ganmahep B) y de vacuna recombinante cubana Heberbiovac-HB ® antes de las 12 horas de nacidos y posteriormente a los 1, 2 y 12 meses, según el esquema de vacunación Los niños fueron evaluados con los marcadores HBsAg y anti-HBs. Al tercer día el 8,0% de los niños fueron HBsAg(+), el 92,5% de los niños HBsAg(-) resultaron seroprotegidos. A los 7 meses de edad el 1,1% fue HBsAg(+), la seroprotección de los niños HBsAg(-) fue de 89,5%. El 3,4% fue HBsAg(+) a los 18 meses, con un 97,6% de seroprotección en los niños HBsAg(-). Predominó la respuesta normoprotectora en los tres tiempos, con diferencias estadísticamente significativas en la seroprotección y títulos ³ 100 UI/L. Los títulos promedios geométricos (TPG) fueron 72,9 UI/L, 168,66 UI/L y 175,62 UI/L, respectivamente, con significación estadística entre ellos. Se sugiere que el uso de Ganmahep B, conjuntamente con la vacuna cubana reduce el riesgo de transmisión perinatal del VHB y es el primer estudio realizado en Cuba para evaluar la eficacia profiláctica en este grupo de riesgo.

The joint administration of the anti-hepatitis B gammaglobulin and the vaccine is worldwide recommended for the prevention of perinatal transmission to children from HBsAg(+) mothers. As a preventive measure of transmission, passive-active immunization was evaluated after 3 days and at 7 and 18 months of life. Eighty-seven sera from children from HBsAg(+) mothers were studied; these sera were collected 3 days, and 7 and 18 months after birth, for a total amount of 261 samples. Newborns were administered a dose of Cuban Human Anti-hepatitis B Immunoglobulin (Ganmahep B) and a dose of the Cuban recombinant vaccine Heberbiovac-HB® before the first 12 hours after birth. Afterwards, the vaccination scheme at months 1, 2, and 12 was followed. Children were evaluated with HBsAg and anti-HBs markers. At the third day, 8.0% of the children were HBsAg(+); the 92.5% of HBsAg(-) children turned out to be seroprotected. At 7 months of age, 1.1% was HBsAg(+), seroprotection of HBsAg(-) children was 89.5%. At 18 months of age, 3.4% was HBsAg(+), with a 97.6% of protection of HBsAg(-) children. The normoprotective response was predominant at the three periods of time, with statistically significant differences in seroprotection and titers =100 UI/L. Geometric Mean Titer (GMT) values were 72.9 UI/L, 168.66 UI/L and 175.62 UI/L, respectively, with statistical significance among them. It is suggested that the use of Ganmahep B, along with the administration of the Cuban vaccine reduces the risk of HBV perinatal transmission and this is the first study carried out in Cuba to evaluate the prophylactic efficacy within this risk group.

Validation of the serum bactericidal assay for Neisseria meningitidis serogroups A, C and W₁₃₅

El ensayo bactericida en suero se considera la herramienta más eficaz para medir el estado de la inmunidad en individuos vacunados contra N. meningitidis y constituye el soporte analítico para el desarrollo de las vacunas a base de polisacáridos. Las normas de Buenas Prácticas de Fabricación y control de la calidad de productos farmacéuticos plantean que la validación debe aplicarse tanto a los procesos de fabricación como a los métodos de análisis y de control. Es de particular interés en el caso de los bioensayos con resultados más variables que los métodos fisicoquímicos. Por esta razón se llevó a cabo la validación del ensayo bactericida por el método de la placa inclinada, para los serogrupos A, C y W135 , mediante la determinación de la precisión, especificidad, exactitud y robustez del mismo. Los resultados estuvieron dentro del criterio de aceptación para este tipo de prueba, por lo que se considera apto para la evaluación de la respuesta inmune estimulada por vacunas polisacarídicas de los serogrupos A, C y W 135 contra la meningitis meningocócica.

Serum bactericidal assay is considered the most efficient tool for measuring the immunity status in people vaccinated against N. meningitidis and it is the analytical support for the development of polysaccharide vaccines. Good Manufacturing Practice and Quality Control of Pharmaceutical Products regulate the validation procedure for manufacturing process and the analysis and control methods, especially for bioassays that are more variable than physicochemical assays. For that reason, the validation of bactericidal assay for the tilt method was carried out by the determination of precision, specificity, accuracy and robustness. The results were in the range of acceptance criteria, that is why this assay is considered suitable for the evaluation of the immune response induced by A, C and W135 polysaccharide vaccines against meningococcal meningitis.

The risk analysis used to manufacture recombinant proteins in E. coli

En este trabajo se aplicó el análisis de riesgo, empleando la metodología de análisis de modos y efectos de fallas a los procesos de fermentación que utilizan la bacteria Esherichia coli como hospedero, para obtener proteínas recombinantes con fines terapéuticos, vacunales o diagnósticos. Se realizó el análisis del tipo y probabilidad de ocurrencia de las fallas en el proceso fermentativo, la evaluación del impacto en la calidad del mismo y la probabilidad de detección de dichas fallas. Se evaluó la severidad, probabilidad de ocurrencia y probabilidad de detección y se calculó el número de probabilidades de riesgo. Además, se emplearon técnicas utilizadas para el aseguramiento de la calidad como: tormenta de ideas y diagrama causa-efecto. Se concluye que las causas potenciales que tienen mayor influencia en las fallas de un proceso fermentativo de E. coli recombinante son: la inadecuada manipulación durante la inoculación, la presencia de fagos y el personal no calificado. Se proponen acciones a tomar para minimizar el riesgo.

In this paper a risk analysis management is applied using the Failure Mode Effects Analysis to the fermentation processes that use E. coli as a host, to produce recombinant proteins with therapeutic, vaccinate or diagnostic aims. The analysis of the type and probability of occurrence of failures in the fermentation process, the evaluation of the impact in the quality of the product and the probability of detection of these failures are carried out. The severity, occurrence probability and detection probability are evaluated and the risk priority number is calculated. Techniques used in Quality assurance as brainstorming and Ishikawa diagram were used. The potential causes that have higher influence in the failures of a fermentation process of recombinant E. coli are: inadequate handling during inoculation, presence of phages and unqualified personnel. Actions to minimize the risks are proposed.