Vaccimonitor

Proteoliposome: VA-MENGOC-BC^® core and adjuvant platform

Identification of primary and secondary infection to rubella virus by the detection of IgG avidity in samples of an outbreak occurred in 2004 in Cuba

La rubéola es una enfermedad infectocontagiosa que afecta a niños y adultos jóvenes, y cuando esta se produce en el primer trimestre del embarazo ocasiona malformaciones congénitas en el feto. En el Laboratorio Nacional de Referencia de Sarampión, Rubéola y Parotiditis del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", se realizó la detección del índice de avidez relativo (IAR) de la IgG en 15 pares de sueros correspondientes a igual número de pacientes adultos que enfermaron durante un brote de rubéola ocurrido en dos provincias de Cuba en el 2004, los cuales fueron positivos a anticuerpos de tipo IgM específicos al virus, y en algunos se encontró seroconversión o un aumento de cuatro veces el título entre los sueros de la fase aguda y convaleciente con la técnica de inhibición de la hemaglutinación. En 13 (86,6%) de los pacientes estudiados se detectó infección primaria, mientras que en dos (13,3%) de ellos la infección fue secundaria. La detección de la avidez de la IgG constituye un método alternativo útil para distinguir una infección primaria de una secundaria al virus de la rubéola y fortalece el diagnóstico de esta enfermedad en Cuba.

Rubella infectious diseases affect children and young adults and when they occur during the first trimester of pregnancy, cause congenital malformations in the newborn. In the National Reference Laboratory (NLR) of measles, rubella and mumps from the Tropical Medicine Institute ¨Pedro Kourí¨, the IgG Avidity Index (AI) detection was carried out to 15 paired serum samples, which corresponded to same number of patients infected with this virus in two Cuban provinces in 2004. The samples were positive to virus- specific IgM antibodies, in addition seroconversion or an increase of > 4 fold of the titers in the sera of the acute and convalescence phase using the hemagglutination inhibition assay (HIA). The AI value showed a primary infection to rubella virus in 13 (86.6%) of the patients studied, and a secondary infection in 2 (13.3%) of them. The IgG avidity antibody detection is a reliable alternative tool for distinguishing between primary and secondary rubella virus infection and for strengthing the diagnosis of this disease in Cuba

Neuroimmunological response in dengue virus encephalitis

El virus del dengue es un virus ARN miembro de la familia Flaviviridae, la cual incluye, además, el de la fiebre amarilla, el del Nilo del Oeste y la encefalitis japonesa. Se realizó un estudio retrospectivo con tres pacientes diagnosticados de encefalitis asociada al dengue, en cuyas muestras de suero y líquido cefalorraquídeo se cuantificaron los niveles de las clases mayores de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial y la manosa de unión a lectina, proteína de la vía de las lectinas del sistema del complemento por fluorometría. En el reibergrama se muestra la presencia de síntesis intratecal de las tres clases de inmunoglobulinas y ausencia de síntesis intratecal de lectina de unión a manosa. Existieron diferencias en cuanto al por ciento de síntesis intratecal de inmunoglobulinas, las cuales estuvieron relacionadas con el momento de la infección por el virus y la aparición de las manifestaciones neurológicas compatibles con una encefalitis. Este es el primer reporte de afectaciones neurológicas en pacientes cubanos con dengue. La respuesta inmune intratecal puede ser utilizada para el mejor conocimiento de la enfermedad y contribuir al desarrollo de posibles candidatos vacunales

Dengue virus is a RNA virus of the Flaviviridae family including also West Nile virus, Japanese encephalitis virus and yellow fever virus. A retrospective study with three patients diagnosed with encephalitis associated with dengue virus was carried out. Using their sera and cerebrospinal fluid samples the levels of high class of immunoglobulins by radial immunodiffusion and mannan binding lectin were quantified by fluorometry three classes of immunoglobulins levels were quantified by using an immunodiffusion technique. Mannose-binding lectin was quantified by fluorometry. A retrospective study with three patients diagnosed with encephalitis. The Reibergram has shown three classes of immunoglobulins intrathecal synthesis and absence of mannan binding lectin synthesis. Differences in the immunoglobulin intrathecal synthesis percent were observed, which were related with the moment of virus infection and the onset of neurological manifestations compatible with encephalitis. This is the first report of neurological affectations in Cuban patients with dengue fever. The intrathecal immune response may be used for the best knowledge of the disease and for the contribution to the development of possible candidate vaccine.

T and B epitope prediction of protein NS4b of dengue virus type 3

El dengue se considera una enfermedad emergente y la principal de las afecciones virales transmitidas por artrópodos en términos de morbilidad y mortalidad. A pesar de los múltiples esfuerzos realizados por la comunidad científica internacional, aún no existe una vacuna licenciada contra esta entidad. La NS4b, una de las más pequeñas proteínas del virus del dengue induce respuesta de anticuerpo y de inmunomediadores en pacientes infectados por este virus. Sin embargo, poco es conocido sobre su estructura antigénica. En el campo de diseño de vacunas es muy útil la aplicación de las técnicas in silico, tanto para el descubrimiento y desarrollo de vacunas nuevas como para las existentes. Numerosos epítopos predichos se han verificado experimentalmente, lo que demostró la utilidad de tales predicciones. En este trabajo fueron aplicados los programas de predicción: BcePred, ABCpred, HLApred, ProPred y Proped1, para la búsqueda de nuevos epítopos de la proteína NS4b del virus dengue tipo 3. Se identificaron 27 epítopos de células B y 126 de la T. La secuencia de aminoácidos del mimotopo de la proteína NS4b (FEKQLGQV) fue predicha como epítopo B por el servidor Bcepred, con la puntuación más alta. El análisis teórico de la potencialidad del epítopo T-FEKQLGQV tuvo una alta cobertura para ser presentado por una muestra de la población cubana. Del total de epítopos T predichos, 13 resultaron promiscuos, que pudieran ser potenciales candidatos vacunales. La importancia de estos resultados radica en sentar las bases moleculares para el desarrollo de una vacuna profiláctica de subunidades.

Dengue is considered an emerging infectious disease and the most important arthropod-borne viral disease in terms of morbidity and mortality. Despite the efforts made by the international scientific community, there is still no licensed vaccine against dengue. NS4b, the smallest hydrophobic proteins of dengue virus, has been reported to elicit antibodies and chemokines and cytokines in dengue-infected patients, but not much is known regarding the antigenic structure of this protein. In the field of vaccine design, the application of in silico techniques is very useful, for both the discovery and development of new and existing vaccines. Many predicted epitopes have been experimentally verified, demonstrating the usefulness of such predictions. In the present work, prediction programs: BcePred, ABCpred, HLApred, ProPred y Proped 1 were used to find novel epitopes from NS4b dengue virus type 3. 27 B-cell epitopes and 126 T-cell epitopes were identified on NS4b protein. The amino acidic sequence (FEKQLGQV) of NS4b protein was predicted by Bcepred server with a high score. Theoretical analysis of the potential of the T epitope -FEKQLGQV- showed a high coverage to be presented so that a sample of the Cuban population was used. Thirteen epitopes T out of those predicted resulted promiscuous, which can be potential vaccinal candidates. The importance of these epitopes is that they are identified main targets for the development of a subunit vaccine for prevention of dengue disease.

**Reduction of the toxicity of the lipopolysaccharide from Neisseria meningitidis serogroup B and study of its structural stability**

La búsqueda de adyuvantes está dentro de las líneas de investigación más importantes para el desarrollo de vacunas en las últimas décadas. Uno de los adyuvantes, en etapa de investigación en el Instituto Finlay, tiene en su composición al lipopolisacárido (LPS) de Neisseria meningitidis serogrupo B, el cual es altamente tóxico. Por ello nos propusimos modificarlo estructuralmente, para reducir su toxicidad y evaluar su estabilidad durante tres meses. Se utilizó un LPS purificado por el método de extracción con agua y fenol y se modificó estructuralmente por una hidrólisis básica controlada. El LPS resultante fue evaluado en el momento de la hidrólisis, al mes y a los tres meses. Se midió la concentración de grupos amino generados y la toxicidad por el método del lisado de amebocitos del limulus (LAL); se determinó el patrón electroforético y la constante de distribución (Kd) por cromatografía de exclusión molecular, como parámetros indicativos de la integridad estructural. Los resultados mostraron un aumento de los grupos amino, una reducción de la toxicidad en más de cinco mil veces que la inicial del LPS nativo y un incremento de la Kd, determinada por cromatografía. Todos los parámetros estudiados durante los tres meses se mantuvieron constantes. Se puede concluir que el LPS, modificado estructuralmente por medio de una hidrólisis básica controlada y almacenado en solución acuosa a temperaturas entre 2 y 8 °C, permaneció sin cambios en su estructura al menos por tres meses

The search of adjuvants has been one of the most important lines of the research in the development of vaccines in the last decades. One of the adjuvants under research at Finlay Institute uses lipopolysaccharide (LPS) from Neisseria meningitidis serogroup B in its composition and it is very toxic. For this reason we aim to make a structural modification of LPS from N. meningitidis serogroup B to reduce its toxicity and to study its stability for three months. A LPS purified by water and phenol extraction method was modified structurally by a controlled basic hydrolysis. The modified LPS was controlled at moment of the hydrolysis, a month and three months later. The evaluations consisted on the determination the concentrations of amine groups generated, the toxicity by Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), the determination of the electrophoretic pattern and the constant of distribution (Kd) by chromatography of molecular exclusion as indicative parameters of structural integrity. The obtained results showed an increase of amine groups, a reduction of more than 5 000 times of the initial toxicity of native LPS and an increase of the Kd determined by chromatography. Studied parameters remained constant in the three studied months. In summary, modified structurally LPS by means of a controlled basic hydrolysis and stored in watery solution and temperatures from 2 to 8 °C remains without changes in their structure at least for three months

**Application of a human linear antibody library against the capsular polysaccharide from Neisseria meningitidis serogroup B**

Neisseria meningitidis serogrupo B produce aún morbimortalidad significativa. Su polisacárido capsular muestra similitud estructural con proteínas humanas y pobre inmunogenicidad, obstaculizando así el desarrollo de vacunas y anticuerpos monoclonales (AcM) y policlonales contra esta bacteria. Recientemente se han creado bibliotecas artificiales de anticuerpos humanos expresados en bacteriófagos que reconocen específicamente a moléculas diana existentes, con la ventaja sobre los AcM convencionales por su rápida obtención, sin utilización de animales de laboratorio, lo que emerge como alternativa atractiva para la producción de AcM contra antígenos peculiares o complejos. Se realizó un trabajo de investigación básica, utilizando una biblioteca de fagos filamentosos que expresan constitutivamente regiones variables de anticuerpos humanos, que se enfrentó al polisacárido capsular de N. meningitidis serogrupo B. Los resultados que se obtuvieron mediante ELISA policlonal sugieren la existencia de anticuerpos humanos expresados en fagos que lo reconocen.

Neisseria meningitidis serogroup B still produces a significant morbidity and mortality. Bacterial capsular polysaccharide in serogroup B shows structural homologies with human proteins and poor immunogenicity which make difficult the development of vaccines and polyclonal and monoclonal antibodies (MAb) against it. Artificial libraries of human antibodies via the expression and selection of them in bacteriophages have become known. Those antibodies are used as specific recognizing molecules capable to join to almost any existing target, with advantages over conventional MAb due to its faster obtainment without needing animal immunization, emerging as an attractive alternative for the production of MAb against complex or particular antigens. This was a basic experimental piece of work, using a phage library that expresses variable regions of human immunoglobulins to identify ligands with the capacity to recognize N. meningitidis serogroup B polysaccharide. Polyclonal ELISA screening suggests the existence of human antibodies expressed in phages which recognized the antigen of interest.

**SDS-PAGE and densitometric analysis to determine concentration of lipopolysaccharide from Neisseria meningitidis serogroups A, W₁₃₅ and X**

Desde hace varios años el Instituto Finlay, en colaboración con el Instituto Noruego para la Salud Pública, trabajan en un proyecto para la obtención de candidatos vacunales a partir de vesículas de membrana externa (VME) de Neisseria meningitidis serogrupos A, W135 y X. Por ello es necesario establecer las especificaciones de calidad para el lipopolisacárido (LPS), principal causante de la pirogenicidad de estas vacunas. El objetivo de este reporte fue establecer las condiciones del SDS-PAGE como método de control de la calidad de las VME como ingrediente farmacéutico activo (IFA), provenientes de N. meningitidis serogrupos A, W135 y X. Se determinaron los inmunotipos y las concentraciones de LPS contaminantes, para lo cual se utilizaron geles de SDS-PAGE al 15% y muestras de LPS de los diferentes serogrupos de N. meningitidis. Se realizó el revelado de los geles con tinción con plata específica para LPS y los resultados se analizaron en un densitómetro GS-800 (Bio-Rad , controlado por el programa "Quantity One". Se obtuvieron curvas patrones para cada LPS que determinaron la concentración de LPS en estas muestras y se comprobó la utilidad del método al cuantificar la concentración de LPS en muestras de IFAs de VME de los diferentes serogrupos de N. meningitidis. Así se estableció la metodología para determinar la concentración de LPS de N. meningitidis serogrupos A, X y W135 en muestras de IFA de VME con el SDS-PAGE y se confirmaron las especificaciones de calidad establecidas para este parámetro.

For several years, Finlay Institute, in collaboration with the "Norwegian Institute of Public Health", is working in a project to obtain a vaccinal candidate from outer membrane vesicles (OMV) of N. meningitis serogroups A, W135 and X. To establish the quality specifications dealing with lipopolysaccharides (LPS), main cause of the pirogenicity of vaccines, is a necessity in this project. This work aims at establishing the conditions of SDS-PAGE to be used as a method for the quality control of the OMV as active pharmaceutical ingredient obtained from N. meningitidis serogroups A, W135 and X. The immunotypes of LPS were determined in studies as well as their concentrations as contaminants of OMV. SDS-PAGE gels at 15% and LPS samples from different serogroups were used; these gels were tinted with silver, specific for LPS, and the results were analyzed in a densitometer GS-800 (Bio-Rad) controlled by the program "Quantity One". As a result, LPS profile curves for each serogroup were obtained and the concentration of residual LPS in the OMV of different serogroups of N. meningitidis was quantified. As conclusion, the methodology to determine the concentration of LPS from N. meningitidis serogroups A, X and W135 in samples of OMV with SDS-PAGE was established, in addition the established quality specifications for this parameter were confirmed.

Antigenicity comparison of two peptidic constructions of mimotopes from Hepatitis A virus using immunized mice serum

La antigenicidad de los péptidos puede variar en dependencia del formato en que sean sintetizados. En el presente trabajo se comparó la antigenicidad de dos mimotopos del virus de la hepatitis A en dos formatos diferentes: como péptidos lineales y como sistemas de péptidos de múltiples antígenos. Se emplearon sueros de ratones que fueron inmunizados con un sistema de péptidos de múltiples antígenos (tetramérico) que contenían las secuencias peptídicas correspondientes a los dos mimotopos. Los mimotopos 46 y 56, tanto como péptidos lineales o en forma de sistema de péptidos de múltiples antígenos, fueron útiles para evaluar la respuesta de anticuerpos en el tiempo. El formato de sistema de péptidos de múltiples antígenos permitió una mayor sensibilidad en la detección de los anticuerpos inducidos por el inmunógeno. Estos resultados son de importancia en estudios de inmunogenicidad para una posterior aplicación de los antígenos evaluados en un ensayo tipo ELISA.

Antigenicity of peptides may vary depending on the format in which the peptide sequence is synthesized. In this study we compared the antigenicity of two mimotopes of hepatitis A in two different formats: linear peptides and multiple antigen peptides. Sera from mice were immunized with a tetrameric multiple antigen peptide containing the two mimotope peptide sequences. Mimotopes 46 and 56 were useful to evaluate the time course of the antibody response either as linear peptides or in the multiple antigen peptide formats. The Multiple antigen peptide formats allowed greater sensitivity in the detection of antibodies induced by the immunogen. These results are important for further application of the evaluated antigens in an ELISA for immunogenicity studies.

Selectivity: design criterion for complex reactions

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que se encuentran distribuidos en el organismo de forma diferente. Se ha descrito la presencia del gangliósido N-Glicolil GM3 (NGcGM3) en células tumorales humanas, que lo ha convertido en blanco atractivo para la terapia antitumoral específica. Esta molécula es el componente fundamental de un candidato vacunal contra el cáncer de mama que se encuentra en fase de ensayo clínico. Para la obtención de este gangliósido, mediante síntesis química, un intermedio clave es el aceptor de lactosa. En la síntesis de aceptores de lactosa que se utilizan para formar parte de oligosacáridos y glicoconjugados es necesario la protección de las posiciones 3´,4´ de lactosa con un grupo isopropilidén. Este trabajo se centra en la reacción de la síntesis del 3´,4´-isopropilidén de lactosa, un intermedio en la síntesis del aceptor de lactosa. Se estudió el efecto de la temperatura y el tiempo de reacción sobre la selectividad, encontrándose que en el rango estudiado los mejores resultados se encuentran con el nivel +1 de temperatura y el nivel -1 de tiempo de reacción. Se llevó a cabo la reacción en un reactor de 5 L y se logró reproducir los mejores resultados encontrados en el diseño experimental. La cromatografía de capa delgada semicuantitativa permitió cuantificar las cantidades de los isómeros 3´,4´-isopropilidén de lactosa y 4',6'-isopropilidén de lactosa que se obtienen en dicha reacción.

The gangliosides are glycosphingolipids that are distributed in the organism in different forms. The presence of the ganglioside N-Glycolil GM3 (NGcGM3) has been described in human tumoral cells, that is why it has became an attractive target for the specific antitumoral therapy. This molecule is the main component of the vaccine candidate for breast cancer in clinical trials phase. Lactose acceptor is a key intermediate to obtain this ganglioside by chemical synthesis, the protection of the positions 3´,4´ of lactose with an isopropiliden group is necessary in the synthesis of lactose acceptors that will be used to form part of oligosaccharides and glycoconjugates. This work is focused in the reaction to obtain 3',4'-lactose-isopropiliden, an intermediate in lactose acceptor synthesis. The reaction conditions were studied and the best results were found working at +1 level of temperature and -1 level of time reaction. The reaction was made in a 5 L reactor and the results were reproducible. The thin layer semi-quantitative chromatography was chosen to quantify the amount of the isomers 3´,4´ and 4',6'-lactose isopropiliden obtained in the reaction.