Vaccimonitor

Evaluación del riesgo biológico en la producción de vacunas inactivadas de uso animal

RESUMEN La vacunación continúa siendo una de las vías más sostenibles y utilizadas en el control de enfermedades infectocontagiosas en medicina veterinaria, dado por su mayor factibilidad económica y por el problema que representa el residuo de antibióticos en productos animales de consumo humano. El surgimiento de vacunas de nuevas generaciones ha motivado la instrumentación de medidas de bioseguridad y la necesidad de realizar estudios de evaluaciones de los riesgos que acometemos en la obtención y producción de vacunas, existiendo puntos críticos importantes en el proceso de obtención de las mismas. El área de vacunas inactivadas que se encuentra ubicada en la Empresa Productora de Vacunas Virales y Bacterianas UP-7, perteneciente al grupo empresarial LABIOFAM de La Habana, Cuba, se encarga de la producción y control de la calidad de las vacunas y los medios diagnósticos. Las inspecciones previas realizadas a dicha área mostraron, en el personal involucrado, desconocimiento y baja percepción del riesgo biológico existente en los procesos productivos que allí se llevan a cabo, lo que sugirió la realización de la presente investigación. Se identificaron y caracterizaron los peligros y se realizó una evaluación del riesgo, utilizando una matriz de estimación del riesgo; mediante un método cualitativo de posibilidad de ocurrencia del peligro y se evaluó de bajo, moderado o alto. Se identificaron las vulnerabilidades presentes empleando para ello una lista de chequeo, detectándose, entre otras, aquellas relacionadas con el diseño del área, con el tratamiento de los desechos y la organización de la bioseguridad, lo que confirmó puntos críticos dentro del proceso productivo con riesgo alto y moderado.

ABSTRACT Vaccination continues being one of the most sustainable and used ways in the control of infectious and contagious diseases in veterinary medicine because of both its greater economic feasibility and thwarting animal products from having antibiotics residues, a big-time issue for human ingestion. The appearance of new generation vaccines has motivated the application of biosafety measures and the need to carry out studies of risk assessments that we undertake to obtaining and producing vaccines, being important critical points in the process of acquiring them. The inactivated vaccines’ area is located in the UP-7 Viral and Bacterial Vaccine Production Company, belonging to LABIOFAM business group in Havana, Cuba; this area is responsible for vaccines, diagnostic means production and quality control. Previous checkups carried out showed that the personnel involved had lack of knowledge and low perception of the existing biological risk in the productive processes carried out there; leading to suggest the investigation. Hazards were identified and characterized and a risk assessment was carried out, using a qualitative estimate risk matrix. Such hazards were assessed as low, moderate or high. Vulnerabilities were identified using a checklist to this purpose, detecting those related to area design, treatment of waste and the biosafety organization, which established the existence of critical points within the production process with high and moderate risk.

Inmunoterapia con alérgenos de ácaros en pacientes con rinitis alérgica y apnea obstructiva del sueño

RESUMEN Para confirmar la presencia de apnea obstructiva del sueño (OSA) en rinitis alérgica (RA), se realizó poligrafía cardiorrespiratoria (CRP) y para tratar ambas condiciones, inmunoterapia alérgeno específica (ITAE). El diseño fue descriptivo en el universo de pacientes del servicio de Alergología del policlínico “Previsora” en Camagüey, Cuba, desde diciembre 2018 a marzo 2020. Se seleccionaron 326 pacientes en orden consecutivo de asistencia a la consulta, teniendo en cuenta los criterios: ≥5 años con RA, sospecha de OSA y prueba cutánea con ácaros: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides siboney y Blomia tropicalis, producidos en: “Centro Nacional de Biopreparados” de Cuba. Todos recibieron ASIT por ≥10 meses y se realizó CRP antes y después de la ASIT. La CRP se realizó utilizando el marcaje automático de eventos de ApneaLink AirTM (Resmed Corp., RFA), validado para estudiar los trastornos del sueño en el hogar. Los resultados de la prueba cutánea y de CRP se evaluaron antes y después de la ASIT; también la eficacia de la ASIT según criterios de pacientes y profesionales. De la muestra, 152 fueron del sexo femenino y 174 del sexo masculino para un 46,6% y 53,4% respectivamente; aquellos con habón de 5 a 6 mm fueron los más representados (p=0,04). Hubo descenso en los niveles de gravedad de OSA después de la ASIT (p=0,025). En la valoración de la eficacia de la ASIT, hubo un número significativo de mejorados (p=0,012). La CRP proporciona el diagnóstico de OSA en RA, y la ASIT cambia el curso de ambas condiciones.

ABSTRACT To confirm the presence of obstructive sleep apnea (OSA) in allergic rhinitis (AR), cardiorespiratory polygraphy (CRP) was performed, and to treat both conditions, the allergen specific immunotherapy (ASIT) was used in order to change their course. Descriptive study in the universe of patients from “Previsora” polyclinic Allergology service, Camagüey, Cuba was carried-out from December 2018 to March 2020. 326 patients were selected in consecutive order of attendance at the consultation, taking into account the criteria: ≥5 years with AR, suspicion of OSA and positive skin test to: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides siboney and Blomia tropicalis, supplied by the "National Center for Biopreparations" in Cuba. All patients received ASIT for ≥10 months and CRP was performed before and after ASIT. The CRP results were taken from the automatic scoring of the ApneaLink AirTM device (Resmed Corp., Australia), validated to study OSA at home. The skin test and CRP results were evaluated before and after the ASIT. In addition, the assessment of the ASIT efficacy according to criteria of patients and professionals was performed. The sample was made-up of 152 female patients (46.6%) and 174 males (53.4%); those with 5 to 6 mm wheal were the most represented (p=0.04). There was decrease in OSA severity levels after ASIT (p=0.025). The ASIT efficacy was proved with a significant number of improvements (p=0.012). CRP provides the diagnosis of OSA in AR, and ASIT changes the course of both conditions.

Aplicación del análisis de componentes principales en la formación de dímeros durante la purificación de un anticuerpo monoclonal

RESUMEN El producto Nimotuzumab, altamente demandado para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello, se produce en el Centro de Inmunología Molecular a partir del cultivo, fermentación y purificación en la línea NS0/H7. El uso de tecnologías adecuadas para la producción a gran escala de anticuerpos monoclonales, de acuerdo con las buenas prácticas de manufactura y con costos de producción razonables, se convierte en una necesidad para introducir anticuerpos terapéuticos en mercados de alta demanda y con elevados requerimientos de calidad. El incremento en la presencia de dímeros en el producto final afecta su calidad, por ende, la eficiencia y eficacia del proceso. Se utilizaron las bases de datos del centro para realizar un análisis de componentes principales, empleando el programa The Unscrambler 10.4 y se determinaron como variables más influyentes en la variabilidad de los resultados: las conductividades del producto ajustado y de salida en la columna de proteína A y membrana SQ y la masa de IgG en sobrenadante y eluato de proteína. Se realizó un análisis de Pareto para determinar los parámetros críticos del proceso, resultando ser: el pH de los tampones de elución y ajuste, del producto ajustado, de la salida en proteína y membrana, la masa de IgG en eluato de proteína y sobrenadante, y la conductividad del producto ajustado.

ABSTRACT Nimotuzumab is produced at the Center of Molecular Immunology (CIM). It is obtained from the culture, fermentation, and purification in the cell line NS0/H7. This product has a high demand both domestically and internationally for the treatment of head and neck cancer. The use of adequate technologies for the large-scale production of this product following good manufacturing practices and reasonable production costs becomes a necessity to introduce this therapeutic antibody in high demand markets with high-quality requirements. The increase in dimers in the final product will affect its quality, which in turn affects the efficiency and effectiveness of the process. Production databases were used to perform principal component analysis using The Unscrambler 10.4 software. The conductivity of the adjusted product, pH at the output product in the protein column and membrane, the mass of supernatant, and of the eluate are detected as the variables with a higher influence on aggregate formation. The Pareto analysis was carried out to determine the critical parameters of the process: pH of elution and adjust buffers, and adjusted products, pH at the exit of protein column and membrane, the mass of protein in the eluate, and in the supernatant, and the conductivity of the adjusted product.

Gestión de riesgos relativo al cambio de campaña productiva durante la etapa de desarrollo tecnológico en una instalación multiproducto

RESUMEN Los nuevos paradigmas de la industria farmacéutica en el siglo XXI incorporan el uso de las técnicas de gestión de la calidad, necesarias en el cumplimiento de las buenas prácticas de fabricación en el sector biotecnológico. En este caso de estudio, se aplicó la gestión de riesgo en el cambio de campaña entre los ingredientes farmacéuticos activos de futuros candidatos inmunoterapeúticos contra el cáncer, en la etapa de desarrollo tecnológico en una instalación multiproducto certificada. Las causas potenciales de mayor influencia en las fallas son: la calificación del personal de la Dirección de Desarrollo Tecnológico en los procedimientos patrones de operación de la planta, la mezcla entre los componentes y materiales no dedicados utilizados en el proceso de purificación cromatográfica, la documentación en elaboración o aprobación y el establecimiento de las técnicas analíticas en función de la etapa del proyecto. Como resultado se proponen acciones que minimizan los riesgos de la contaminación cruzada y hacen viable un adecuado cambio de campaña entre la fabricación de los inmunoterapéuticos, durante el desarrollo tecnológico en una instalación multiproducto de la industria biotecnológica.

ABSTRACT The new paradigms of the pharmaceutical industry in the 21st century introduce the use of modern quality management techniques to comply with good manufacturing practices in the biotechnological area. In this paper, it was applied the risk management for the campaign change among the process for obtaining the active pharmaceutical ingredients to future immunotherapeutic candidates at the technological development stage in a certified multi-product facility. Particularly, the training for the development personnel in the standard operating procedures of the facility, the mixture between the components and non-dedicated materials used in the chromatographic purification process, the documentation in the preparation or approval, and the establishment of analytical techniques depending on the stage of the project are the potential causes of greater influence. As a result, actions are proposed to minimize risks and carry out an adequate campaign change feasible between the manufacture of immunotherapeutics during the technological development stage in a biotechnological multi-product facility.

Caracterización de pacientes alérgicos a picadura de abeja que reciben inmunoterapia

RESUMEN La alergia al veneno de abejas provoca reacciones de leves a severas con compromiso para la vida. La inmunoterapia con veneno de himenópteros es un tratamiento eficaz y protege a los pacientes alérgicos de sufrir reacciones sistémicas ante nuevas picaduras. Nos propusimos caracterizar los pacientes alérgicos a picaduras de abeja que reciben inmunoterapia. Se realizó un estudio observacional descriptivo de corte longitudinal en pacientes alérgicos a las picaduras de abeja tratados con inmunoterapia de extracto de abeja en el Hospital Universitario “General Calixto García” de La Habana, Cuba. La muestra fue de 17 pacientes que cumplieron los criterios de inclusión. Usamos técnicas de estadística descriptiva: promedio, probabilidad y puntaje estandarizado, así como técnicas de estadística inferencial tales como Chi cuadrado, verificando asociación significativa entre las variables; el nivel de significación empleado fue del 5% (p˂0,05). La tercera década de la vida fue la edad promedio de los pacientes. Se observó predominio del sexo masculino y residencia en zona urbana. Alrededor de la mitad de los pacientes tenían rinitis y antecedentes familiares de asma. Todos los pacientes tuvieron reacciones locales, la mayoría se re-expusieron a la picadura; de ellos, solo el 20% presentaron reacciones alérgicas sistémicas después de la inmunoterapia. Se concluye que la reactividad cutánea al extracto de abeja se redujo con el tratamiento de inmunoterapia.

ABSTRACT Allergy to bee venom may cause from mild to severe reactions threatening the patient´s life. Immunotherapy with hymenopter venom is an effective treatment that can protect allergic patients from suffering systemic reactions to new stings. The aim of this study was to characterize allergic patients to bee sting that receive immunotherapy. A descriptive longitudinal observational study was carried out in allergic patients to bee sting receiving immunotherapy with bee extracts in the University Hospital General “Calixto García”, Havana, Cuba. A sample of 17 patients with inclusion criteria was analyzed. Descriptive statistical techniques were used: mean, probability, standardized score, as well as, inferential statistic techniques such as the Chi square; verifying significant association between variables. The level of signification was 5% (p˂0.05). The third decade of life was the average age of the patients in this study; male sex and, urban residents were predominant. Around half of the patients had rhinitis and family history of asthma. All patients had local reactions; most of the patients were re-exposed to stings. Only 20% of patients reported systemic allergic reaction after immunotherapy. Skin reactivity to bee extract was reduced with the immunotherapy.

Expresión recombinante en Saccharomyces boulardii de la subunidad A del pili corregulado con la Toxina (TcpA) de Vibrio cholerae O1

ABSTRACT Cholera is endemic in over 50 countries with an estimated mortality of 100,000-120,000. Vaccination is considered the complementary key to prevent and control cholera; therefore, alternative vaccine preparations are needed. Toxin Co-regulated Pilus is part of the toxR virulence regulon, which is necessary for colonization in the intestinal mucosa. In order to express Vibrio cholerae TcpA protein in Saccharomyces boulardii, the expression plasmid pYES2 was constructed by inserting tcpA gene isolated from local Vibrio cholerae Eltor Inaba isolates. The new construct was transferred into Saccharomyces boulardii cells and the expression of tcpA gene was induced from the GAL1 promoter by adding galactose to the medium. The SDS-PAGE and Western blot analysis showed the presence of TcpA in yeast. These results showed that Saccharomyces boulardii is a promising host to express Vibrio cholerae toxin TcpA as the first step in attempt to produce an oral Vibrio cholerae vaccine.

RESUMEN El cólera es endémico en más de 50 países. Se estima una mortalidad entre 100.000 - 120.000 debido a esta enfermedad. La vacunación se considera una medida complementaria para prevenir y controlar el cólera, por lo tanto, se necesitan preparaciones vacunales alternativas a las existentes. El Pili corregulado con la toxina, es parte del regulón de virulencia toxR, y es necesario para la colonización en la mucosa intestinal. Para expresar la proteína tcpA de Vibrio cholerae en Saccharomyces boulardii, se construyó el plásmido de expresión pYES2 insertando el gen tcpA obtenido a partir de aislamientos locales de Vibrio cholerae El Tor Inaba. La nueva construcción se transfirió a las células de Saccharomyces boulardii y se indujo la expresión del gen tcpA a partir del promotor GAL1 mediante la adición de galactosa al medio. El análisis mediante SDS-PAGE y Western blot demostró la presencia de TcpA en levaduras. Los resultados demostraron que Saccharomyces boulardii es un hospedero prometedor para expresar el gen tcpA de Vibrio cholerae como el primer paso en el intento de producir una vacuna oral contra Vibrio cholerae.

Eficacia protectora de una vacuna inactivada contra el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo tipo 2 preparada a partir de un aislado local en Egipto

ABSTRACT Rabbit hemorrhagic disease is a contagious viral disease of rabbits controlled by vaccination. The present study was aimed to diagnose rabbit hemorrhagic disease from 11 infected farms from Qalubia governorate during 2019 and to prepare homologous vaccine against rabbit hemorrhagic disease virus 2. For this purpose, 11 liver samples were collected from suspected cases and subjected to detection and identification of circulating rabbit hemorrhagic disease virus. Ten samples were confirmed to be rabbit hemorrhagic disease virus using hemagglutination test, animal inoculation and reverse transcriptase polymerase chain reaction. Sequencing and phylogenetic analysis of two isolates (R5&R6) revealed the presence of rabbit hemorrhagic disease virus 2 (A/Qalubia/2019 and B/Qalubia/2019) under accession number MT07629 and MT067630 respectively. The inactivated rabbit hemorrhagic disease virus vaccines were prepared using Montanide ISA 206 oil or aluminum hydroxide gel adjuvants. Prepared vaccines were inoculated subcutaneously in susceptible rabbits and submitted to sterility, safety and potency tests. Obtained results showed that mean hemagglutination inhibition titer for aluminum hydroxide gel vaccine was 6,7.7,8.9 and 9.1 log2 while, Montanide vaccine reached to 6.7,8.7,9.2 and 9.5 log2 at 1st, 2nd, 3rd, and 4th weeks post vaccination, respectively. Immunized rabbits with Montanide vaccine showed better protection reach to 70%, 90%, 100% and 100% when compared to aluminum hydroxide gel vaccine 60%, 70%, 90% and 90% at 1st, 2nd, 3rd and 4th weeks post vaccination respectively. It was concluded that newly emerged rabbit hemorrhagic disease virus 2 was isolated from suspected cases. The two prepared vaccines were sterile, safe and potent. The oily adjuvanted rabbit hemorrhagic disease virus 2 vaccine stimulated an earlier and higher humoral immune response than the aluminum hydroxide gel adjuvanted vaccine. This humoral immune response achieved significant level of protection.

RESUMEN La enfermedad hemorrágica del conejo es una enfermedad viral contagiosa de los conejos que se controla mediante vacunación. El presente estudio tuvo como objetivo diagnosticar la enfermedad hemorrágica del conejo en 11 granjas infectadas de la provincia de Qalubia, durante 2019 y preparar una vacuna homóloga contra el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo tipo 2. Para este propósito, se recolectaron 11 muestras de hígado de casos sospechosos y se sometieron a detección e identificación de virus circulante de la enfermedad hemorrágica del conejo. Se confirmó que diez muestras eran positivas al virus de la enfermedad hemorrágica del conejo, utilizando para ello la prueba de hemaglutinación, inoculación en animales y Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa. La secuenciación y el análisis filogenético de dos aislamientos (R5 y R6) revelaron la presencia del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo tipo 2 (A/Qalubia/2019 y B/Qalubia/2019) con los números de acceso MT07629 y MT067630 respectivamente. Las vacunas inactivadas del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo se prepararon usando adyuvantes de gel de hidróxido de aluminio o aceite Montanide ISA 206. Las vacunas preparadas se inocularon por vía subcutánea en conejos susceptibles y se sometieron a pruebas de esterilidad, seguridad y potencia. Los resultados obtenidos mostraron que el título medio de inhibición de la hemaglutinación para la vacuna en gel de hidróxido de aluminio fue de 6; 7,7; 8,9 y 9,1 log2, mientras que la vacuna de Montanide alcanzó 6,7; 8,7; 9,2 y 9,5 log2 en la 1ª, 2ª, 3ª y 4ª semanas después de la vacunación, respectivamente. Los conejos inmunizados con la vacuna Montanide tuvieron una mejor protección, alcanzándose niveles de 70%, 90%, 100% y 100% en comparación con la vacuna en gel de hidróxido de aluminio 60%, 70%, 90% y 90% en la 1ª, 2ª, 3ª y 4ª semanas después de la vacunación, respectivamente. Se concluyó que el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo tipo 2 de reciente aparición se aisló de los casos sospechosos. Las dos vacunas preparadas fueron estériles, seguras y potentes. La vacuna contra el virus de la enfermedad hemorrágica del conejo tipo 2 con adyuvante oleoso estimuló una respuesta inmune humoral más temprana y mayor que la vacuna con adyuvante en gel de hidróxido de aluminio. Esta respuesta inmune humoral confirió un nivel significativo de protección.