Biotecnología Aplicada

Complexity and solutions to the isolation problem of Gram negative lipopolysaccharides' bacteria molecular species

Gram negative bacteria frequently synthesize a great number of lipopolysaccharides (LPS) molecular species. The high LPS structural heterogeneity and its trend to conform molecular aggregates make the fraction of its molecular species extremely difficult. The application of chromatographic methods individually has allowed the obtainment of little homogeneous LPS fractions. With the combination of orthogonal chromatographic principles, only the purification of the simplest rough type LPS up to chemical homogeneity has been reached. This has determined that efforts aimed at more homogeneous LPS isolation is focused on the use of electrophoresis in slab gel. Electrophoresis methods are capable of separating species of similar molecular masses next to from the most complex smooth type LPS. Consequently upon this basis, a new methodology allowing the isolation of intact LPS of either rough or smooth types up to electrophoretic homogeneity has been developed. Under such methodology, sensible structural analysis through mass spectrometry and LAL (Limulus Amebocyte Lysate) activity of LPS individual species is feasible, composed of just a few chemical species. This methodology has proved the possible way of combining electrophoresis with other orthogonal separation principles, a further step which could guarantee the obtainment of chemically homogeneous preparations from complex LPS mixtures.

Las bacterias Gram negativas sintetizan de manera frecuente un gran número de especies moleculares de lipopolisacáridos (LPS). La elevada heterogeneidad estructural de los LPS y su tendencia a formar agregados moleculares hacen extremadamente difícil el fraccionamiento de sus especies moleculares. La aplicación de métodos cromatográficos de forma individual ha permitido la obtención de fracciones de LPS poco homogéneas. Con la combinación de principios cromatográficos ortogonales, solo se ha logrado la purificación hasta homogeneidad química de los LPS de tipo rugoso más simples. Ello ha determinado que los esfuerzos dirigidos al aislamiento de LPS más homogéneos se centren en el uso de la electroforesis en el gel plano. Los métodos de electroforesis son capaces de separar especies de masas moleculares cercanas de LPS más complejos de tipo liso. Consecuentemente, sobre esta base se ha desarrollado una nueva metodología que permite el aislamiento de LPS intactos de tipo rugoso o liso hasta homogeneidad electroforética. Con ella es posible el análisis estructural sensible por espectrometría de masas y la medición de la actividad LAL (Limulus Amoebocyte Lysate) de especies individuales de LPS, compuestas de unas pocas especies químicas. Esta metodología ha abierto las puertas hacia la posibilidad de combinar la electroforesis con otros principios ortogonales de separación, un próximo paso que podría facilitar la obtención de preparaciones químicamente homogéneas a partir de mezclas de LPS complejas.

Challenges for the design of effective vaccines or drugs against Cholera and Tuberculosis: Possible contributions from omics and bioinformatics

This manuscript shows the current situation of two re-emerging diseases: cholera and tuberculosis, which still constitute one of the major health problems in poor countries. In this regard, difficulties, challenges and perspectives for the development of new drugs and vaccines against these diseases are discussed. The possible contributions of structural biology, bioinformatics and omics to obtain an effective treatment are also considered.

El cólera y la tuberculosis son enfermedades re-emergentes que constituyen un serio problema de salud en los países pobres. En este trabajo se realiza una revisión sobre las dificultades, los retos y las perspectivas para el tratamiento de ambas enfermedades. Particularmente se abordan las aplicaciones de la biología estructural, la bioinformática y la integración de datos en el desarrollo de nuevas drogas y vacunas.

G Protein-coupled receptors as targets for drug design

G protein-coupled receptors (GPCRs) are the target for more than 50% of the drugs currently on the market, including about 25% of the 100 top-selling drugs. They are considered the most important molecules in the field of drug discovery and design today, mostly due to their role as receptors in many of the basic processes in the body, and because they are present in all tissues. Unfortunately, a structure-based rational design is very difficult for GPCRs; the structures available for modeling purposes are only for family A. Despite this fact, research has continued and progressed, using combined structure-based techniques. This review intends to summarize this work.

Los receptores asociados a proteínas G (GPCRs), son el blanco de más del 50% de los medicamentos que se encuentran actualmente en el mercado, e incluyen cerca del 25% de la lista de las 100 medicinas más vendidas en el mundo, estas moléculas son consideradas hoy en día como las más importantes para el diseño de fármacos, fundamentalmente por su papel como receptores de la mayoría de los procesos básicos del organismo, además de estar presentes en todos los tejidos. Desafortunadamente el diseño racional basado en la estructura se hace muy difícil para las GPCRs, las estructuras que existen son solo de la familia. A pesar de esto, las investigaciones han continuado y progresado utilizando técnicas combinadas. Esta revisión trata de resumir este trabajo.

**Improving the expression of Human Epidermal Growth Factor in Saccharomyces cerevisiae by manipulating culture conditions**

Human Epidermal Growth Factor (hEGF) is a protein molecule with potent mitogenic activity, increasing the rate of wound and ulcer healing in different tissues of the human body. In recent years, the Center for Genetic Engineering and Biotechnology (CIGB) has carried out projects at the developmental stages for the application of hEGF in novel therapies. It is now necessary to increase production capacity within the same facility, to meet the increasing demand of this product.The aim of this work was to increase hEGF expression levels by optimizing the culture conditions. The culture media, pH and temperature dependency of hEGF expression and degradation rate were studied. An increase of 1.8 times of the hEGF expression level was achieved by adding to the medium 50 mg/L of histidine and leucine. A factorial design experiment was applied to optimize the yeast extract and bacteriological peptone concentration in the culture media. The statistical analysis of response surface predicted that using 18 g/L of yeast extract and 25 g/L of bacteriological peptone improved the hEGF expression level up to 3.5 mg/g. This is the highest expression level reported for hEGF in yeast up to now. Furthermore, the form in which the hEGF degradation rate was reduced to less than 10% in fermenters when the culture was made on the optimized medium at pH 6.5 and 25 °C, is discussed.

El Factor de crecimiento epidérmico humano (FCE-h) es una proteína que posee una potente actividad mitógenica la cual se manifiesta en el incremento la velocidad de cicatrización de heridas y ulceras en diferentes tejidos del cuerpo humano. Durante los últimos años el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) ha estado involucrado en diversos proyectos de terapias novedosas asociadas al uso del FCE-h. Actualmente existe la necesidad de aumentar de forma significativa la capacidad productiva de esta molécula en la misma instalación industrial para dar respuesta a la creciente demanda de este producto. El objetivo central de este trabajo fue el aumento del nivel de expresión de FCE-h mediante la optimización de las condiciones de cultivo. En el siguiente trabajo se estudió la influencia del medio de cultivo, el pH y la temperatura sobre la expresión del Factor de Crecimiento Epidérmico humano (FCE-h). Se logró un aumento de 1.8 veces en el nivel de expresión del FCE-h mediante la adición de 50 mg/L de histidina y leucina respecto al medio base. El medio de cultivo fue optimizado empleando un experimento factorial de superficie de respuesta. Se encontró un óptimo de concentración de extracto de levadura y peptona bacteriológica de 18 y 25 g/L, respectivamente, correspondiéndose con un nivel de expresión máximo de 3.5 mg/g. Este nivel de expresión es el máximo reportado para el FCE-h en levaduras. Por otra parte, se discute como es posible lograr un control de la proteolisis del FCE-h cuando se opera a un pH de 6.5 y una temperatura de 25 °C.

**Acuabio 1, an enhancer of the immune system in Litopennaeus vannamei shrimps**

Acuabio 1 is a mixture of proteins and essential amino acids that exerts a stimulating effect in the development of aquatic organisms. It synchronizes and accelerates fish and shrimp larvae growth on early developmental stages, as well as increases the development and size of these animals. In this work, the stimulating effect of Acuabio 1 on the immune system of Litopennaeus vannamei shrimps was demonstrated by obtaining (5.4 x 10(6) hemocytes/mL) greater than the control group (4.3 x 10(6) hemocytes /mL). The hemolymph of treated animals showed higher lectin titers (16) than the control group (8). Animals treated with Acuabio 1 increased their phenoloxidase and peroxidase activities, indicating an enhanced oxidative defense. Furthermore, Acuabio 1 decreased the number of Vibrio spp. and Pseudomonas spp. colony forming units in the culture medium, suggesting a possible prebiotic function. All these properties make Acuabio 1 very attractive to improve the production, survival rate and quality of shrimp larvae.

Acuabio 1 es una mezcla de proteínas y aminoácidos esenciales que ejerce un efecto estimulador en el desarrollo de los organismos acuáticos. Sincroniza y estimula el crecimiento de larvas de peces y camarones. Con su empleo se activa y acelera el mecanismo de crecimiento desde edades muy tempranas, así como el desarrollo y la talla de los animales. En el presente trabajo se evidencia el efecto estimulador del sistema inmune del producto Acuabio 1 en camarones (Litopenaeus vannamei). Se determinó que al tratar los animales con este producto aumentó el número de hemocitos totales (5.4 x 10(6) hemocitos/mL) con respecto a los del grupo control (4.3 x 10(6) hemocitos/mL). Se observó que la hemolinfa de los camarones tratados tuvo mayor título de lectinas (16) comparado con el control (8). En los animales tratados con Acuabio 1 se encontró un aumento de las actividades específicas fenoloxidasa y peroxidasa comparadas con las del control, lo que indicó un aumento de la defensa oxidativa en estos animales. También se halló que Acuabio 1 disminuyó el número de unidades formadoras de colonias en el medio para Vibrio spp. y Pseudomonas spp., lo que sugiere una posible función prebiótica. Estas propiedades del producto Acuabio 1 lo hacen muy atractivo para su utilización en el mejoramiento de la producción, supervivencia y calidad de las larvas de camarones.

Epidermal growth factor in the treatment of radiogenic proctitis

Radiogenic proctitis is a frequent complication of therapeutic radiation at the pelvic region. The aim of this study was to determine the efficacy of the epidermal growth factor (EGF) in treating patients with proctitis as a complication of radiotherapy of gynecological tumors. A phase II, placebo-controlled, randomized, double blind clinical trial was carried out. The treatment groups were: A) a solution of human recombinant epidermal growth factor (10 µg/ ml) in carboxymethyl cellulose or B) placebo (carboxymethylcellulose solution alone); the treatment was administered as a retention enema (20 mL) twice a day after bowel movement for 6 months. We included women of 18-75 years of age with proctitis as a complication of an ionizing radiation treatment of gynecological malignant tumors, confirmed by endoscopy, who gave their consent to participate. Thirty-seven patients were included. The basic demographic variables and were homogeneous among groups, which were comparable. There were more responses in group A (EGF) than in the control (placebo), but the difference was not statistically significant. Considering only those patients who completed the treatment, the difference in response was greater with EGF (86% vs 60%). The symptoms disappeared more rapidly in the group treatedwith EGF (p=0.027 and p=0.016, for bleeding and tenesmus, respectively). The product under study was well tolerated. Although there are signs of improvement in some symptoms, the sample was too small to demonstrate the effectiveness of Hebervis in the treatment of proctitis.

La proctitis radiógena es una complicación frecuente de la terapia radiante en la región pélvica. El objetivo de este estudio fue determinar la eficacia del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) en el tratamiento de pacientes con proctitis como una complicación de la radioterapia de tumores ginecológicos. Se ejecutó un ensayo clínico fase II, controlado con placebo, aleatorizado y doble ciegas. Los grupos de tratamiento fueron: A) Solución viscosa de carboximelticelulosa con aditivo de EGF (10 µg/mL) y B) Placebo (solución viscosa de carboximelticelulosa); el tratamiento se administró en forma de enemas a retener (20 mL) dos veces al día, después de la evacuación intestinal, durante 6 meses. Se incluyeron mujeres con edades comprendidas entre 18-75 años, con proctitis como una complicación de la radiación ionizante del tratamiento de tumores malignos ginecológicos, confirmados por endoscopia, que dieron su consentimiento de participación. Treinta y siete pacientes fueron incluidas. Las variables demográficas y de base fueron homogéneas entre los grupos, por lo que fueron comparables. Hubo más respuestas en el grupo A (EGF) que en el control (placebo), pero la diferencia no fue estadísticamente significativa. Considerando solamente las pacientes que completaron el tratamiento, la diferencia en la respuesta fue mayor (86% vs 60%). Los síntomas desaparecieron más rápidamente en el grupo tratado con EGF (p=0.027 y p=0.016, para el sangrado y el tenesmo, respectivamente). El producto en estudio fue bien tolerado. Aunque hay indicios de mejoría de algunos síntomas, la muestra fue insuficiente para demostrar la eficacia del Hebervis en la curación de la proctitis.

Neuroprotective effect of the systemic administration of MK-801 on the pedunculopontine nucleus of hemiparkinsonian rats

Glutamatergic antagonists were administered in rats, as part of the current pharmacological therapies for neuroprotection of patients with Parkinson disease, due to glutamatergic hyperactivity and the deleterious effects of this condition. The effect of the systemic administration of MK-801, an antagonist of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, was evaluated on the extracellular concentrations of glutamate (Glu) and gamma amino butyric acid (GABA), loss of dopaminergic cells and cell death in the pedunculopontine nucleus (PPN) of hemiparkinsonian rats. Five treatments were studied in Wistar rats: lesion in the substantia nigra pars compacta (SNpc) with 6- hydroxydopamine (6-OHDA)(n = 15); 6-OHDA lesion plus the systemic administration of MK-801 (0.5 mg/kg; n = 17); false lesion in the SNpc (n = 10), false lesion in the SNpc plus false systemic treatment (n = 10) and no treatment (n = 22). The extracellular concentrations of Glu and GABA were analyzed by cerebral microdialysis and high performance liquid chromatography coupled to fluorometric detection. The loss of dopaminergic cells and cell death processes in the PPN were assessed by immunohistochemistry for tyrosine hydroxylase and the TUNEL technique, respectively. The extracellular concentrations of Glu and GABA significantly decreased in the PPN after the MK-801 treatment, compared to untreated hemiparkinsonian rats. This treatment caused a decreased loss of dopaminergic cellular bodies in the tegmental ventral area of rats and prevented cell death in the PPN of hemiparkinsonian rats. These results suggest a neuroprotective effect mediated by a decreased glutamatergic tone in hemiparkinsoninan rats systemically treated with an antagonist of NMDA receptors.

Como parte de las estrategias farmacológicas para la neuroprotección en pacientes con enfermedad de Parkinson se administraron antagonistas glutamatérgicos, ya que se conoce la hiperactividad glutamatérgica en esta afección y su consecuencia deletérea. Se evaluó el efecto de la administración sistémica de MK-801, un antagonista de los receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), en las concentraciones extracelulares de glutamato (Glu) y ácido g-aminobutírico (GABA), la pérdida de células dopaminérgicas y el proceso de muerte celular en el núcleo pedunculopontino (NPP) de ratas hemiparkinsonizadas. Se evaluaron cinco grupos de ratas Wistar: ratas con lesión de la substantia nigra pars compacta (SNpc) con 6-hidroxidopamina (6-OHDA) (n = 15), lesionadas con 6-OHDA + administración sistémica de MK-801 (0.5 mg/kg de peso) (n = 17), con falsa lesión de la SNc (n = 10), lesionadas en SNc + falso tratamiento sistémico (n = 10) y ratas sanas (n = 22). Se estudió la concentración extracelular de Glu y GABA mediante microdiálisis cerebral y cromatografía líquida de alta resolución acoplada a detección fluorimétrica, así como la pérdida de células dopaminérgicas y el proceso de muerte celular en el NPP, mediante técnicas inmunohistoquímicas para tirosina hidroxilasa y TUNEL, respectivamente. Las concentraciones extracelulares de Glu y GABA en el NPP disminuyeron significativamente tras el tratamiento sistémico con MK-801, en comparación con las ratas hemiparkinsonizadas que no lo recibieron. La administración de este fármaco provocó menos pérdida de cuerpos celulares dopaminérgicos en el área tegmental ventral de las ratas tratadas, y previno el proceso de muerte celular en el NPP de las ratas hemiparkinsonizadas. Estos resultados sugieren un efecto neuroprotector por la disminución del tono glutamatérgico en ratas hemiparkinsonizadas tratadas sistémicamente con un antagonista de los receptores NMDA.

Electrochemical impedance spectroscopy: An effective tool for a fast microbiological diagnosis

Dielectric spectroscopy, also called electrochemical impedance spectroscopy, is traditionally used in monitoring corrosion and electro-deposition processes in the coating and characterization assessment of many kinds of sensors and semi-conductors. Its application in biotechnology for the characterization of cell cultures has, however, been notably expanded in the last decade. As a transductional principle, impedance has been applied in the field of microbiology as a means of detecting and quantifying pathogenic bacteria. This paper reviews the state-of-the-art of Impedance Microbiology, its progress and its applications for the detection of foodborne pathogenic bacteria, including the use of interdigitated microelectrodes, the development of chip-based impedance microbiology and the integration of impedance biosensors along with other techniques such as dielectrophoresis and electropermeabilization. Reference is made to basic components, definitions and principles of this technique, as well as to the explanation of the components and principles for cell culture design and the use of equivalent circuits for the analysis of the systems based on this alternative.

La espectroscopia dieléctrica o espectroscopia de impedancia electroquímica es empleada tradicionalmente en el registro y estudio de los procesos de corrosión y electrodeposición, en la evaluación de recubrimientos y en la caracterización de muchos tipos de sensores y semiconductores. En la última década se han ampliado notablemente sus aplicaciones en la Biotecnología para la caracterización de células biológicas, el diagnóstico de enfermedades y la caracterización del cultivo de células. Como principio de transducción, la técnica de impedancia ha sido aplicada en el campo de la microbiología como un medio para detectar y cuantificar microorganismos patógenos. El presente trabajo revisa el estado del arte de la microbiología de impedancia, el progreso y las aplicaciones en la detección de microorganismos patógenos incluido el uso de los microelectrodos interdigitados, el desarrollo de la miniaturización de la microbiología de impedancia y la integración de los biosensores de impedancia con otras técnicas como la dielectroforesis y la electropermeabilización. Se hace referencia a conceptos básicos, definiciones y fundamentos de esta técnica, así como se abordan los componentes, principios para el diseño del medio de cultivo y uso de circuitos equivalentes para el análisis de los sistemas basados en esta alternativa.

Mutated variant of human vascular endothelial growth factor as a vaccine candidate for cancer immunotherapy

Analysis of the genetic variability and immunological properties of the NlpB antigen, a novel protein identified in Neisseria meningitidis

New evidence of the development of dengue hemorrhagic fever during the dengue 3 epidemic in Cuba

For the first time this paper defines some of the factors involved in the development of dengue hemorrhagic fever during the dengue-3 epidemic in Cuba. The secondary infection is confirmed to be the most important risk factor in that epidemic, after 24 years of the primary infection with dengue-1, in contrast to the infection sequence dengue- 2/dengue-3 that showed no relationship. Tertiary infection was also related to the development of dengue hemorrhagic fever. The neutralizing antibody titers were different for strains of dengue-3 of the same genotype in a panel of sera of late convalescent patients with both clinical epidemic conditions. Viremia was longer in the primary than in secondary infection; the first neutralizing antibodies were not detected during acute phase, while in the secondary infection the neutralizing antibodies were detected after the fifth day, coinciding with the decline of the viremia. In general, neutralizing antibodies reached lower levels in dengue fever patients, compared to those who developed dengue hemorrhagic fever.