Biotecnología Aplicada

Erratum: Experiencias del Programa de atención integral a pacientes con pie diabético en el estado Zulia, Venezuela [Biotecnol Apl;27(2):101-9]

Materiales compuestos de quitosana e hidroxiapatita

In the past 20 years, there has been a growing trend towards the development and use of biomaterials for the repairing and restoration of damaged bone tissue. The calcium phosphate bioceramics have attracted great attention in the field of orthopaedics because of its similarity to the mineral component of bone tissue. They have been used as granules for example in non-load bearing small implants, such as middle ear implants, in coatings on metals as dental implants, as well as in porous implants to stimulate bone growth within the implant; and cements, which are implanted in a paste like form and harden in vivo. The clinical disadvantages associated with them are primarily focused on poor mechanical strength and slow resorption kinetics as compared with the surrounding tissue. Therefore, current studies are aimed at creating new formulations combining calcium phosphate compounds with biopolymers, in order to avoid the frequent migration of bioceramic particles from the implant site, reducing potential damage to soft tissue in the vicinity of the implant and to improve biodegradability, curing properties, mechanical strength and injectability. The aims of this paper is to bring a review of the literature concerning chitosan-hydroxyapatite composites for bone restoration, and to mention the main methods of preparation, physico-chemical and biological properties, and tissue engineering techniques using these materials.

En los últimos 20 años se observa una tendencia creciente del desarrollo y empleo de biomateriales para la reparación y regeneración del tejido óseo dañado. Las biocerámicas de fosfatos de calcio han despertado gran interés en el campo de la ortopedia debido a su similitud con el componente mineral del tejido óseo. Estas se han utilizado como gránulos en implantes pequeños que no tengan que soportar cargas, como el oído medio; en recubrimientos sobre metales que las refuercen, como los implantes dentales, los implantes porosos para estimular el crecimiento de un hueso dentro del implante, y los cementos que se implantan en estado pastoso y fraguan in vivo. Los inconvenientes clínicos asociados con las biocerámicas se centran fundamentalmente en la pobre resistencia mecánica y la lenta cinética de reabsorción en comparación con el tejido circundante. Es por ello que los estudios actuales están encaminados a crear nuevas formulaciones compuestas por fosfatos de calcio y biopolímeros, con vistas a evitar la migración frecuente de las partículas biocerámicas del sitio del implante, disminuir la posibilidad de daños a los tejidos blandos próximos al implante, mejorar la biodegradabilidad, las propiedades de fraguado, la resistencia mecánica y la inyectabilidad de los biomateriales. Los objetivo/s de este artículo son ofrecer una revisión de la información actualizada sobre materiales compuestos (composites) de hidroxiapatita y quitosana como sistemas soporte del tejido óseo; mencionar los principales métodos de preparación, las propiedades físico-químicas y biológicas, y las técnicas de ingeniería de tejidos que utilizan estos materiales.

Caracterización de la respuesta immune generada por administración intramuscular de los antígenos de superficie y nucleocápsida del virus de la Hepatitis B

Multiple immunization studies have been carried out in mice and humans evaluating formulations based on the surface antigen of Hepatitis B virus (HBV) in combination with different adjuvants. Such studies explore the use of new vaccine candidates for the prevention or therapy of hepatitis B infection. We have previously reported the preclinical and clinical development of a novel nasal formulation containing the surface and nucleocapsid antigens of the HBV. The present work explores the immune response elicited in mice when this formulation was administered adsorbed in alum by intramuscular route. Mice were immunized with different antigenic proportions and the immune response was evaluated by ELISA in order to study the total IgG and the main IgG subclasses in sera. The lymphoproliferation capacity of spleen cells stimulated with each antigen was assayed. The results indicate that the formulation is very immunogenic when administered by intramuscular route, eliciting potent humoral immune responses. We also demonstrated that the inclusion of the nucleocapsid antigen in the formulation favored a deviation to a Th1 pattern of response, showed at IgG subclasses and lymphoproliferation results. The evaluation of this candidate using the parenteral route suggests the potential reduction of the number of doses and the quantity of antigen per dose with respect to the conventional HBV vaccine. The possible use of this formulation as prophylactic or therapeutic vaccine candidates was also discussed.

Múltiples estudios de inmunización se han llevado a cabo, tanto en ratones como en humanos, evaluando formulaciones basadas en el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (VHB) en combinación con diferentes adyuvantes. Estos estudios exploran el empleo de nuevos candidatos vacunales en la prevención o terapéutica de la infección por hepatitis B. Nuestro grupo ha reportado previamente el desarrollo preclínico y clínico de una novedosa formulación para uso nasal que contiene los antígenos de la superficie y nucleocápsida del VHB. El presente trabajo estudia la respuesta inmune generada en ratones cuando dicha formulación es administrada adyuvada en alúmina por la ruta intramuscular. Con este objetivo se inmunizaron ratones con diferentes proporciones de antígenos y la respuesta de anticuerpos IgG y subclases de IgG inducida en suero se evaluó por ELISA. Adicionalmente se midió la capacidad de linfoproliferación de esplenocitos estimulados con cada antígeno. Los resultados obtenidos indican que la formulación administrada por ruta intramuscular es muy inmunogénica, generando una potente respuesta humoral. Además se demuestra que la inclusión en la formulación del antígeno de la nucleocápsida favorece la desviación hacia un patrón de respuesta Th1, lo cual se muestra a nivel de las respuestas de subclases de IgG y linfoproliferación. La evaluación de este candidato por la ruta parenteral sugiere una potencial reducción del número de dosis, así como la cantidad de antígeno por dosis con respecto a la vacuna anti-VHB convencional. Adicionalmente se discute el posible empleo de esta formulación como candidato vacunal profiláctico o terapéutico.

Procedimiento para la pesquisa de levaduras y bacterias fermentadoras de fructoligosacáridos basado en cambios de pH del medio

Symbiotic, a combination of short chains-carbohydrates with prebiotic properties e.g. fructooligosaccharides (FOS) and biotherapeutical microorganisms, provides positive health effects and well-being in humans and animals. However; the lack of accurate screening methods hampers the possibility to get new fructo-oligosaccharides (FOS)-fermenting yeast or bacterial strains to design potential symbiotic combinations useful for health and food industries. A valuable screening procedure to visually evaluate pure cultures of bacterial and yeast strains able to ferment FOS in liquid or solid rich media supplemented with a pH indicator is described. Using this procedure, 15 FOS-consuming strains isolated from different sources were successfully assayed using this method. This screening procedure is a useful tool in rapid large-scale detection of potential FOS fermenting-strains.

Los simbióticos, combinación de carbohidratos de cadenas cortas con propiedades prebióticas e.g. fructooligosacáridos (FOS) con microorganismos bioterapéuticos, proporcionan efectos positivos a la salud de humanos y animales. Sin embargo, la carencia de métodos de pesquisa obstaculiza la detección de nuevas cepas de levadura y bacterias capaces de fermentar FOS para el diseño de nuevos simbióticos con aplicación en la salud animal y humana así como en la industria alimenticia. En este trabajo se describe un valioso procedimiento de pesquisa de cultivos puros de cepas de levaduras y bacterias capaces de fermentar FOS utilizando medios ricos sólidos o líquidos suplementados con un indicador de pH. Utilizando el método propuesto se evaluó satisfactoriamente la capacidad de fermentar FOS de 15 cepas aisladas de diferentes fuentes. Este procedimiento de pesquisa resulta una importante herramienta en la detección rápida de cepas con capacidad potencial para fermentar FOS.

La fibrinolisis con estreptoquinasa recombinante afecta el valor pronóstico de la troponina I cardiaca en el infarto miocárdico agudo: 10 días de seguimiento evolutivo

The objective of this multicentre study was to identify the concentrations of cardiac troponin I having a higher probability of cardiovascular and extracardiovascular complications in patients with acute myocardial infarction that were treated with or without fibrinolysis at the intensive care units. These patients were followed for 10 days and divided into two prognostic groups: one without complications (n = 53) and other with clinical complications (n = 28). The plasma extracted from 3 h to 72 h after the onset of symptoms was retrospectively evaluated in an enzyme linked immunoadsorbent assay amplified with streptavidin-biotin for quantifying cardiac troponin I. About 45% of the patients had received recombinant streptokinase for fibrinolysis, from the onset of the symptoms and up to 6 hours. In the fibrinolysis group (n = 32), the concentrations of cardiac troponin I of complicated patients were similar to uncomplicated patients. Cardiac troponin I concentrations in patients without fibrinolysis (n = 49) were higher in complicated than in non-complicated patients (W = 287, p = 0.016). The biological activities of other cardiac biomarkers in complicated patients were as high as in uncomplicated patients treated with or without fibrinolysis. The concentration of cardiac troponin I of 2 ng/mL or higher, was a good predictor of the risk of clinical complications in patients without fibrinolysis (odds ratio: 6.6; 95% confidence interval: 1.5-29.4). In the infarction patients without therapeutic fibrinolysis, cardiac troponin I concentrations could be used to stratify them at the intensive care units and may be evaluated as an indicator of fibrinolysis in other studies.

El objetivo de este estudio multicéntrico fue identificar las concentraciones de troponina I cardiaca con mayor probabilidades de complicaciones cardiovasculares y extracardiovasculares en los pacientes con infarto miocárdico agudo que fueron tratados con o sin fibrinolisis en las unidades de cuidados intensivos. Estos pacientes fueron seguidos clínicamente por 10 días y divididos en dos grupos: no complicado (n = 53) y complicado (n = 28). Los plasmas extraídos de los pacientes desde las 3 horas a las 72 horas de inicio de los síntomas fueron retrospectivamente evaluados en un análisis inmunoenzimático en fase sólida amplificado con estreptavidina-biotina para cuantificar troponina I cardiaca. Alrededor del 45% de los pacientes estudiados recibieron fibrinolisis con estreptoquinasa recombinante desde el inicio de los síntomas a 6 horas de evolución. Con la fibrinolisis (n = 32), los pacientes complicados tuvieron las concentraciones de troponina I cardiaca similares a los no complicados. Cuando no se indicó la fibrinolisis (n = 49), los pacientes complicados presentaron mayores concentraciones de troponina I cardiaca que los no complicados (W = 287, p = 0.016). Las actividades biológicas de otros biomarcadores cardiacos fueron similares entre los pacientes complicados y no complicados en el tratamiento con o sin fibrinolisis. La concentración de troponina I cardiaca mayor o igual a 2 ng/ mL fue un buen predictor de riesgos de complicaciones clínicas en los pacientes sin fibrinolisis (razón de productos cruzados: 6.6; intervalo de confianza de 95%: 1.5-29.4). Los pacientes con infarto miocárdico agudo tratados sin fibrinolisis pudieran ser mejor estratificados por riesgos de complicaciones mediante la determinación de las concentraciones de troponina I cardiaca. Este biomarcador pudiera ser evaluado como indicador de fibrinolisis en estudios posteriores.

Estudio serológico de agentes asociados con el síndrome respiratorio crónico en gallinas ponedoras

In order to evaluate the serological response to agents associated to chronic respiratory syndrome in poultry, 120 White Leghorn replacement layers, having received all the vaccines of the immunization program currently applied in Cuba, were selected and sampled monthly from the 12th to the 50th week of age. The samples were assayed for antibodies against Mycoplasma gallisepticum (by fast serum plate agglutination), Ornithobacterium rhinotracheale and Avian Infectious Bronchitis Virus (by ELISA), and Newcastle Disease Virus (by hemagglutination inhibition assay, HIA); comparing the proportion of birds positive to Mycoplasma gallisepticum, Ornithobacterium rhinotracheale, or with HIA titers higher than 1/8, and performing an analysis of variance for the geometric means of the antibody titers against the Avian Infectious Bronchitis Virus at p < 0.05 for statistical significance, as implemented in the Comprop-1 and Statgraphics Plus 5.1 statistical software packages. The results corroborated the presence of M. gallisepticum and provided the first evidence of positive reactions to O. rhinotracheale in laying hens with chronic respiratory syndrome. The serological kinetics of the bird population vaccinated against avian infectious bronchitis evidenced a second seroconversion event, probably due to the circulation of this infectious agent. No serological responses against Newcastle Disease Virus were detected. Further studies for the isolation and characterization of different O. rhinotracheale serovars from laying hens with chronic respiratory syndrome are required.

Para evaluar la respuesta serológica de agentes asociados al síndrome respiratorio crónico de las aves, se seleccionaron 120 pollonas de reemplazo de ponedoras, de la raza White Leghorn, que habían recibido todas las vacunas de acuerdo con el programa de inmunización vigente en Cuba. Desde las 12 hasta las 50 semanas de edad, mensualmente se muestrearon estas aves. Las muestras se evaluaron para la detección de anticuerpos contra Mycoplasma gallisepticum (mediante seroaglutinación rápida en placa) y Ornithobacterium rhinotracheale, contra el virus de la bronquitis infecciosa aviar (mediante ELISA) y el virus de la enfermedad de Newcastle (mediante la inhibición de la hemoaglutinación IHA). Se compararon proporciones de aves positivas a Mycoplasma gallisepticum, a Ornithobacterium rhinotracheale, y aves reactoras con títulos de la IHA superiores a 1/8, y se hizo un análisis de varianza simple para las medias geométricas de los títulos de anticuerpos contra bronquitis infecciosa aviar. Los niveles de significación en ambos análisis fueron de p < 0.05, apoyados en los paquetes estadísticos Comprop-1 y Statgraphics Plus 5.1. Los resultados corroboraron la presencia de Mycoplasma gallisepticum, observándose reacciones positivas a O. rhinotracheale por primera vez en gallinas ponedoras afectadas por el síndrome respiratorio crónico. La cinética serológica en la población de aves vacunadas contra la bronquitis infecciosa aviar mostró una segunda seroconversión, posiblemente relacionada con la circulación del agente. No se evidenció respuesta serológica a la infección con la enfermedad de Newcastle. Se debe continuar el estudio de aislamiento y caracterización de los diferentes serovares de O. rhinotracheale en gallinas ponedoras afectadas por el síndrome respiratorio crónico.

**Genetic resources and breeding of guava (Psidium guajava L.) in Cuba**

In this document, research on genetic resources and breeding in guava during the last 50 years in Cuba is included. The morph-agronomic characterization of 395 accessions and a catalogue with 18 of them, together with a new illustrated descriptor with more than 70 descriptors are offered. The discrimination power and information on morph-agronomic characters and AFLP and SSR as dominant and co-dominant molecular markers respectively were compared. The use of discrimination power (D) for morph-agronomic characters facilitated the key elaboration to distinguish among genotypes. Also, the effectiveness of AFLP for discrimination (D j= 0.991) and SSR for diversity estimation (Hep = 0.60) was determined. The selection of "Enana Roja Cubana", (Red Cuban Dwarf) and EEA 1-23 cultivars due to their low size and high yield is documented. The combination of morph-agronomic characterization and diversity analysis was effective to design conservation strategies, to establish a crossing program, to increase the current cultivar composition and to develop genetic linkage maps. An integrated map from "Enana Roja Cubana" x N6 cross was constructed using AFLP and SSR molecular markers. The eleven linkage groups and 50 quantitative trait loci (QTLs) detected constituted the starting point for gene cloning and the future implementation of marker assisted selection in guava. Moreover, the 176 candidate sequences identified for resistance (RGL) and plant development (MADS-box and HOMEO-box) genes could contribute to linkage map saturation. All these results, along with the use of tissue culture techniques for germplasm conservation and propagation have permitted to propose a methodology to develop a guava breeding program in Cuba.

Demonstration by RNA interference of a new molecular mechanism for resistance to an oomycete in tobacco plants

Oomycetes constitute an important agricultural pathogen for plants of the Solanaceae family. Black shank, caused by Phytophthora parasitica var. nicotianae, is one of the most important diseases affecting tobacco plantations in Cuba and worldwide, constituting an occasional cause of major economic losses. We have constructed a subtractive library with the aim of identifying tobacco genes involved in the resistance to this oomycete. The analysis by realtime PCR confirmed, for the first time, the patterns of differential expression between resistance and susceptibility reactions for the identified genes. This constitutes the first report demonstrating the pattern of expression of the glutathione-S-transferase (GST) gene in varieties and species independently of the degree of resistance or susceptibility to the pathogen. The gene was cloned in a plant transformation vector for gene silencing, and transgenic N. tabacum plants with silenced GST were obtained. They significantly displayed increased resistance to the disease, in highly susceptible plants, in comparison to control plants. This work constitutes the first report on the role of GST as a negative regulator of the defensive response to oomycetes, as well as the first instance where RNA interference technology has ever been used to obtain resistance to diseases produced by Oomycetes.

Distribution and molecular variability of begomoviruses affecting economically important crops in Cuba: epiphytiological element