Biotecnología Aplicada

Particularidades celulares y moleculares del mecanismo de cicatrización en la diabetes

Impaired healing in diabetes affects the resolution of both acute and chronic wounds. The vicious circle between wound chronicity and a deficient control of local infection is the cause that diabetic patients constitute 85% of all non-traumatic lower extremity amputations. From an etiological viewpoint, hyperglycemia is what triggers the onset and progression of biochemical disturbances that lead to systemic complications. In contrast to normal wound healing, physiological apoptotic clearance of inflammatory cells is prevented and the inflammatory phase is abnormally prolonged in diabetic wounds. Pro-inflammatory cytokines as tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) and interleukin-1b (IL-1b) are increased in diabetic wounds with negative local and remote consequences. The etiopathogenic network consisting of inflammatory cytokines, local proteases, reactive oxygen and nitrogen species produces a cytotoxic and pro-degradation environment within the wound bed that impairs granulation and re-epithelialization. The nonenzymatic glycation of proteins, generating advanced glycation end-products (AGE), acts as an active pathogenic stream affecting healing. The accumulation of AGE interferes with DNA replication, cell anchoring, migration and proliferation. The binding of AGE to a receptor model (RAGE) may completely hamper the healing process. Diabetes impairs the recruitment and differentiation of bone marrow-derived stem cells, thereby limiting the availability of tissue repair cells. Re-epithelialization is also hindered by incomplete activation and/or differentiation of keratinocytes that impair migration. Novel and revolutionary pharmacological interventions are urgently needed to reduce diabetes complications, such as amputations of the lower extremities.

El deterioro de la cicatrización en la diabetes afecta la resolución tanto de heridas agudas como crónicas. Se establece un círculo vicioso interamplificativo entre el fenotipo crónico y el control deficiente de la infección, que determina que el 85% de todas las amputaciones no traumáticas de miembros inferiores se practiquen en individuos diabéticos. La hiperglicemia es el detonador etiopatogénico proximal en el inicio y progresión de los desórdenes bioquímicos que dan lugar a las complicaciones sistémicas. Contrario a lo que ocurre durante la cicatrización normal, la eliminación apoptótica fisiológica de las células inflamatorias se detiene, lo que provoca un anormal estancamiento de la fase inflamatoria en las heridas diabéticas. En estas, además existe una sobre-expresión de citocinas pro-inflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (del inglés, TNF-a) y la interleucina-1b (IL-1b), lo que trae consigo consecuencias deletéreas de impacto local y remoto. La red etiopatogénica de citocinas inflamatorias, proteasas locales, especies reactivas al nitrógeno y al oxígeno, propician un ambiente citotóxico y pro-degradativo en el lecho de la herida, que perjudica la granulación y re-epitelización. La glicosilación no enzimática de proteínas persiste como un ingrediente patogénico activo en el deterioro del proceso de cicatrización. La acumulación anormal de productos glicosilados interfiere con la replicación del ADN, el anclaje, la migración y la proliferación celular. La diabetes afecta la liberación, el reclutamiento y la diferenciación de las células madre derivadas de médula ósea, lo que limita la disponibilidad de estas células para reparar el tejido. La re-epitelización también se altera debido a la activación y/o diferenciación incompleta de los queratinocitos, lo cual obstruye su migración. Se necesitan de forma urgente abordajes farmacológicos novedosos y revolucionarios para reducir las diversas complicaciones de la diabetes, tales como la temida amputación de miembros inferiores.

La quitina y sus derivados, biopolímeros con potencialidades de aplicación agrícola

Chitin is a biodegradable polymer widely spread in nature. It is mainly obtained form crustacean shells. Chitin and its derivatives have shown to be effective in controlling plagues and plants diseases. Their mechanism of action is strongly linked to their chemical structures. These mechanisms can result from the direct action on the pathogen or can be a consequence of its capacity to induce defensive mechanisms on plants. In any case, the effect is their protection against various vegetable diseases, before and after harvest. The addition of chitin and its derivatives to the soil favours the growth and activity of many chitinolytic organisms that constitute biological controls and are natural enemies of many agents responsible for vegetable plagues and diseases, generating a synergistic effect. On the other side, these biopolymers also favour the growth and development of beneficial microorganisms that establish synergistic relationships with plants, such a as mycorrhizas or Rhizobium species. On top of that, increasing the microbial population and activity in the soil improves the properties of nutrients and their availability. As growth regulators, it has been established that these biopolymers accelerate seeds germination, the ability of plants to grow as well as the agricultural yield. It is concluded that chitin and its derivatives have great potential for applications in agriculture. It is foreseen that in the future these biopolymers will be used in greater extension, mainly for substituting actual chemical pesticides or as growth regulators.

La quitina es un polímero biodegradable muy abundante en la naturaleza, que se obtiene fundamentalmente del exoesqueleto de los crustáceos, y del que mucho se ha escrito por sus potencialidades de aplicación en la agricultura. Ella y sus derivados son efectivos en el control de enfermedades y plagas vegetales. Sus mecanismos de acción están vinculados a su estructura química. Pueden actuar sobre el organismo patógeno, o inducir mecanismos defensivos en las plantas, contra varias enfermedades vegetales antes y después de la cosecha. La adición de quitina y sus derivados al suelo, favorece el crecimiento y la actividad de muchos organismos quitinolíticos, por un efecto sinérgico. Estos constituyen controles biológicos y enemigos naturales de muchos agentes causales de enfermedades y plagas vegetales. Además, favorecen el crecimiento y desarrollo de microorganismos beneficiosos que establecen relaciones simbióticas con las plantas, tales como las micorrizas o especies del género Rhizobium. A su vez, incrementan la población y la actividad microbiana en el suelo, lo que mejora la disposición de nutrientes y sus propiedades. Como reguladores del crecimiento, aceleran la germinación de las semillas, el vigor de las plantas, y el rendimiento agrícola. Por tanto, por su gran potencial de aplicación en la agricultura, se augura que se utilizarán con una mayor extensión, principalmente como sustitutos de los actuales plaguicidas químicos o como reguladores del crecimiento de las plantas.

Evidencia inicial de la seguridad y el efecto clínico del supositorio de estreptoquinasa recombinante en la enfermedad hemorroidal aguda. Estudio piloto, abierto, de prueba de concepto

A proof-of-concept, pilot clinical trial was carried out in 2 hospitals, to evaluate the safety of recombinant streptokinase (rSK) administered by the rectal route in patients with acute hemorrhoidal disease (AHD). Suppositories containing 200 000 IU rSK were given every 6 hours, up to 4 applications. The patients, after discharge, were seen daily in follow-up visits up to 10 days. Symptoms, lesion size, edema and inflammation were evaluated. Ten patients were included. The rSK suppository was safe and tolerable. The adverse events reported were minimal (only ardor and anal itching in only one patient), both with minor intensity which did not require treatment, and with low causality relationship of the product since they could be explained by the underlying disease as well. Symptoms disappeared at 24 hours in 7 patients. Complete recovery was achieved in most of the patients (90%) in 5 days. Only one patient needed surgical thrombectomy. rSK suppositories are safe and showed initial efficacy data. It could become a new therapeutic option for hemorrhoidal crisis if results are confirmed in further and controlled studies.

Se realizó un ensayo clínico piloto, prueba de concepto en 2 hospitales, con el objetivo primario de evaluar la seguridad de la estreptoquinasa recombinante administrada por vía rectal en pacientes con enfermedad hemorroidal aguda. Se administraron 4 supositorios de 200 000 IU de rSK distribuidos cada 6 horas. Los pacientes, tras el alta, fueron vistos a diario (en las visitas de seguimiento) hasta 10 días. Se evaluaron los síntomas, el tamaño de la lesión, el edema y la inflamación. Diez pacientes fueron incluidos. El supositorio de rSK fue seguro y tolerable. Fueron mínimos los eventos adversos reportados (sólo ardor y prurito anal en un solo paciente), ambos de intensidad leve, que cedieron espontáneamente y con baja relación de causalidad con el producto objeto de estudio. Los síntomas desaparecieron a las 24 horas en 7 pacientes. Se obtuvo respuesta completa en la mayoría de los pacientes (90%) a los 5 días. Sólo un paciente requirió trombectomía. Los supositorios de rSK son seguros y muestran datos iniciales de eficacia. Podría convertirse en una nueva opción terapéutica para la crisis hemorroidal si los resultados se confirman en sucesivos estudios, controlados, en un mayor número de pacientes.

Variación de la expresión de factores neurotroficos en células del estroma de medula ósea en ratas según el numero de paso del cultivo

Bone marrow stromal cells (BMSC) are multipotent stem cells and are considered good candidates for cell restoration in injured brain tissue. The aim of this study is to learn if rat BMSC express brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and glia-derived nerve factor (GDNF) and determine if this expression varies according to the number of culture passages. The presence of BDNF and GDNF mRNA was determined by RT-PCR and protein expression was evaluated by Western Blot. GDNF production in individual cells in the culture was analyzed by Immunocytochemistry. Our results indicated that rat BMSC produce BDNF, at least until passage number 12. Nevertheless, GDNF production only takes place at passages 7 and 12; In conclusion, the expression of BDNF and GDNF by BMSC varies according to their mature state; both neurotrophic factors only are present after passage 7 which should be taken into account for their utilization as a therapeutic option of neurodegenerative diseases.

Las células estromales de la medula ósea (CEMO) son células madre multipotentes y se consideran un buen candidato para la restauración celular del tejido cerebral dañado. El objetivo de este trabajo consistió en demostrar si las CEMO expresan los factores neurotróficos derivados de cerebro y de línea de células gliales (BDNF y GDNF, respectivamente) y determinar si esta expresión varía en relación con el número de pases en cultivo. La presencia del ARNm para BDNF y GDNF se determinó mediante RT-PCR y la expresión de la proteína se evaluó por Western Blot. La producción de GDNF por las células individuales en cultivo se analizó mediante Inmunocitoquímica. Nuestros resultados demostraron que las CEMO de rata producen BDNF, al menos hasta el pase 12. Sin embargo, la producción de GDNF solo tuvo lugar en los pases 7 y 12. En conclusión, la expresión de BDNF y GDNF por las CEMO varía en relación con su estado de maduración; sólo a partir del pase 7 están presentes ambos factores lo que debe tenerse en cuenta para la utilización de estas como opción terapéutica en enfermedades neurodegenerativas.

Factores que influyen en la adsorción del extracto alergénico del Dermatophagoides siboney en adyuvantes que contienen aluminio

Allergen-specific immunotherapy consists in periodic administration of allergen vaccines, particularly from House Dust Mites (HDM), for desensitization and amelioration of allergic symptoms. The mite Dermatophagoides siboney has been commonly found in house dust in the Caribbean and it is associated to allergic asthma. In order to obtain a HDM vaccine containing aluminum adjuvant that can satisfy the requirements of consistency and immunogenicity, a lyophilized allergen extract of D. siboney was adsorbed into aluminum hydroxide (AH) and aluminum phosphate (AP) gels, aiming to establish the parameters that determine the highest adsorption capacity. Allergen adsorption was measured by total protein assays and by Der s 1 allergen-specific MAb-ELISA. Immunological potency was assessed in BALB/c mice. The results showed that AH had better adsorption capacity when compared to AP. The best adsorption conditions using AH were: 0.9% NaCl at pH 8 in 30 min. Sodium phosphate - buffered solution had negative effect to the allergen adsorption into AH, when used during the process or added later. The within-batch consistency of the adsorption process in the absence of buffer was demonstrated as well as the immunogenicity of this formulation, regarding induction of allergen-specific IgG antibodies.

La inmunoterapia alergeno específica consiste en la administración periódica de vacunas alergénicas, particularmente del Ácaro del Polvo Casero (HDM), para la insensibilización y disminución de los síntomas alérgicos. El ácaro Dermatophagoides siboney se encuentra comúnmente en el polvo de las casas en el Caribe y se asocia con el asma alérgica. El extracto alergénico liofilizado de D. siboney se adsorbió en geles de hidróxido de aluminio (AH) y fosfato de aluminio (AP), con el fin de obtener una vacuna de HDM conteniendo aluminio que satisfaga los requerimientos de consistencia e inmunogenicidad y así establecer los parámetros que determinan una mayor capacidad de adsorción. La adsorción del alergeno se midió por el ensayo de proteínas totales y por un MAb-ELISA alergeno específico para Der s 1. La potencia inmunológica se evaluó en ratones BALB/c. Los resultados mostraron que el AH tiene una mayor capacidad de adsorción comparada con la del AP. Las mejores condiciones de adsorción usando AH fueron: 0.9% NaCl a pH 8 en 30 minutos. La solución tampón de fosfato de sodio tuvo un efecto negativo en la adsorción en AH, tanto añadida durante el proceso o al final del mismo. La consistencia entre lotes del proceso de adsorción en ausencia del tampón fue demostrada, así como la inmunogenicidad de esta formulación referida a la inducción de anticuerpos IgG alergeno específico.

Pesquisaje de la enfermedad celiaca en un grupo de niños cubanos sanos de la provincia de Pinar del Río

Recent studies suggest that celiac disease is common in many developing countries. Taking into account the disease may be underdiagnosed in Cuba, the main objectives of this study were to assess the presence of celiac disease related to antibodies in a cohort of apparently healthy children from Pinar del Río province and to evaluate a new rapid test for detecting celiac disease antibody in blood, serum and plasma samples. A total of 595 apparently healthy children with no record of first degree relatives suffering from celiac disease, were screened for Tissue transglutaminase antibodies by one-step immunochromatographic. The results were compared with commercials ELISA kits. In the study seven subjects (1.18%) were identified as positive by immunochomatographic assay and by Celikey IgG Antibody Assay with a 100% of concordance and only five subjects (0.84%) by Celikey IgA Antibody Assay. The achievement of the intestinal biopsy was offered to all positive individuals. This study demonstrates that one-step immunochromatographic assay is an appropriate tool to detect celiac disease-associated to antibodies and provides further evidence of the prevalence of possible undiagnosed celiac disease among healthy children in Cuba.

Estudios recientes sugieren que la enfermedad celíaca es común en muchos países en desarrollo. Debido a que en Cuba existe un subregistro en el diagnóstico de esta enfermedad, el principal objetivo de este estudio fue determinar la presencia de anticuerpos asociados a la enfermedad celiaca en un grupo de niños aparentemente sanos de la provincia de Pinar del Río y además evaluar una nueva prueba de diagnóstico rápido para la detección de anticuerpos anti-transglutaminasa en sangre suero y plasma. Se estudiaron un total de 595 niños aparentemente sanos que no tenían antecedentes de familiares de primer gado con enfermedad celiaca, a todos se les realizó determinación de anticuerpos anti-transglutaminasa con un ensayo inmunocromatográfico de un solo paso. Los resultados se compararon con sistemas comerciales tipo ELISA. En el estudio 7 individuos (1.18%) fueron identificados como positivos tanto por el ensayo inmunocromatográfico como por el ensayo ELISA Celikey de detección de anticuerpos IgG para un 100% de concordancia y solo 5 sujetos (0.84%) resultaron positivos para el ELISA Celikey de detección de anticuerpos IgA. A todos los individuos que resultaron positivos por cualquiera de los tres ensayos, se les ofreció la realización de la biopsia intestinal. Este estudio demuestra el valor del ensayo inmunocromatográfico de un solo paso como una herramienta útil para la detección de anticuerpos asociados a la enfermedad celiaca y nos proporciona una prueba más de la posible prevalencia de enfermedad celiaca no diagnosticada en niños sanos en Cuba.

Calidad de la muestra y niveles de fenilalanina y 17-hidroxiprogesterona en pesquisa neonatal

Quality of the sample and phenylalanine and 17-hydroxyprogesterone levels in neonatal screening. In the programs for neonatal screening many different analytes are quantified from dried blood on filter paper cards. Several factors affect the quality of the samples invalidating their employment in the laboratory: inadequate collection procedures, quality of the filter paper, the drying, storage and transportation under extreme environmental conditions. This article aims to show how the quality of the sample collection influences the phenylalanine (Phe) and 17-hydroxyprogesterone (17-OHP) levels. As such, samples of newborns on filter paper from Ramon Gonzalez Coro Hospital were collected and analyzed.The blood spots from a sample were classified according to their appearance, satisfactory spot (MV) or unsatisfactory spot (MNV). Phe and 17OHP levels were determinated by UMTEST PKU and UMELISA 17OH Progesterone NEONATAL, respectively. 19.5% of 3043 newborns samples exhibited unsatisfactory spots. Concordance correlations studies between MV y MNV showed the precision and accuracy were affected by quality of the samples. False positive and negative values (with concerning control sample) were detected from samples with MNV. The correct application of collection procedures for samples is essential in obtaining reliable results in screening neonatal laboratories.

En los programas de pesquisa neonatal, diferentes analitos son cuantificados en muestras de sangre de recién nacidos, impregnadas sobre papel de filtro. Varios factores pueden afectar la calidad de las muestras e invalidar su empleo en el laboratorio: procedimientos inadecuados en la colecta, calidad del papel de filtro y procesos de secado, almacenamiento y transportación bajo condiciones ambientales extremas. Para documentar la influencia de la calidad de la muestra sobre los niveles de fenilalanina y 17-hidroxiprogesterona en manchas de sangre seca sobre papel de filtro, se analizaron muestras de recién nacidos provenientes del Hospital Materno-Infantil "Ramón González Coro". Las manchas provenientes de una misma muestra se clasificaron según su apariencia, en válidas o "no válidas". Los niveles de fenilalanina y 17- hidroxiprogesterona se determinaron mediante el empleo de UMTEST PKU y UMELISA 17OH Progesterona NEONATAL, respectivamente. De 3 043 muestras analizadas, el 19.5% presentó manchas con características "no válidas". Los estudios de concordancia de la correlación entre ellas, mostraron que la calidad de la muestra afectó la precisión y la exactitud de los niveles de fenilalanina y 17-hidroxiprogesterona en sangre seca. En las muestras con características "no válidas" fueron detectados resultados discordantes, con valores falsos positivos o negativos con respecto a la muestra control. La aplicación correcta de los procedimientos de colecta de las muestras de pesquisa neonatal es esencial para la obtención de resultados confiables en los laboratorios.

Chitosans as bioactive macromolecules to protect conomically relevant crops from their main pathogens

Studies were carried out as part of the Agriculture Biotechnology program, to prepare and characterize chemically and biologically different chitosans obtained from Cuban lobster chitin. Chitosan polymers were subjected to acid and enzymatic hydrolysis by using low·cost commercial enzymatic preparations, and the resulting oligosaccharide mixtures were further characterized. Their potential antimicrobial activities were also evaluated versus fungi and oomycetes, also testing their ability to induce defensive and protective responses in tobacco and rice plants against two economically relevant pests, Phytophthora nicotianae and Pyricularia grisea, respectively. With the aid of international collaboration, different oligochitosans mixtures were compared for activating defensive responses in suspension cultures of Arabidopsis thaliana cells. These results bring knowledge on the physical·chemical properties of the chitosans obtained, such as molar mass and acetylation grade, and their influence on activating defensive responses, the inhibition of growth in pathogens and the induction of resistance in tobacco and rice plants. Some of these chitosan derivatives were selected as possible active components to protect both type of cultivars, being applied at field·scale to evaluate their effects for the main natural pathogens and bringing very promising results. This research allowed us to establish a methodology for preparing oligochitosans, and results shown inhere were part of BSc, MSc and PhD theses, and were also published in more than 20 scientific papers and presented in more than 40 scientific conferences.

Novel protease inhibitors active against human neutrophil elastase and plasma kallikrein with therapeutic potentialities: Structure-function relationships

Two new protease inhibitors (PIs), CmPI-II and AdKI were purified and characterized from mollusks Cenchritis muricatus and Aplysia dactylomela, respectively. They showed different specificities, CmPI-II for human neutrophil elastase (HNE) and AdKI for human plasma kallikrein (HPK). Purification procedures were established, rendering good yields and high purification degree. CmPI-II (UNIPROT: P84755) is a 5480 Da polypeptide of three disulphide bridges belong to the "non-classical"Kazal-type inhibitors. A new group was proposed according to the location of the CysI-CysV disulfide bridge. The presence of a basic residue at the inhibitor active site changed the pre-established requirement of a hydrophobic residue for elastase inhibition. The three-dimensional CmPI-II/HNE complex model contributes to explain the CmPI-II specificity for the enzyme. This is the first PI molecule isolated from C. muricatus. On the other hand, AdKI (2.9 kDa polypeptide) is an exception among invertebrate inhibitors in terms of inhibitory strength and selectivity against HPK. A new serine protease, AdSP, was also purified and characterized from the same extract, which could be the target for AdKI. CmPI-II and AdKI are the first inhibitors isolated from the phyllum Mollusca against ENH and HPK, respectively.

Contribution to the phytochemical study and biological activity of plants of Cuban flora

Interest in natural products as a source for innovation in drug discovery and agrochemicals is still growing worldwide. Natural products, whose immense diversity has been appreciated for many years, may become in a rich source of novel chemical structures. Our country is a rich source of both biological and chemical diversity which may be useful as a source of novel chemical structures. Even when natural products have been used as medicinal agents for many years in Cuba, their use as agrochemicals are still limited. Thus, the present review focuses on recent advances in the studies on natural products performed by the "Centro de Estudios de Productos Naturales, CEPN" during the past ten years, highlighting on those with potential use as biomedical and agrochemicals. 15 plant species were studied; Agave brittoniana Trel. Subsp. brachypus A Álvarez de Zayas (Agavaceae); Juniperus barbadensis L. var. Lucayana (Britt.) RP Adams (Cupressaceae); Melia azedarach Linn. (Meliaceae); Tectona grandis Linn. f. (Lamiaceae); Lantana camara Linn. (Verbenaceae); Lantana trifolia Cham. (Verbenaceae); Citrus sinensis (Linn.) Osbeck cv Valencia (Rutaceae); Maytenus buxifolia (A Rich) Griseb (Celastraceae); Maytenus elaeodendroides Griseb (Celastraceae); Maytenus urquiolae B Mory (Celastraceae); Solanum americanum W. Mill (Solanaceae); Thalassia testudinum Kon. (Hydrocharitaceae); Sesbania rostrata Bremek & Oberm (Fabaceae); Pluchea carolinensis G Don (Asteraceae) and Ageratina havanensis (HB & K) RM King & Robinson (Asteraceae). By means of a bio-guided fractionation, isolated structures as well as semi-purified fractions were assayed as antioxidant, antiparasitic, antibiotic, insecticides, antifungal, and skin regenerating and healing effects. The strategy employed allows us to discover novel secondary metabolites with potential for industrial development as pharmaceuticals and/or agrochemicals. Besides, in addition to the goal of discovering new bioactive agents, the presence of unique bioactive compounds notably contribute to increase the knowledge of plant species in Cuba.