Biotecnología Aplicada

Dr. Gustavo Kourí Flores

Biorremediación: una herramienta para el saneamiento de ecosistemas marinos contaminados con petróleo

During the last decades the course of the anthropogenic contamination of marine ecosystems has paralleled that of the oil industry. Spills of crude oil and its derivatives can have short, medium and long-term negative consequences, and the elimination of pollutants by natural means may take years or even longer. Bioremediation is an emergent branch of environmental biotechnology that is often used to accelerate this process and guarantees the reparation of damaged ecosystems, based on harnessing the metabolic capabilities of bacteria, fungi, yeast, algae and microbial mats to degrade oil hydrocarbons. Bioremediation follows two main strategies: the stimulation of indigenous microbial populations, known as biostimulation, and bioaugmentation, the introduction of viable microbial populations. Choosing one or another depends on the analysis of abiotic and biotic factors influencing the biodegradation process; the former refers to factors related with the pollutant and environmental conditions, while the latter encompasses all factors that have to do with microbial populations. The development of bioremediation has led to the appearance of commercially available products for spill cleanup: fertilizers containing biostimulating nutrients, bioproducts based on microorganisms, and chemical products to stimulate the growth of the microbial populations involved in the process of biodegradation.

En las últimas décadas, paralela al desarrollo de la industria petrolera, ha aumentado la contaminación en los ecosistemas marinos. El vertimiento de petróleo crudo y sus derivados provocan efectos negativos a corto, mediano y largo plazo. La eliminación natural de los contaminantes puede tardar años, e incluso no ocurrir. Para acelerar este proceso y garantizar la reparación del ecosistema dañado, se emplean técnicas de biorremediación. Esta variante emergente de la biotecnología ambiental, se basa en el empleo de la actividad metabólica microbiana (bacterias, hongos, levaduras, algas y tapetes microbianos) para degradar los hidrocarburos del petróleo. Su aplicación tiene dos propósitos esenciales: la bioestimulación de la población autóctona viable, y la bioaumentación (introducción de poblaciones microbianas viables). Su selección requiere el análisis de factores abióticos y bióticos, que influyen en el proceso de biodegradación. Los primeros incluyen los relacionados con el contaminante y las condiciones medioambientales; y los bióticos, lo referente a la población microbiana. En el desarrollo de esta tecnología, se han formulado varios productos comercializables para la limpieza de desastres: fertilizantes construidos por nutrientes con funciones bioestimuladoras; bioproductos conformados por microorganismos; y productos químicos con la función de aumentar o estimular la población microbiana que interviene en el proceso de biodegradación.

Búsqueda de actividad inhibidora de proteasas en extractos de cinco especies de ascidias de las costas cubanas

One of the most promising strategies to counteract malaria is by controlling the infectivity of Plasmodium parasites with drugs aimed against their main targets. The participation of proteases (belonging to different classes) has been demonstrated in its infection mechanism, hence these proteins have become promising targets in treating this illness. This study involved the screening of crude and clarified extracts of five Cuban ascidian species for inhibitory activity of proteases belonging to different mechanistic classes. Ascidians are invertebrates that present many bioactive molecules, but, as yet, only a few protease inhibitors had been isolated from them. In this research we reported for the first time the presence of inhibitory activity of bovine pancreatic carboxypeptidase A and B, aminopeptidase N from porcine kidney and subtilisin A from Bacillus licheniformis in some ascidian extracts tested. The most promising extracts were selected in terms of percentage of inhibition and they were characterized in terms of the behaviour of the extract concentration against residual enzymatic activity; the determination of IC50 values and Specific Inhibitory Activity (SIA), and the evaluation of their proteolytic activity through zymographic assays.

Una de las estrategias más promisorias para contarrestar la malaria es controlar la infectividad del parásito Plasmodium, con fármacos dirigidos hacia sus blancos principales. Se ha demostrado que proteasas (pertenecientes a diferentes clases mecanísticas) participan en el mecanismo de infección, por lo que se han convertido en blancos promisorios para el tratamiento de la enfermedad. En este trabajo se investigaron extractos crudos y clarificados de cinco especies de ascidias cubanas en busca de actividad inhibidora de proteasas pertenecientes a diferentes clases mecanísticas. Las ascidias son animales invertebrados que presentan numerosas moléculas bioactivas, aunque solo unos pocos inhibidores de proteasas han sido aislados a partir de ellas. En esta investigación se informa por primera vez la presencia de actividad inhibidora de carboxipeptidasa A y B pancreática bovina, aminopeptidasa N de riñón porcino y subtilisina A de Bacillus licheniformis en algunos de los extractos de ascidias evaluados. Los extractos más promisorios se caracterizaron con relación al comportamiento de la concentración de extracto en función de la actividad enzimática residual, la determinación de los valores de IC50 y actividad inhibidora específica (SIA), y la evaluación de su actividad proteolítica a través de ensayos zimográficos. Investigaciones actuales se encuentran dirigidas a la purificación y caracterización de estas moléculas.

**Detección de cambios conformacionales y mutaciones en el exón 8 del gen atp7b en pacientes cubanos con la enfermedad de Wilson**

Wilson’s disease is a hereditary disorder of autosomal recessive inheritance that can cause irreversible, potentially lethal lesions to liver and brain. Its molecular cause is the appearance of mutations in the atp7b gene. A total of 379 different disease-producing mutations are currently known, turning the molecular diagnosis of this disorder into a formidable challenge. The present study used single-strand conformational polymorphism for the detection of conformational changes in exon 8 of this gene. Two shifts distinct from the normal allele, denominated b and c, were detected and mapped to mutations L708P and 2304DupC in heterozygosis. Allelic frequencies for these mutations in 72 Cuban Wilson’s disease patients were 2 and 0.7%, respectively.

La enfermedad de Wilson es un trastorno hereditario que se transmite con un patrón de herencia autosómico recesivo. Puede provocar lesiones irreversibles en el hígado y el cerebro, que pueden llevar a la muerte. Su causa molecular son las mutaciones en el gen atp7b con 379 variantes promotoras de la enfermedad. El diagnóstico molecular es complejo. En este estudio se empleó la técnica de polimorfismo conformacional de simple cadena para la determinación de cambios conformacionales en el exón 8 de ese gen. Se detectaron dos cambios distintos de la variante normal, denominados: b y c, los cuales correspondieron a las mutaciones L708P y 2304DupC en estado heterocigótico, respectivamente. Las frecuencias alélicas de tales mutaciones en 72 pacientes cubanos con la enfermedad de Wilson son de 2 y 0.7%, respectivamente.

Análisis de asociación de polimorfismos del gen COMT y la esquizofrenia en una muestra familiar cubana. Resultados preliminares

Schizophrenia is a complex disease affecting as much as 1% of the global population, constituting the target of considerable effort to identify disease susceptibility genes. Several lines of evidence point to the catechol-O-methyltransferase (COMT) gene as a schizophrenia susceptibility candidate, not only because it encodes a key dopamine catabolic enzyme but also because it maps to the velocardiofacial syndrome region of chromosome 22q11, which has long been associated with predisposition to the disease. Several case-control and family-based studies have been conducted to examine the possible association of COMT with this disorder; however, these studies have produced conflicting results. To further assess the genetic contribution of COMT variants to schizophrenia susceptibility, three single-nucleotide polymorphisms (rs2075507, rs4680 and rs362204) were investigated in a sample of 74 family trios from the Cuban population. Restriction fragment length polymorphism was used to identify the allelic variants, employing statistical tools based on transmission disequilibrium tests to find possible associations. In this study, the first of its type performed in the Cuban population, we found an association of rs2075507 and rs362204 at allelic levels with a p < 0.05; also finding an association of haplotype 1-2-1 with the disease.

La esquizofrenia es una enfermedad común y compleja que afecta cerca del 1% de la población mundial, por lo que grandes esfuerzos se llevan a cabo para identificar los genes de susceptibilidad a padecer la misma. Varias líneas de evidencias implican al gen que codifica para la catecol-O-metiltransferasa (COMT), como uno de los genes candidatos que confieren susceptibilidad, no solo porque codifica para una enzima clave en el proceso de degradación de la dopamina, sino también porque está ubicado en la región cromosómica 22q11 implicada en el síndrome de velocardio facial, el cual ha sido ampliamente asociado con la predisposición a padecer la enfermedad. Varios estudios de caso-control y basados en familias han sido realizados para determinar la posible asociación de este gen con la esquizofrenia, pero desafortunadamente los resultados de los mismos han sido contradictorios. Para comprobar la relación del gen COMT con la esquizofrenia, 3 polimorfismos de simples nucleótidos presentes en el gen (rs2075507, rs4680, rs362204), fueron estudiados en una muestra de 74 tríos familiares de la población cubana. Se empleo la técnica de polimorfismos por fragmentos de restricción para el genotipaje y la estadística basada en las pruebas de desequilibrio en la transmisión de alelos para la búsqueda de asociación. En este estudio, el primero de su tipo reportado en la población cubana, encontramos asociación de los marcadores rs2075507 y rs362204 a nivel alélico con un valor de p < 0.05 y de igual forma encontramos una asociación a nivel haplotípico del haplotipo 1-2-1 con la entidad patológica.

Evaluación del daño basal e inducido en el ADN de linfocitos de tres líneas de ratones, mediante el ensayo cometa alcalino

The formation of single-strand breaks and alkali-labile sites on DNA has been extensively used for genotoxicity testing, given its involvement in degenerative disorders, cancer and oxidative stress. An alkaline variation of the single-cell electrophoresis (comet) assay used for the detection of DNA damage was developed during the eighties, providing data on this phenomenon at the level of individual cells for the first time. The present work employs the alkaline comet assay to compare three mouse lines regarding the basal and cyclophosphamide-induced frequency of single-strand breaks and the appearance of alkali-labile sites in DNA from peripheral blood lymphocytes. A total of 10 mice/sex/group of the Balb/c, OF-1 and NMRI lines were treated for 14 days, distributed into an untreated negative control group, two groups receiving excipients and a positive control group receiving intraperitoneal cyclophosphamide at 50 mg/kg. After 14 days, single cells from peripheral blood leukocytes were analyzed by alkaline electrophoresis to estimate DNA damage. It was concluded that the best choice for this type of studies is represented by the Balb/c line, due to its low basal frequency for the analyzed variables. This result indicates that Balb/c may be the best biomodel for preclinical testing of drugs, vaccines and other products.

Las rupturas de simple cadena y la formación de sitios lábiles al álcali en el ADN, son parámetros ampliamente utilizados para la detección de genotoxicidad. Se ha demostrado su implicación en enfermedades degenerativas, en el cáncer, y recientemente, su vínculo con el estrés oxidativo. En la década de 1980 se desarrolló la variante alcalina de la electroforesis de células individuales (ensayo cometa), para la detección de daño en el ADN. Por primera vez se proporcionaron datos en células individuales. Este artículo tuvo como objetivo la comparación de la frecuencia basal e inducida con ciclofosfamida, de las rupturas de simple cadena y la formación sitios lábiles al álcali en el ADN de leucocitos de sangre periférica, mediante el ensayo cometa alcalino, en tres líneas de ratones. Se utilizaron 10 ratones de los dos sexos, de las líneas Balb/c, OF-1 y NMRI. Se formó un grupo control negativo (al que no se no le administró ninguna sustancia), dos grupos controles, a los que se administraron sustancias vehículo, y un grupo control positivo al que se administraron 50 mg/kg de ciclofosfamida por vía intraperitoneal. Pasados 14 días, se realizó la electroforesis alcalina de células individuales en gel de leucocitos de sangre periférica, para demostrar el posible daño en el ADN. Se concluyó que la línea más adecuada para estos estudios es la Balb/c, por la baja frecuencia basal que presentan las variables analizadas. Este resultado indica que puede ser el mejor biomodelo para la evaluación preclínica de drogas, vacunas y otros productos.

Biotechnology Havana 2010: Successful healing of Diabetic Ulcers with Heberprot-P

Last October 20-22nd, 2010 it was celebrated the 2010 edition to the congress Biotechnology Havana (BH2010) organized every year by the Center for Genetic Engineering and Biotechnology. The BH2010 Conference focused on the Integral Care of Diabetic Foot Ulcer Patients with the Use of Heberprot-P. The Congress was attended by 366 delegates from 36 countries. It was organized in two symposia with 6 plenary lectures, 25 lectures and 120 posters. Symposia were focused on the Molecular biology of growth factors, and the Integral Care to Diabetic Foot Ulcers, Current Status, respectively. The BH2010 lectures were given by representatives of 11 countries from the Americas, Europe and Asia, covering the following issues: Epidermal growth factor, its molecular biology and other molecules used to promote wound healing, clinical experience on using Heberprot-P, therapeutic experience in diabetic foot ulcers and organizational strategies in organizing and extending health services to attend DFU patients. It was evident that Heberprot-P emerged as the unique therapy available to successfully cicatrize Wagner 3-4 DFUs in diabetic patients.

Report of the Conference Protection from HIV: Targeted Intervention Strategies; March 20-25, 2011, Canada

Protective immune response against Neisseria meningitidis serogroup B after immunization with peptides mimicking a capsular polysaccharide epitope