Biotecnología Aplicada

Impacto perjudicial del exceso agudo y crónico de glucosa en células involucradas en la cicatrización: fibroblastos, miofibroblastos y células precursoras vasculares

Type 2 diabetes mellitus comprises a group of non-communicable metabolic diseases with an expanding pandemic magnitude. Diabetes predisposes to lower extremities ulceration and impairs the healing process leading to wounds chronification. Diabetes also dismantles innate immunity favoring wound infection. Amputation is therefore acknowledged as one of the disease's complications. Hyperglycemia appears as the proximal detonator of toxic effectors including pro-inflammation, spillover of reactive oxygen and nitrogen species. The systemic accumulation of advanced glycation end-products irreversibly impairs the entire physiology from cells-to-organs. Insulin axis deficiency weakens wounds' anabolism and predisposes to inflammation. These factors converge to hamper fibroblasts and endothelial cells proliferation, migration, homing, secretion and organization of a productive granulation tissue. Diabetic wound bed may turn chronically inflamed, pro-catabolic and a superimposed source of circulating pro-inflammatory cytokines, establishing a self-perpetuating loop. Diabetic toxicity breadth includes mitochondrial damages in fibroblasts and endothelial cells becoming prone to apoptosis thus hindering granulation. Endothelial progenitor cells recruitment and tubulogenesis are also impaired. Failure of wound re-epithelialization remains as a clinical challenge while it appears to be biologically multifactorial. Novel medical interventions as the local intra-ulcer infiltration of epidermal growth factor have emerged to hopefully reduce the current worldwide amputation rates.

La diabetes mellitus tipo 2 implica desórdenes metabólicos no transmisibles, cuya incidencia va en aumento, con una extensión casi pandémica. Predispone a padecer úlceras en las extremidades inferiores y a su cronicidad, al afectar el proceso de cicatrización. También interfiere la inmunidad innata, lo que favorece la infección de posibles lesiones, y puede conducir a la amputación. La hiperglucemia desencadena los efectores tóxicos que incluyen la inflamación y la producción en exceso de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. Los productos finales altamente glicosilados, que se acumulan sistemáticamente, desarticulan la estructura de células y órganos. La deficiencia en el eje insulínico debilita el anabolismo en las lesiones y predispone a la inflamación. Estos factores convergen y debilitan la proliferación, la migración, el direccionamiento, la secreción y la organización de los fibroblastos y células endoteliales, lo que interfiere en la formación de tejido de granulación útil. El lecho de las heridas puede convertirse en una fuente inflamatoria y procatabólica de citocinas, y constituir un ciclo de perpetuación. La toxicidad diabética provoca daños mitocondriales en los fibroblastos y las células endoteliales, que los hace susceptibles de apoptosis y dificulta la granulación del tejido. También afecta el reclutamiento de las células progenitoras endoteliales, e impide la tubulogénesis. La regeneración del tejido epitelial en las lesiones sigue siendo un desafío clínico que depende de múltiples factores biológicos. Nuevas intervenciones médicas, como la infiltración local intralesional del factor de crecimiento epidérmico recombinante, prometen la reducción de las tasas mundiales de amputación.

Hallazgos histopatológicos en gallinas ponedoras afectadas por el virus de la bronquitis infecciosa aviar

In order to dissect the histopathological changes produced by the infection of avian infectious bronchitis virus in previously vaccinated egg-laying hens from a poultry farming unit, 35 White Leghorn egg-laying hens that had been in production for 9 to 10 months (twenty seven of which had clinical symptoms corresponding to respiratory disease and eight apparently healthy individuals) were selected for further study. After clinical examination and necropsy, they were classified into apparently healthy, mild, moderate or severe according to the severity of the clinical-pathological process. Samples were taken from paranasal sinuses, trachea and lungs for histopathological study, and trachea-lung pools were prepared from four individuals for virus isolation and molecular biology assays. The presence of mucus was evidenced with Schiff’™s non-enzymatic histochemical staining, and histomorphometric analyses were used to estimate the number of glands in the tracheal mucosa. The proportions of histopathological lesions were compared, using one-way Anova to determine gland loss at the tracheae with a significance level of p < 0.05 in both cases. Histopathological analysis of the epithelia of paranasal sinuses, trachea and bronchia revealed the presence of epithelial erosion, mucous exudate and hyperplasia of mucosa-associated lymphoid tissue. Glandular cysts were observed at the paranasal sinuses, and epithelial metaplasia was detected in the trachea. It was possible to isolate and identify infectious bronchitis coronavirus from the original samples and from samples passaged in chicken embryos.

Con el objetivo de determinar los cambios histopatológicos causados por el virus de bronquitis infecciosa aviar en gallinas ponedoras vacunadas, afectadas con síndrome respiratorio crónico, en una unidad avícola, se seleccionaron 35 gallinas White Leghorn, entre 9 y 10 meses de postura (27 con diagnóstico clínico presuntivo de enfermedad respiratoria y ocho sin alteraciones aparentes. Se les realizó el examen clínico y la necropsia, y se clasificaron en cuatro grupos según el proceso clínico-patológico: leve, moderado, severo y control sano. Se tomaron muestras de los senos paranasales, la tráquea y los pulmones (histopatología) y mezclas de muestras de tráquea-pulmón, de tres y cuatro aves para el aislamiento del coronavirus de la bronquitis infecciosa y el análisis de biología molecular, respectivamente. Se aplicó la técnica histoquímica no enzimática del ácido periódico de Schiff, para demostrar la presencia de moco; y se cuantificaron las glándulas de la mucosa de la tráquea (histomorfometría). Se compararon las proporciones de las lesiones histopatológicas y se hizo un análisis de varianza de una vía para determinar las pérdidas de las glándulas en la tráquea, con un nivel de significación en ambos análisis de p < 0.05. Mediante técnicas histopatológicas, en el epitelio de los senos paranasales, la tráquea y los bronquios, se observó erosión del epitelio y exudado mucoso e hiperplasia del tejido linfoide asociado a mucosa. En los senos paranasales se observaron quistes glandulares y en la tráquea se observó metaplasia epitelial. A partir de muestras originales y pases en embrión de pollos se aisló e identificó el coronavirus de la bronquitis infecciosa.

Mejoras en el proceso evaluativo de la calidad del diagnóstico en los laboratorios con tecnología SUMA

The Immunoassay Center (CIE) is a Cuban institution dedicated to develop the SUMA (Ultra Micro Analytical System), a diagnostic system currently applied in programs of prenatal and neonatal screening, epidemiological surveillance, and certification of donated blood, organs and placentas. In order to guarantee the quality of diagnosis with this technology, CIE has implemented a system of quality assessment for SUMA laboratories that is continuously improved and refined. The present work describes the currently implemented quality assessment system and how it solves the limitations of conventional quality control schemes in immunoassay laboratories. This objective was met by incorporating the reliability index and index of coefficients of variation, in an effort to provide a more rounded analysis that combines the examination of different types of quality controls (internal and external). These analyses were incorporated into the automated quality evaluation software currently employed by SUMA technology laboratories (Quality Assurance System; SAC 2.0), yielding measurable improvements to the quality evaluation process.

El Centro de Inmunoensayo es una institución cubana que desde hace varios años se dedica al desarrollo de la tecnología SUMA (Sistema Ultra Micro Analítico), que se emplea en programas de pesquisa prenatal y neonatal, vigilancia epidemiológica, certificación de sangre, órganos y placenta. Con el objetivo de garantizar la calidad del diagnóstico con esta tecnología, el Centro de Inmunoensayo ha desarrollado y perfeccionado su sistema de evaluación de la calidad. Este artículo describe el sistema que permitió solucionar las limitaciones de los esquemas convencionales para el control de la calidad en los laboratorios de inmunoensayos. Para ello se incorporaron dos estadígrafos: índice de fiabilidad e índice de coeficientes de variación, con el objetivo de combinar el análisis de dos tipos de control de la calidad (el control interno y el control externo), y lograr un análisis integral. La variante descrita se ha añadido al sistema automatizado que evalúa la calidad de los laboratorios con tecnología SUMA (Sistema para el Aseguramiento de la Calidad, SAC 2.0), y mejora la eficacia y eficiencia del proceso evaluativo.

Modelo matemático del metabolismo de las células CHO en la síntesis de eritropoyetina humana para aplicar la técnica de análisis de flujos metabólicos

Mathematical modeling of metabolism meets several important applications in the context of bioprocess engineering, such as the interpretation of cell physiology. Metabolic Flux Analysis, one of the tools of this discipline, was used in the present work to characterize the biosynthesis of recombinant human erythropoietin in CHO cells. In order to apply this method, we built a matrix of stoichiometric numbers representing the major metabolic pathways for the generation of energy and the synthesis of essential precursors for product and biomass accumulation. Equations representing the biosynthesis of recombinant human erythropoietin and the growth of CHO were also derived, conferring an advantage to the proposed model over other existing designs. The dimensions of the obtained matrix were 47 Ã— 44, with a rank of 44 and a condition number of 83; therefore, the model has a unique solution and is not sensitive. The metabolic flux map obtained by solving the mathematical model using experimental data showed results consistent with the known biochemistry of CHO cells and with the findings of other reports on this and other mammalian cell lines. The general steps of the methodology used to obtain the proposed mathematical model are also outlined.

Mathematical modeling of metabolism meets several important applications in the context of bioprocess engineering, such as the interpretation of cell physiology. Metabolic Flux Analysis, one of the tools of this discipline, was used in the present work to characterize the biosynthesis of recombinant human erythropoietin in CHO cells. In order to apply this method, we built a matrix of stoichiometric numbers representing the major metabolic pathways for the generation of energy and the synthesis of essential precursors for product and biomass accumulation. Equations representing the biosynthesis of recombinant human erythropoietin and the growth of CHO were also derived, conferring an advantage to the proposed model over other existing designs. The dimensions of the obtained matrix were 47 x 44, with a rank of 44 and a condition number of 83; therefore, the model has a unique solution and is not sensitive. The metabolic flux map obtained by solving the mathematical model using experimental data showed results consistent with the known biochemistry of CHO cells and with the findings of other reports on this and other mammalian cell lines. The general steps of the methodology used to obtain the proposed mathematical model are also outlined.

Mejora genética de microtubérculos de papa in vitro mediante irradiación gamma

The potato (Solanum tuberosum L.) is a major food crop in Egypt. The main problem in the program of conventional seed potato production is the low rate of multiplication in field conditions and the susceptibility of potato to diseases such as fungi, bacteria and viruses, thereby resulting in poor quality and yields. Recently, plant tissue culture technology has become very popular and has a visible impact on the production of virus free pre-basic seed potatoes. This study was aimed at producing virus free microtubers in vitro, to investigate the stimulating effects of low doses of gamma irradiation on microtuber mean number, mean fresh weight and size. Among the gamma radiation doses tested (1.5, 2, 2.5, 5 and 10 Gy), the 5 and 10 Gy doses gave the highest number of microtubers, had significant effects on microtuber weight increase and also generated the highest size microtubers (180 cm3). Additionally, nine potato unique markers were identified among the 45 polymorphic bands, as analyzed by random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction profiles, with one marker detected for the 5 Gy gamma radiation dose and none for the 10 Gy. The highest number of markers (4) was obtained with the 2.5 Gy dose.

La papa (Solanum tuberosum L.) es uno de los cultivos más importantes de Egipto. Los principales problemas de dicho cultivo en este país son las limitaciones en cuanto a las velocidades de multiplicación alcanzables con los programas convencionales de propagación por semillas, así como la susceptibilidad de esta planta a enfermedades fíºngicas, bacterianas y virales que frecuentemente comprometen la calidad y cantidad de las cosechas. Una alternativa, la tecnología de cultivo in vitro de tejidos vegetales, ha cobrado una alta popularidad, y ya ha producido un impacto visible en la producción de semilla pre-básica libre de virus. El presente estudio se trazó como objetivos la producción in vitro de microtubérculos libres de virus, así como la investigación del efecto estimulador de dosis bajas de radiación gamma en los promedios del níºmero de microtubérculos, peso fresco y talla. Se ensayaron diferentes dosis de radiación gamma (1.5, 2, 2.5, 5 y 10 Gy), obteniéndose los más altos níºmeros de microtubérculos, los mayores incrementos en peso y en talla (180 cm3) para las dosis de 5 and 10 Gy. Adicionalmente, se identificaron nueve marcadores íºnicos para papa entre 45 bandas polimórficas en los patrones obtenidos por amplificación aleatoria de DNA polimórfico por PCR (RAPD), con un marcador detectado para la dosis de radiación gamma de 5 Gy y ninguno para la de 10 Gy. El níºmero más alto de marcadores (4) se obtuvo para la dosis de 2.5 Gy.

Heberprot-P®: una idea convertida en producto

Diabetes mellitus has become a significant health problem throughout the world, where it constitutes the underlying cause for 84% of lower limb amputations due to recalcitrant ulcers. The Center for Genetic Engineering and Biotechnology (CIGB) at Havana, Cuba has designed an integrated strategy for preclinical testing, pharmaceutical development, production, clinical trials and business negotiations of an injectable drug for treating diabetic foot ulcers, denominated Heberprot-P®. This product, which uses epidermal growth factor as active ingredient and avoids these amputations, is the only registered drug of its type and has already had considerable medical, social and economic impact in Cuba and other nations, placing national science and the Cuban health system at the forefront of the fight against this disorder. Phase III trials are planned for 2013, pending approval of the Advisory Scientific Council of the European Medicines Agency (EMA), for examining its efficacy and safety in this continent. Research teams at CIGB continue to develop new Heberprot-P® versions, based on advanced controlled release systems employing micro and nanospheres, in order to continuously improve the product and extend its existing intellectual property coverage beyond the year 2030.

La diabetes mellitus es un preocupante problema de salud que aporta el 84% de las amputaciones de los miembros inferiores por úlceras en el mundo. El Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) de Cuba diseñó una estrategia de ensayos preclínicos, desarrollo farmacéutico, productivo, ensayos clínicos y negocios de un medicamento inyectable para el tratamiento de las úlceras del pie diabético. Heberprot-P® es el único fármaco registrado a escala mundial, cuyas propiedades terapéuticas, modo de aplicación y nicho de indicación han ejercido un extraordinario impacto médico, social y económico en Cuba y otros países. Su principio farmacéutico activo es el factor de crecimiento epidérmico. Está situando a la ciencia cubana y a su sistema de salud a la vanguardia internacional en el tratamiento de esa afección y evitar las amputaciones. En 2013, se prevén estudios clínicos fase III, luego del visto bueno del Comité Científico Asesor de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA), para demostrar su eficacia y seguridad. Un equipo de investigadores del CIGB sigue trabajando en las nuevas generaciones de Heberprot-P®, basadas en novedosos sistemas para su liberación controlada en microesferas y nanoesferas, que permitan mejoras y optimización continuas, y prorroguen su patente más allá del año 2030.

Apuntes sobre la patógenesis del VIH, su terapia y eliminación

This report summarizes the main topics delivered as lectures at the meeting Frontiers in HIV pathogenesis, Therapy and Eradication, held at the Whistler Conference Centre, in Whistler British Columbia, Canada, in March 26-31. The meeting was organized as part of the Keystone Symposia on Molecular and Cell Biology joined with the conference Cell Biology of Virus Entry. The current status on research for eradicating HIV-1 latent reservoirs and ways to reactivate them for destruction with current or novel antiretroviral therapies were the key topics. Targeted inhibition of virus entry, new classes of inhibitors, animal models for testing antiretroviral therapies and virus cell-to-cell contact-mediated transmission, together with structural analysis of HIV-1 proteins and replication processes, were also presented. The useful discussions at both the oral and poster sessions paved the way for understanding processes essential for future therapeutic attempts to effectively inhibit virus replication and transmission, including its eradication.

Este reporte resume los tópicos fundamentales de las conferencias impartidas en el congreso Fronteras en la patogénesis del VIH, su terapia y erradicación, que se celebró en el Centro de Congresos de Whistler, Whistler British Columbia, Canadá, del 26 al 31 de marzo de este año. El congreso se organizó de conjunto con el evento Biología Celular de la Entrada Viral, como parte de los Simposios de Keystone sobre Biología Molecular y Celular. Los tópicos fundamentales abarcaron el estado actual de las investigaciones para erradicar los reservorios latentes del VIH-1, y las estrategias para activarlos mediante terapia antirretroviral convencional o de nueva generación, y de esa forma promover su destrucción. También se discutieron temas relacionados con la entrada viral como blanco terapéutico, nuevas clases de inhibidores, los modelos animales disponibles para evaluar las terapias antirretrovirales y la transmisión del VIH-1 mediante el contacto entre células. Las discusiones tanto en las sesiones orales como en la presentación de carteles favorecieron una mejor comprensión de los procesos esenciales para intentar en un futuro desarrollar terapias no solo para inhibir la replicación y transmisión del VIH-1, sino también para eliminarlo.

Estudios fisiológicos y nutricionales de la Escherichia coli y la combinación novedosa de métodos de separación permiten obtener ADN plasmídico con alta pureza y homogeneidad para su uso en terapia génica

A scalable high-cell-density Escherichia coli culture method was established to obtain pharmaceutical grade plasmid DNA (pDNA), together with an optimized purification process. The effects of several components of the medium, such as carbon and nitrogen sources that ensure bacterial nutritional needs, were studied. The operation parameters, such as temperature, shaking and aeration, were set and the optimum values of cell growth and specific pDNA productivity in culture were determined. The subsequent purification process for pharmaceutical grade pDNA was implemented, by combining RNA precipitation with ammonium sulfate and two successive chromatographic steps consisting of size exclusion chromatography and reverse phase-high performance liquid chromatography. This work comprised the first report on the use of reverse phase to purify DNA for application in humans.

Se estableció un método de cultivo incrementado para obtención de ADN plasmídico en Escherichia coli a altas concentraciones celulares, y estudio el efecto de varios componentes del medio, como las fuentes de carbono y de nitrógeno para garantizar las necesidades nutricionales. Se estableció los parámetros de temperatura, agitación y aireación, y obtuvo los valores óptimos de crecimiento celular y productividad específica de ADN plasmídico en el cultivo. Se implementó un proceso productivo de ADN plasmídico de grado farmacéutico, combinando la precipitación de ARN con sulfato de amonio, y dos pasos cromatográficos sucesivos de cromatografía de exclusión molecular y de cromatografía líquida de alta presión en fase reversa. Este último proceso es la primera vez que se emplea en la literatura para la purificación de ADN para aplicación en humanos.

Desarrollo de un nuevo antígeno contra el virus de la influenza aviar basado en la fusión de dominios expuestos de la hemaglutinina viral del subtipo H5 y la proteína CD154 de Gallus gallus

The highly pathogenic H5N1 avian influenza virus (AIV) has caused important economic losses and public health problems, mainly in Asia, Africa and Europe. Counteracting this virus by vaccination of poultry is crucial. In our study, recombinant antigens based on the fusion of the extracellular segments of both molecules, hemagglutinin H5 of AIV and the chicken CD154, were tested to enhance the immune response in chickens. For this purpose, chickens were immunized with recombinant adenoviral vectors carrying the nucleotide sequence of the hemagglutinin H5 alone (AdHA) or fused to the CD154 recombinant protein (AdHACD). Also, these two proteins (rHA and rHACD) were produced and assayed as antigens. Both, the adenoviral vector AdHACD and the recombinant protein rHACD, induced hemagglutination-inhibiting antibody titers significantly higher than their counterparts carrying HA alone. Similar results were observed when the cellular response was measured by real time PCR. AdHACD and rHACD significantly increased the production of IFN-? transcripts, which were lower when AdHA or rHA were used. To obtain a higher quality antigen, rHACD was purified by size exclusion chromatography, resulting in the preservation of its immunogenic properties. However, rHACD did not work as immunogen when an immunoaffinity chromatography was performed by eluting at acidic pH or with a chaotropic agent. These results demonstrate that chicken CD154 can significantly enhance humoral and cellular responses against hemagglutinin H5 of AIV when both molecules are administered as a fusion protein in chickens. Therefore, AdHACD or rHACD could become promising vaccine candidates against H5N1 virus.

El virus de la influenza aviar (AIV) H5N1 ha causado serios problemas económicos y de salud pública en Asia, África y Europa. Por este motivo, la protección de la masa avícola contra este virus es fundamental. En este estudio se desarrollaron dos antígenos basados en la fusión del segmento expuesto de la hemaglutinina H5 del AIV con el segmento expuesto del CD154 de pollo. Estos se inmunizaron como vectores adenovirales recombinantes que contenían la hemaglutinina H5 simple (AdHA) o la proteína de fusión (AdHACD), o como antígenos proteicos recombinantes rHA y rHACD. Tanto el AdHACD como la rHACD indujeron títulos de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación significativamente superiores a los obtenidos con el AdHA y la rHA. Al medir la respuesta celular por PCR en tiempo real, los resultados fueron similares. El AdHACD y la rHACD incrementaron significativamente la producción de transcritos de IFN-?. Estos fueron menores con el AdHA y la rHA. Para obtener un antígeno de mayor calidad, se purificó la rHACD por cromatografía de exclusión molecular. Este método mantuvo la inmunogenicidad de la rHACD. Sin embargo, cuando se realizó una cromatografía de inmunoafinidad mediante elución a pH ácido o con un agente caotrópico, la rHACD no funcionó como inmunógeno. Estos resultados demuestran que el CD154 de pollo puede incrementar significativamente la inmunidad humoral y celular contra la hemaglutinina H5 del AIV, cuando ambas moléculas se administran fusionadas en pollos. Por tanto, el AdHACD y la rHACD podrían convertirse en candidatos vacunales prometedores contra el virus H5N1.

La proteína quinasa NtPK confiere alto nivel de protección contra el hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani

To identify Nicotiana tabacum genes involved in resistance and susceptibility to the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani, transcripts were generated (by subtractive libraries), which were differentially expressed in each interaction. This enabled isolation of a gene coding for a protein kinase that becomes silent during the susceptibility interaction and is activated during resistance. The expression of this gene in tobacco plants significantly increased resistance against an aggressive isolate of R. solani. However, silencing the gene drastically reduced resistance to a non-aggressive isolate of R. solani. Besides, genes such as: superoxide dismutase, hsr203j, chitinases and phenylalanine ammonia lyase, related with resistance to tobacco plant diseases, in which the gene coding for the protein kinase is overexpressed or silenced, were evaluated. This gene can be used to design a strategy of resistance to R. solani in tobacco cultures or other plants of the Solanaceae family, susceptible to this phytopathogen.

Con el objetivo de identificar los genes involucrados en la resistencia y susceptibilidad de la Nicotiana tabacum al hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani, se generaron (a través de librerías substractivas) transcriptos que se expresan diferentemente en cada interacción. Ello permitió el aislamiento de un gen que codifica para una proteína quinasa que se silencia durante la interacción de susceptibilidad y se activa durante la resistencia. La expresión de este gen en plantas de tabaco incrementó significativamente su resistencia frente a un aislado agresivo de R. solani. Sin embargo, el silenciamiento del gen redujo drásticamente la resistencia a una cepa no agresiva de R. solani. Además se evaluaron genes como superóxido dismutasa, hsr203j, quitinasas y fenilalanina amonio-liasa relacionados con la resistencia a enfermedades en plantas de tabaco en las que se sobrexpresa o silencia el gen que codifica para la proteína quinasa. Este gen se puede utilizar para el diseño de una estrategia de resistencia a R. solani en cultivos de tabaco u otras plantas de la familia Solanácea, susceptibles a este fitopatógeno.