Biotecnología Aplicada

Biotecnología Aplicada: 30 años publicando ciencia

Excitotoxicidad y muerte neuronal en la epilepsia

Epilepsy is a recurrent, often progressive neurological disorder with a chronic evolution, affecting 1 to 2 % of the world population. Research with experimental models and imaging analysis of diseased patients have been used to show that recurrent episodes produce oxidative stress, most of which is related to neuronal excitability phenomena. It is known that the excessive stimulation of glutamate receptors results in neurotoxicity; a process that, under the denomination of excitotoxicity, is thought to constitute the principal cellular death mechanism behind different disorders of the central nervous system, including epilepsy. Paradoxically, although the signaling pathways, molecular mechanisms and sites of action of excitotoxicity have received considerable attention since the 1970s, little is known about their relevance to CNS disorders. Further detail is necessary about the fundamental role of neuronal death and the mechanisms, particularly those relevant to neurological pathogenesis, that are engaged whenever glutamate receptors are excessively stimulated, as the results would aid considerably the development of timely clinical interventions delaying the evolution of these disorders. We review clinical and experimental data on the relevant alterations of the glutamatergic system, cell death pathways, and the activation of caspases and members of the Bcl-2 gene family involved in the process as modulators of cell death during epilepsy. The findings support the hypothesis that excitotoxic processes as well as both apoptotic and necrotic neuronal cell death phenomena converge in drug-resistant epilepsy.

La epilepsia es una afección neurológica de evolución crónica, recurrente, casi siempre progresiva, que afecta del 1 al 2 % de la población mundial. Modelos experimentales y estudios de imágenes neurológicas de pacientes con este padecimiento muestran que las crisis recurrentes provocan estrés oxidativo, relacionado fundamentalmente con la excitabilidad neuronal. La estimulación excesiva de los receptores de glutamato induce neurotoxicidad, un proceso que se ha definido como excitotoxicidad. Se considera que este puede ser el principal mecanismo de muerte celular en numerosas afecciones del sistema nervioso central, incluida la epilepsia. Desde los años 70 se han estudiado con profundidad las vías de señalización, los mecanismos moleculares y los sitios de acción relacionados con la excitotoxicidad; aunque de forma muy limitada en las enfermedades del sistema nervioso central. En particular, deberán evaluarse con especial cuidado la función crucial de la muerte neuronal y los mecanismos que se potencian con la sobreactivación de los receptores de glutamato, principalmente los relativos a las enfermedades neurológicas, con el fin de intervenir de manera oportuna para retardar el desarrollo de estas afecciones neurológicas. Se repasan las evidencias clínicas y experimentales sobre las alteraciones del sistema glutamatérgico, las vías de muerte celular, la activación de las caspasas y de la familia de genes Bcl-2 involucrados, como moduladores de la muerte celular en la epilepsia. Tales hallazgos sustentan que en la epilepsia farmacorresistente convergen procesos excitotóxicos y de muerte neuronal apoptótica y necrótica.

Identificación molecular y evaluación patogénica de trece aislamientos de Trichoderma spp. frente a Rhizoctonia solani Kühn

Disease caused by Rhizoctonia solani Kühn infestations has become a growing problem for commercially important crops. Although this fungus is usually controlled through the application of chemicals, the heavy ecological and financial toll of the latter has prompted for research on biopesticides as a viable alternative. Trichoderma spp. is a well-known fungus often used for the biological control of crop pests, whose anti-fungal mechanisms include competition for the substrate, antibiosis and/or mycoparasitism. In the present work, we have used molecular techniques (sequencing of amplicons from the internal transcribed spacer of ribosomal DNA and the EF1A translation elongation factor) for the taxonomic identification of 13 Trichoderma spp. isolates in our collection, also evaluating their antibiotic effect on strains from three anastomosis groups of R. solani (AG-2.1, AG-5, AG-8) by the cellophane method. The sequences obtained from all isolates exhibited 100 % identity with deposited T. asperellum Samuels sequences in TrichoBLAST/GenBank, enabling their taxonomic assignment to this species. When analyzed by in vitro tests, over 70 % of the isolates exhibited a fungistatic effect towards R. solani, with the remaining strains exhibiting fungicidal activity; these results were later corroborated by technical efficacy tests under field conditions. Isolates 3, 13, 17, 75, 78, 85 and 90 were selected as potential biocontrol agents due to their high antibiotic activity and technical efficacy under field conditions.

La incidencia de las enfermedades causadas por Rhizoctonia solani Kühn en las plantas aumenta cada año. Su control es fundamentalmente con productos químicos, en su mayoría muy tóxicos. Por tal razón, se investigan alternativas bioplaguicidas. Trichoderma spp. es uno de los hongos más utilizados para el control biológico de plagas, por sus propiedades y mecanismos de acción: competencia por el sustrato, antibiosis y micoparasitismo. Este trabajo tuvo como objetivos la identifi cación molecular y evaluación patogénica de 13 aislamientos del género Trichoderma frente a aislamientos de R. solani. Se evaluó su efecto antibiótico sobre aislamientos de 3 grupos de anastomosis de R. solani (AG-2.1, AG-5, AG-8) por el método de celofán. La identificación molecular partió de la secuenciación del espaciador interno del transcrito de la región del ADN ribosomal y del factor de elongación de la traducción EF1A. Más del 70 % de los aislamientos evaluados ejerció un efecto fungistático; mientras que el resto actuó como fungicida. La evaluación de la eficacia técnica en condiciones de campo corroboró estos resultados. A partir de la secuenciación y comparación de los datos de las secuencias depositadas en TrichoBLAST/GenBank, se comprobó que todos los aislamientos tenían el 100 % de identidad con la especie Trichoderma asperellum Samuels. Se seleccionaron los aislamientos 3, 13, 17, 75, 78, 85 y 90 como promisorios agentes de control biológico, por su alto potencial antibiótico y eficacia técnica en condiciones de campo.

Regeneración in vitro de plantas de soya de la variedad cubana Incasoy-36

An efficient and reproducible plant regeneration procedure is essential for introducing genes of interest in important crops through genetic transformation. However, some crops, such as soybean(Glycine max (L.) Merrill), are difficult to manipulate in vitro, often depending on their genotype, and the reproduction of the established protocols is not always possible. The purpose of this paper is the optimization of a regeneration protocol for soybean shoots of the Cuban variety Incasoy-36 to enable its reproduction. Cotyledonary nodes of mature seeds were the explants of choice to promote regeneration under specific culture conditions. The effect of several concentrations of benzylaminopurine on shoot induction was evaluated and it was demonstrated that the age of explants is essential for regeneration. Shoot formation was increased with 1.5 mg/L of benzylaminopurine, producing a regeneration frequency of 96.8 % and 4.3 shoots in explants with a 6 day germination period. The elongation of shoots, as well as rooting occurred in an MSB5 medium without hormones. Regenerated plantlets were obtained 7-8 weeks after the start of the culture and they were morphologically similar to plants of this variety.

Un procedimiento eficiente y reproducible de regeneración de plantas es esencial para introducir genes de interés en cultivos importantes, mediante la transformación genética de las plantas. Sin embargo, hay cultivos como la soya (Glycine max (L.) Merrill), cuya manipulación in vitro es difícil, muchas veces depende de su genotipo, y no es posible la reproducibilidad de todos los protocolos establecidos. El objetivo de este trabajo fue la optimización de un protocolo de regeneración de brotes de soya de la variedad cubana Incasoy-36, de modo que se pueda reproducir. Para promover la inducción de los brotes en condiciones específicas de cultivo, se seleccionó el nudo cotilenodal de las semillas maduras como explant. Se evaluó el efecto de varias concentraciones of bencilaminopurina y se demostró que la edad del explant es fundamental en el proceso de regeneración. La concentración óptima para la organogénesis fue 1.5 mg/L of bencilaminopurina, que favoreció el 96.8 % de la frecuencia de formación de los brotes y una eficiencia de 4.3 brotes en explantes de 6 días de germinados. La elongación de los brotes y la inducción de las raíces ocurrieron en un medio MSB5 sin hormonas. Las plantas regeneradas se obtuvieron entre 7 y 8 semanas de iniciado el cultivo, y fueron morfológicamente similares a las de esta variedad.

Tipificación molecular de Streptococcus suis aislado de cerdos en Cuba

Streptococcus suis is a bacterium commonly carried by pigs in the respiratory tract; thus the infections caused by virulent strains are considered a problem in the swine industry. A successful approach for the identification of virulent strains is the differentiation of capsular serotypes using specific antisera or the corresponding cps types by genotypic assessment, with the subsequent detection of virulence associated factors, namely the extracellular factor, the muramidase-released protein and the hemolysin suilysin. Data regarding serological and molecular identification of S. suis from pigs in Cuba are not available. This study was aimed at identifying the capsular types cps2, 7 and 9, as well as three genes related to virulence using PCR assays. According to the results, 31 isolates were evaluated and classified as cps2 (n = 21) or cps9 (n = 4), while six isolates not were typable. Considering the presence in these isolates of the genes mrp, epf and sly, six different genotypes were differentiated among the cps2 or cps9 strains and there were three non-typable isolates for the genes used in this study. The cps2 isolates were recovered from pigs between 6-12 and 14-17 weeks with pneumonia and systemic infection respectively, whereas the cps9 isolates were exclusively associated with pneumonia.

Streptococcus suis es una bacteria común en el tracto respiratorio de los cerdos; sin embargo las infecciones causadas por cepas virulentas se consideran un problema en la industria porcina. Estas cepas se pueden identificar por la diferenciación de los serotipos capsulares con antisueros específicos o por sus correspondientes tipos cps, mediante ensayos genotípicos. También se pueden reconocer mediante la detección de factores asociados con la virulencia, como el factor extracelular, la proteína liberada por muramidasa y la hemolisina suilisina. Antes de esta investigación no había datos sobre la identificación serológica o molecular de los tipos capsulares de S. suis procedentes de cerdos en Cuba. El objetivo de esta investigación fue la detección de los tipos capsulares cps2, cps7 y cps9, y de los tres genes asociados con la virulencia, mediante ensayos de reacción en cadena de la polimerasa. De 31 aislamientos, 21 se clasificaron con el genotipo capsular cps2, y 4 con el cps9. El genotipo capsular cps7 no se detectó y 6 aislados no se correspondieron con ninguno de los serotipos analizados. Considerando la presencia de los genes sly, epf y mrp, se identificaron seis genotipos en los aislados cps2 y cps9, y 3 en los aislados cuyo genotipo cps no se identificó. Los aislados cps2 se extrajeron de cerdos de 6 a 12 con neumonía y de 14 a 17 semanas con infección sistémica; mientras que los cps9 estaban asociados exclusivamente con neumonía.

Propiedad de inactivación viral durante la obtención de la Melagenina(r) Plus en la etapa de almacenamiento

This work was aimed at validating the viral inactivation property during the storage step of the production process of Melagenina(r) Plus, which is a Cuban biological product for the treatment of vitiligo. The product was challenged at storage with high loads of four viral models, corresponding to three enveloped and one non-enveloped virus, two of them RNA and the other two DNA viruses: the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), the bovine viral diarrhea virus (BVDV), the porcine herpes virus type 1 (PHV-1) and the canine parvovirus (CPV). The viral titer was determined using the Reed-Muench method based on the viral cytopathic effect, and reduction factors were calculated as the difference of viral loads at the beginning and the end of the step. Enveloped viruses were inactivated between days 1 to 3, and the enveloped virus (CPV) was achieved after 21 days. The viral load showed a very highly significant decrease (p < 0.0001), being conditioned to storage temperature (30 ± 5 °C) and ethanol concentration (71 % minimum). The reduction factors achieved on this step (1:5.0 log for HIV-1; 3.5 log for BVDV; 4.24 log for PHV-1 and 5.8 log for CPV) characterized the adequate level of safety of the Melagenina(r) Plus production process.

Este artículo presenta la validación de la propiedad de inactivación viral de la Melagenina(r) Plus en la etapa de almacenamiento: producto biológico cubano para el tratamiento del vitiligo. La etapa se retó con altas cargas virales de cuatro modelos virales de tres virus envueltos y uno no envuelto, y de genoma ARN (dos) o ADN (dos), respectivamente: virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), virus de la diarrea viral bovina (VDVB), virus del herpes porcino tipo 1 (VHP-1) y parvovirus canino (PVC). El título viral se determinó por el método de Reed y Muench basado en el efecto citopático viral; y los factores de reducción se calcularon por la diferencia de la carga viral al inicio y al final de la etapa. La inactivación de los virus envueltos se logró entre el primero y el tercer día, y la inactivación del modelo de virus no envuelto (PVC), a los 21 días. La disminución de la carga viral fue altamente significativa (p < 0.0001), determinada por la temperatura de almacenamiento (30 ± 5 °C) y la concentración de alcohol (mínima: 71 %). Los factores de reducción alcanzados en esta etapa para los modelos virales (VIH-1: 5.0 log; VDVB: 3.5 log; VHP-1: 4.24 log; PVC: 5.8 log) le confieren un adecuado nivel de seguridad al proceso de producción de la Melagenina(r) Plus.

Sustitución del medio suplementado con suero en la congelación de células del hibridoma CB.Hep-1 y la producción del anticuerpo monoclonal

CB.Hep-1 monoclonal antibody (mAb) has been used in Hepatitis B vaccine manufacture. The mAb production was performed by ascites method inoculating cells previously frozen and cultivated in fetal bovine serum supplemented medium (SSM). It is expensive at risk and can be contaminated with adventitious pathogens. Therefore, the main objective of this study was to replace the SSM by the chemically defined medium Filocethplus (cell freezing) and the protein free medium HyQ(r)SFM4CHOTM (cell growing). As results, cells cryo-preserved in Filocethplus for 180 days and cultivated in HyQ(r)SFM4CHOTM showed no significant differences in regards to viability, maximum viable cell density and growth conditions with the same cells cultivated and frozen in SSM. In addition, CB.Hep-1 cells that were frozen in Filocethplus and cultivated in HyQ(r)SFM4CHOTM exhibited similar performance to those frozen and cultivated in SSM in agitated culture, which point out the application of these media for CB.Hep-1 mAb and Hepatitis B vaccine production.

El anticuerpo monoclonal (AcM) CB.Hep-1 se utiliza en la fabricación de la vacuna contra la hepatitis B. Se produce por el método de ascitis: inoculando células previamente congeladas y cultivadas en medios suplementados con suero fetal bovino (MSS). Este AcM es caro y puede contaminarse con agentes patógenos adventicios. Por ello, el objetivo de este estudio fue la sustitución del MSS por el medio químicamente definido Filocethplus durante la congelación de células y por el medio libre de proteínas HyQ(r)SFM4CHOTM durante el crecimiento celular. Los resultados con las células crioconservadas en Filocethplus durante 180 días y cultivadas en HyQ(r)SFM4CHOTM no mostraron diferencias significativas en cuanto a la viabilidad, la densidad máxima de células viables y las condiciones de crecimiento con respecto a las células cultivadas y congeladas en MSS. Las células CB.Hep-1, congeladas en Filocethplus y cultivadas en HyQ(r)SFM4CHOTM, también mostraron resultados similares a los de las células congeladas y cultivadas en MSS en cultivo agitado. Ello indica que estos otros dos medios se pueden emplear para la producción del AcM CB.Hep-1 y la vacuna contra la hepatitis B.

II edición del congreso internacional sobre la Atención integral al paciente con úlceras del pie diabético con el uso de Hebeprot-P 2012: Puertas sanas abiertas a la edición de 2014

The second edition of the international congress addressed to the Integral care of diabetic foot patient with the use of Heberprot-P was successfully celebrated last December 12-14th, at the Memories Varadero hotel, in Cuba. Up to 500 delegates from 37 countries attended and were pleased with the update in the treatment of diabetic foot ulcers (DFUs) with Heberprot-P and strategies for the integral care of diabetic patients. The meeting counted on with several world leaders in DFU treatment. During the three working days, 11 plenary lectures, 31 oral presentations and 130 posters were discussed. Main topics comprised the mechanisms of wound healing using the human epidermal growth factor and its safety for DFU therapy. The use of Heberprot-P in Cuban patients as part of the nationwide integral care program for the treatment of DFUs was highlighted. This program have been extended to 43 major hospitals and 197 local clinics, with more than 15 000 patients treated and diminishing amputation rates in more than 65 %. This is a remarkable result considering that Heberprot-P successfully targets and generally cicatrizes complex Wagner 3-5 ulcers, mainly ischemic.

La segunda edición del congreso internacional sobre la Atención integral al paciente con úlceras del pie diabético con el uso de Hebeprot-P se celebró exitosamente del 12 al 14 de diciembre pasado en el hotel Memories Varadero, en Cuba. Más de 500 delegados de 37 países asistieron y fueron actualizados en el tratamiento con Heberprot-P de las úlceras del pie diabético (UPD) y las estrategias para el cuidado de los pacientes diabéticos. El congreso reunió a varios líderes mundiales sobre tratamiento de UPD. Durante las tres jornadas se presentaron 11 conferencias plenarias, 31 presentaciones orales y 130 carteles. Los temas principales abarcaron los mecanismos de curación de úlceras con el uso del factor de crecimiento epidérmico humano y su seguridad para la terapia de las UPD. Se resaltó el empleo del Heberprot-P en pacientes cubanos, como parte del programa nacional para el cuidado integral de las úlceras del pie diabético. Este programa se ha extendido a 43 hospitales generales y 197 policlínicos, con más de 15 000 pacientes tratados y una reducción de más de 65 % en las tasas de amputación. Este es un resultado muy significativo, puesto que el Heberprot-P es dirigido satisfactoriamente y cicatriza generalmente las úlceras complejas Wagner 3-5, principalmente las isquémicas.