Biotecnología Aplicada

Aspectos evolutivos, fisiológicos y biotecnológicos de la ferroquelatasa y hemo en plantas superiores

Heme, is a cofactor for essential proteins, it is synthesized after the insertion of Fe2+ into protoporphyrin ring by the ferrochelatase (FC) enzyme. Although FC is well described, there are still major questions about the regulation of the heme biosynthetic pathway, and the localization of the enzyme in plants. This review provides a comprehensive survey of research on function and the metabolism of heme in plants including the unique properties of the plant heme metabolism. We will summarize the knowledge of the expression, reaction mechanism, localization and the phylogeny of FC. Increasing the heme iron content in plant foods is a biotechnological challenge to improve the dietary intake of iron in the population; it is known that heme-contained iron is absorbed 5-10 times higher than non-heme iron.

El grupo hemo, cofactor para proteínas esenciales, es sintetizado a partir de la inserción de Fe2+ en el anillo de protoporfirina por la enzima ferroquelatasa (FC). A pesar de que FC está bien caracterizada, existen aún incógnitas principales acerca de la regulación de la vía biosintética y la localización de la enzima en las plantas. Este artículo provee una revisión detallada acerca de las investigaciones sobre la función y el metabolismo del hemo en las plantas; incluye además información sobre las características únicas del metabolismo del hemo. Resumimos los conocimientos sobre la expresión, mecanismos de reacción, localización y filogenia de la FC. Incrementar el contenido de hierro hemo en los alimentos de origen vegetal es un gran reto biotecnológico para mejorar la ingesta de hierro en la población; el hierro hemo es de 5-10 veces más absorbido que el hierro no hemo. En esta revisión nosotros sugerimos modificaciones biotecnológicas potenciales en el metabolismo del hemo en las plantas para incrementar la capacidad de los cultivos de resistir los estreses biótico y abiótico y mejorar las cualidades nutricionales de las plantas como fuente de hierro para la dieta.

Estado actual sobre la producción de vacunas veterinarias, tendencias y proyecciones

The dynamism observed in the area of veterinary vaccinology needs to be monitored by the biopharmaceutical industry, thus, to anticipate to the possible changes and take actions that allow it to adapt to the future scenario. On this basis, a study was performed to assess the current status, trends, scientific and technological projections in the production of veterinary vaccines. To this end, a topic search was done on vaccines for poultry, cattle, pigs, rabbits, horses, fish and dogs, in the Scopus database from 2008 to 2012 and further contextualized to early 2014. It was found that veterinary vaccinology is a booming field, with the highest growth in the year 2011 with 18.05 % compared to 2008. As such, the US and China are leading this issue, having a major scientific interest in protein antigens, adjuvants and viral vaccines produced with conventional technologies. The most attended species are birds, pigs and cattle, the first species with 15.21 % of all publications. We conclude that the dominance of the classical vaccine production technologies will continue despite the advances in genetic engineering and biotechnology. Vaccines produced with modern technologies seem to be, at least for now, less affordable for the producer, and therefore impractical. Similarly, the next few years will be very important for the development and registration of new vaccines obtained by DIVA technology and their diagnostic systems.

El dinamismo observado en el área de la vacunología veterinaria requiere ser monitoreado por la industria biofarmacéutica, para de esta forma anticiparse a los posibles cambios y tomar acciones que le permita adaptarse al escenario futuro. Sobre esa base se realizó un estudio con el objetivo de evaluar el estado actual, tendencias y proyecciones científico-tecnológicas en la producción de vacunas veterinarias. A tal efecto se efectuó una búsqueda temática en la base de datos Scopus sobre vacunas destinadas a aves, bovinos, cerdos, conejos, equinos, peces y perros, limitada al periodo 2008-2012 y se contextualizó hasta principios de 2014. Se comprobó que la vacunología veterinaria es un campo temático en plena expansión, siendo el año 2011 el de mayor crecimiento con un 18.05 % con respecto al 2008. En tal sentido Estados Unidos y China lideran esta temática, existiendo un interés científico mayoritario por los antígenos proteicos, adyuvantes y vacunas virales producidas con tecnologías clásicas. Las especies más atendidas son las aves, porcinos y bovinos, sobresaliendo la primera especie con el 15.21 % de todas las publicaciones. Se concluye que continuara el dominio de las tecnologías clásicas de producción de vacunas a pesar de los adelantos en materia de ingeniería genética y biotecnología. Las vacunas producidas con tecnologías modernas parecen ser, al menos por ahora, poco asequibles algunos productores, y por tanto, poco prácticas.

Microbiological evaluation and pathogenicity of a liquid bioformulation of the fungus Purpureocillium sp. (strain UdeA 0109) on Meloidogyne incognita-javanica stages

The BIOMA research group (Biocontrol and environmental microbiology) has an industrial liquid formulation based on Purpureocillium sp. (UdeA 0109 strain), developed with the collaboration of Laverlam S.A, a Colombian (Cali) commercial house. In the present study the researchers tested the viability and the purity at different storage temperatures as well as its biological potential both in vitro and under greenhouse conditions. The results of viability showed how the infective structures were affected neither by the evaluation time nor by the storage temperatures. Studies also showed that the purity of the bioformulation in the same conditions was over 99 %, and its pathogenicity in vitro with an LC50 of 104 conidia/mL was corroborated. The greenhouse tests showed the ability to produce damages in eggs of the Meloidogyne incognita-javanica complex, and a decreasing of the J2 stages at a concentration of 108 conidia/mL in three tests performed with a different number of applications and at different times each.

El Grupo de Biocontrol y Microbiología Ambiental (BIOMA) cuenta con una formulación industrial líquida del hongo Purpureocillium sp. (cepa UdeA 0109), desarrollada de conjunto con la casa comercial Laverlam S.A. (Cali, Colombia). En la presente investigación se evaluaron la viabilidad y la pureza del producto a diferentes temperaturas de almacenamiento, así como el potencial biocontrolador in vitro y en condiciones de invernadero. Los resultados de viabilidad mostraron cómo las estructuras infectivas no se afectaron por los tiempos de evaluación ni por las temperaturas de almacenamiento. Los estudios también mostraron cómo la pureza del bioformulado bajo las mismas condiciones, se mantuvo por encima del 99 %, y además se corroboró su patogenicidad in vitro con una CL50 de 104 conidias/mL. Las evaluaciones en invernadero demostraron la propiedad de afectación de los huevos del complejo Meloidogyne incognita-javanica así como la disminución de los estadios jóvenes con una concentración de 108 conidias/mL en tres pruebas, con distintas aplicaciones y tiempos de aplicación.

Determinación del efecto del tamaño y la edad del inóculo en la producción de lipasa por Geotrichum candidum

Lipases are extremely versatile enzymes with large industrial applications and they have been the subject of investigation over the last few years. A great variety of microorganisms can produce this enzyme, such as pluricellular fungi, but their growth need to be optimized due to the variations amongst experiments, which influence the results and reproducibility of the process. The aim of this work was to study the best conditions for inoculum size and age of Geotrichum candidum NRRLY-552, to reduce the variability of the inoculum. The optimized inoculum procedure was determined as: 1 circular area (0.79 cm2) of the solid medium containing cells and spores added to 100 mL of culture medium (5.0 % w/v of peptone, 0.1 % w/v of NaNO3, 0.1 % w/v of MgSO4 and 1.0 % w/v of soybean oil) incubated for 15 h at 30 °C, 250 rpm and with an initial pH of 7.0. This procedure permitted to reduce the experimental error from 30 to 20 % and it has been applied successfully in different studies since then.

Las lipasas son enzimas extremadamente versátiles. Se utilizan en varias aplicaciones industriales, y han sido objeto de atención recientemente. Una diversidad de microrganismos puede producirlas, tales como los hongos pluricelulares. Sin embargo, para el estudio de estas enzimas se debe optimizar su crecimiento, debido a las variaciones entre los experimentos, que influyen en los resultados y en la reproducibilidad de los procesos. El objetivo de este trabajo fue investigar el tamaño y la edad idóneos del inóculo Geotrichum candidum NRRLY-552, con el fin de reducir su variabilidad. El procedimiento optimizado para el inóculo se determinó como una zona circular (0.79 cm2) de medio sólido, que contenía células y esporas, añadido a 100 mL de medio de cultivo (peptona 5.0 % p/v, NaNO3 0.1 % p/v, MgSO4 0.1 % p/v y aceite de soya 1.0 % p/v) que se incubaron durante 15 h a 30 °C, 250 rpm, con un pH inicial de 7.0. Este procedimiento permitió reducir el error experimental de 30 a 20 %, y se ha aplicado con éxito en varios estudios.

Efecto de una formulación vacunal basada en GnRH sobre la concentración de testosterona y la reproducción en ratas machos adultas

In this study is described the effect of different doses of the gonadotropin releasing hormone (GnRH) mimetic peptide GnRHm1-TT, administered in three immunization schemes to define the most effective alternative combination for the treatment of prostate cancer. The design elements of the peptide immunogens are the GnRH-m1 linked to a T helper epitope of tetanus toxoid (TT) by chemical synthesis. Three doses of peptide GnRHm1-TT: 125, 300 and 750 µg were formulated in oil-based emulsions and tested in Copenhagen rats. Three immunization schemes (weekly, fortnightly and monthly) were used. As a result, the 750 µg dose generated a specific anti-GnRH antibody response in the fortnightly and monthly schemes, in contrast to 125 µg and 300 µg doses. The anti-GnRH seroconversion in the best responders corresponded with a decline, both in the testosterone levels down to castration and the size and weight of reproductive organs, an effect absent for the remaining doses of the three immunization schemes. The best variant corresponded to the 750 µg dose in a monthly regime. These findings demonstrated a marked immune-neutralization of the GnRH hormone for a subsequent immunological castration.

Se describe el efecto de diferentes dosis y esquemas de inmunización de un péptido mimético basado en la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), con el objetivo de definir la variante más efectiva en el tratamiento del cáncer de próstata. Este péptido utilizado como inmunógeno, se sintetiza mediante la unión del decapéptido GnRHm1 con un epitopo del toxoide tetánico (GnRHm1-TT), por síntesis química. Fueron utilizadas tres dosis de tratamiento: 125, 300 and 750 µg, formuladas como emulsión oleosa y se evaluaron tres esquemas de tratamiento en ratas Copenhagen: semanal, quincenal y mensual. Como resultado, la dosis experimental de 750 µg generó una mayor respuesta humoral específica anti-GnRH al ser comparado con las restantes dosis, utilizando los esquemas de inmunización quincenal y mensual, y los mejores resultados en el último. Los niveles de seroconversión anti-GnRH de los mejores respondedores se correspondieron con la reducción de niveles de testosterona hasta niveles de castración y a la reducción máxima del peso y la talla de los organos reproductores. Estos hallazgos demostraron que hubo una inmuno-neutralización marcada de la hormona GnRH con la consiguiente castración inmunológica.

Implementación de un ELISA de competencia para estudios de farmacocinética del péptido CIGB-300 en plasma humano

CIGB-300 is a synthetic peptide that inhibits the phosphorylation mediated by enzyme casein kinase 2 (CK2) and has a marked antineoplastic effect in different preclinical models. In the clinical setting, it's explored in phase I and II studies using different routes of administration. In particular, the use of the intravenous route requires a reliable analytical method for the detection of CIGB-300 in plasma. A competitive ELISA was developed to detect and quantify the CIGB-300 peptide in human plasma samples. This system showed a detection limit of 0.030 µg/mL and a working range from 10 to 0.039 µg/mL, including concentrations achieved in plasma of patients treated with CIGB-300. In addition, the intra and inter-assay precisions were (coefficient of variation < 5 %) and (CV < 17 %) and the recovered range from 98.9 to 119.8 %. Finally, the impact of three freeze-thaw cycles and the sample storage at - 80 °C on the stability of the analyte was evaluated. We obtained a CV < 20 % for all samples in the stability study. The results support the application of this analytical method as a new tool for the pharmacokinetic studies of the early stages of clinical research with the new anticancer drug CIGB-300.

El CIGB-300 es un péptido sintético que inhibe la fosforilación mediada por la enzima caseína quinasa 2 (CK2) y ejerce un marcado efecto antineoplásico en diferentes modelos preclínicos. En estudios fase I y II, se exploran sus efectos por varias vías de administración. En particular, la vía intravenosa requiere un método analítico confiable para su detección en plasma. Con este propósito, se desarrolló un ELISA de competencia, para detectar y cuantificar el péptido CIGB-300 en muestras de plasma humano. Este sistema mostró un límite de detección de 0.030 µg/mL y un rango de trabajo de 10 a 0.039 µg/mL, que incluye las concentraciones alcanzadas en el plasma de pacientes tratados con CIGB-300. Además se determinó la variabilidad intraensayo (CV < 5 %) e interensayo (CV < 17 %) y el rango de recobrado del sistema (de 98.9 a 119.8 %). Finalmente, se evaluó el impacto de hasta tres ciclos de congelación-descongelación y de la conservación de la muestra a -80 °C sobre la estabilidad del analito. Para todas las muestras del estudio de estabilidad se obtuvo un coeficiente de variación menor del 20 %. Los resultados fundamentan la aplicación de este método analítico como una nueva herramienta para los estudios farmacocinéticos de las primeras etapas de la investigación clínica con el nuevo fármaco anticáncer CIGB-300.

La evolución de la negociación de los activos intangibles más allá de la protección de la propiedad industrial en biotecnología

Intangible assets may involve more than 2/3 of the value of enterprises and even higher, as in the case of high tech enterprises where knowledge is the main asset. Almost 70 % of the intangibles assets are not identified or they are negotiated as a whole or as a value of goodwill with the consequences that they are either overvalued or undervalued, bringing about enterprise profits or losses. This paper shows the behavior of negotiations of intangible assets, particularly in the international biopharmaceutical industry. The experience of Great Britain and France is given, since these countries have achieved the highest intangible assets identification (37 %), followed by the United States. Among the developing countries, only South Africa and China have identified a representative percentage of intangible assets. The most highly negotiated contracts are those of research and development, followed by licensing agreements and acquisitions. Manufacturing agreements prevail in south-south cooperation. In Cuba the biotechnology sector, as a model of high tech enterprises, shows great strength in novel technologies and unique patented products, which must not only be protected as intellectual property, but they must also be valued and appropriately negotiated. Therefore, a diagnostic study on the negotiation of intangible assets in the biotechnology sector is required, and therefore, a proposal of a strategy for their negotiation.

Los activos intangibles representan más de las dos terceras partes del valor de las empresas; más aún en las empresas de alta tecnología, donde el conocimiento es el activo fundamental. Cerca del 70 % de esos activos intangibles no se identifican o se negocian como un todo o como buena voluntad (goodwill), lo que trae como consecuencia su sobrevaloración o subvaloración, y a su vez, la ganancia o pérdida de las empresas. En este artículo se presenta cómo se está comportando la negociación de los activos intangibles a escala internacional, específicamente en la industria biofarmacéutica. Se muestran experiencias de Gran Bretaña y Francia como los países que han logrado mayor identificación de los activos intangibles (37 %), seguidos por los Estados Unidos. Solo Sudáfrica y China (entre los países en desarrollo) tienen un porcentaje representativo de activos intangibles identificados. Los contratos de investigación y desarrollo son los que más se negocian, seguidos por los acuerdos de licencia y las adquisiciones. En la colaboración Sur-Sur predominan los acuerdos de manufactura. En Cuba, el sector biotecnológico, como ex-ponente de las empresas de alta tecnología, cuenta con una gran fortaleza en tecnologías novedosas y productos únicos con patentes, que deben ser protegidos, no solo como propiedad intelectual, sino que deben ser valorizados y debidamente negociados. Por tanto, debe hacerse un diagnóstico sobre la negociación de los activos intangibles en el sector biotecnológico, y sobre esa base, proponer una estrategia para su negociación.

Desarrollo de biocatalizadores solubles e inmovilizados basados en una ß-fructosidasa recombinante termoestable que permite la inversión total de la sacarosa a temperaturas de pasteurización

Biocatalysts for the industrial production of invert sugar are preferred to stably operate at high sucrose concentrations and pasteurization temperatures. Thermotoga maritima ß-fructosidase (BfrA) is more thermostable and less susceptible to substrate inhibition than the current commercial invertase from Saccharomyces cerevisiae. In this research, the non-saccharolytic host Pichia pastoris was engineered for BfrA production. Fed-batch fermentation of the recombinant yeast for 72 h using cane sugar as a non-expensive energy source yielded cultures of cell densities over 100 g/L (dry biomass) with invertase activity exceeding 300 U/mL. BfrA was secreted to the cell periplasmic space and the culture medium as a fully active glycoprotein with unaltered thermostability. The extracellularly-released BfrA representing 85 % of the total proteins in the culture supernatant was either dried into powder to generate a soluble free enzyme biocatalyst (specific activity 15 000 U per gram of powder) or covalently immobilized on Glyoxyl-Sepharose CL 4B to generate an insoluble enzyme biocatalyst (specific activity 9249 U per gram of dry support) for reuse. As a third approach, the biomass bearing the periplasmic BfrA was submitted to a killing heat treatment and entrapped in calcium alginate beads to generate a reusable non-viable cell biocatalyst (specific activity 103 U per gram of dry beads). The three biocatalysts completely hydrolyzed cane sugar (70 %, w/v) in batchwise or continuous operation at 60 ºC, offering alternative cost-effective options for the industrial manufacture of food-grade inverted sugar syrup. This research granted the 2013 Award of the Cuban National Academy of Sciences.

El empleo de biocatalizadores termoestables en la producción industrial de sirope invertido es aún una meta por lograr. La enzima b-fructosidasa (BfrA) de Thermotoga maritima es más termoestable y menos susceptible a la inhibición por sustrato que la invertasa comercial de Saccharomyces cerevisiae. En esta investigación, Pichia pastoris se modificó genéticamente para producir BfrA. La levadura recombinante alcanzó densidad celular superior a 100 g/L (biomasa seca) y actividad invertasa por encima de 300 U/mL en fermentaciones de 72 h con el empleo de sacarosa como fuente barata de carbono. BfrA se secretó al periplasma celular y al medio de cultivo en forma de una glicoproteína totalmente activa y termoestable. BfrA con pureza de 85 % en el sobrenadante de cultivo se secó hasta polvo para generar un biocatalizador de enzima soluble (actividad específica 15 000 U/g peso seco) o se inmovilizó de forma covalente al soporte Glioxil-Sepharosa CL 4B para generar un biocatalizador insoluble (actividad específica 9249 U/g peso seco) que permita reuso. En un tercer enfoque, la biomasa celular fue sometida a un tratamiento térmico y encapsulada en esferas de alginato de calcio para generar un biocatalizador reusable de células muertas (actividad específica 103 U/g peso seco). Los tres biocatalizadores hidrolizaron completamente el azúcar de caña (70 % p/v) en operación continua o discontinua a 60 ºC, y ofrecen opciones alternativas rentables para la inversión enzimática del azúcar a escala industrial. Este trabajo mereció el Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba para el año 2013.

Inhibición de patrones moleculares asociados confiere una alta protección frente a hongos y oomicetos en las plantas

Crops of agricultural interest are highly affected by fungi- and oomycetes-caused diseases in Cuba and worldwide. The search for alternatives for its control continues, as a major challenge with the use of biotechnological techniques. In nature, plants are exposed to biotic stress and develop resistance against pathogenic infection through the fast activation of the innate immune system. Such an effective resistance response requires the detection and fast inhibition of the evolutionary conserved pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). These PAMPs comprise, among others, proteases and polygalacturonases, which mediate the initial pathogenicity mechanisms during infection that counteract the initial plant defensive responses. In this work, inhibitors of pathogen's proteases and polygalacturonases were developed to generate plant resistance against a wide spectrum of fungi- and oomycetes-caused diseases. Tobacco plants expressing a polygalacturonase inhibitor conferred, for the first time, high levels of resistance against this type of pathogens under field conditions. Additionally, a novel protease inhibitor effective against pathogens' proteases was identified and characterized, which also provided resistance against pathogenic oomycetes in plants. This research granted the 2013 Award of the Cuban National Academy of Sciences.

Las enfermedades provocadas por hongos y oomicetos en cultivos son las mayores limitantes en la producción agrícola a escala mundial. Buscar alternativas biotecnológicas para el control de estas enfermedades es el mayor reto de los investigadores de este tema. Las plantas están expuestas a estrés biótico, y resisten a la infección de agentes patógenos por medio de la activación del sistema de inmunidad innato. Esta activación depende de la rápida detección o inhibición de patrones moleculares conservados en muchos agentes patógenos. Los patrones moleculares asociados con agentes patógenos, como las proteasas y las poligalacturonasas, son mecanismos de patogenicidad utilizados por los agentes patógenos en el inicio de la infección, para vencer las defensas de la planta. Este artículo describe el uso de inhibidores de proteasas y poligalacturonasas de agentes patógenos para la resistencia de un amplio espectro de enfermedades provocadas por hongos y oomicetos en plantas. La expresión de un inhibidor de poligalacturonasas en plantas de tabaco permitió obtener, por primera vez, niveles elevados de resistencia a agentes patógenos en condiciones de campo. Además se identificó, caracterizó y analizó la función de un nuevo inhibidor de proteasa de agentes patógenos. Este inhibidor confirió altos niveles de resistencia a oomicetos patógenos de plantas. El trabajo mereció el Premio Anual de la Academia de Ciencias de Cuba, 2013.