Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto"

Modelo de herida infectada

Lic. Gladys María Valle Álvarez,1 Dra. Mercedes Ma. Décalo Michelena,2 Dra. Leysis McCook Noa,3 Tec. Marta Piloto Fernández,4 Tec. Caridad Sebazco Pernas5 y Tec. Vladimir Ruiz Alcorta6

Resumen

Se estableció un modelo biológico para reproducir una infección en heridas quirúrgicas por Staphylococcus aureus en 10 cobayos machos de la línea Hartley con un peso variable entre 269-320 g. Se realizaron colgajos curvos en la piel a cada lado de la línea media de aproximadamente 2 cm de diámetro y se aplicó con hisopo un cultivo bacteriano de Staphylococcus aureus procedente de un aislamiento clínico a una concentración de 2 x109 UFC. Seguidamente se suturó la piel en su posición normal y se evaluaron los signos de infección durante 72 h, al término de las cuales se realizó el sacrificio y la toma de muestra del tejido infectado para estudio histopatológico. Desde el punto de vista macroscópico se observó edema, rubor, exudación y absceso. Al estudio microscópico se encontró predominio de infiltrado agudo en toda la piel desde la epidermis y la dermis inferior que en el 30 % de los animales incluyó la muscular con presencia de fibrina. En el estudio microbiológico se recuperó Staphylococcus aureus con similar patrón antibiotipo al de la cepa inoculada. Estos resultados permiten concluir que bajo las condiciones de trabajo señaladas se logró la infección de heridas quirúrgicas, lo que coincide con lo reportado internacionalmente. Este modelo constituye una ayuda eficaz en estudios terapéuticos de las infecciones por este germen

Palabras clave. Staphylococcus aureus, herida quirúrgica, modelo experimental, cobayos.

Las infecciones de los tejidos pueden aparecer por efecto de un descenso de la capacidad de defensa local y con menos frecuencia de la sistémica. Las primeras barreras del huésped frente a la infección son la piel y la mucosa indemnes y sus productos de secreción-excreción. La lesión que producen las bacterias en los tejidos depende de su capacidad de adherirse y penetrar en las células huésped y producir toxinas bacterianas. La inflamación supurativa se caracteriza por aumento de la permeabilidad vascular e infiltración leucocitaria fundamentalmente con neutrófilos.1

Staphylococcus aureus es responsable de más del 80 % de las enfermedades supurativas que se encuentran en la práctica médica. Se asocian a enfermedades bronquiales adquiridas y genéticas, provocan la mayoría de las infecciones purulentas de la piel, pero también pueden invadir y producir infecciones severas en cualquier otro órgano del cuerpo, y ocasionar bacteriemia e infecciones graves en pacientes hospitalizados.2

En el ámbito de la medicina militar, la infección de las heridas se incluye dentro de los temas de interés médico-militar donde se presenta Staphylococcus aureus como un frecuente contaminante de heridas tanto en tiempo de guerra como en la paz.3

La concentración bacteriana es un factor que determina la aparición de infección en individuos inmunocompetentes. Bergamini en 1984 utilizó un inóculo de 1,5 108 UFC de Staphylococcus aureus en un modelo experimental de herida infectada.4

Posteriormente, Rottinger y otros señalan que para lograr infección en los tejidos blandos es necesario inocular una concentración bacteriana mayor de 2 x 109 UFC.5,6

El objetivo del presente trabajo fue reproducir estos resultados bajo nuestras condiciones experimentales dada la necesidad de contar con un modelo biológico que permitiera realizar estudios in vivo de heridas infectadas por este microorganismo.

Métodos

Se utilizaron 10 cobayos machos de la línea Hartley entre 269 y 320 g de peso, suministrados por el Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), los cuales se mantuvieron en cuarentena durante 7 días en el vivario del Laboratorio de Medicina Herbaria con suministro de agua y alimentos a libre demanda. En el momento del estudio se les rasuró las regiones lumbo-sacras, y se anestesiaron con pentobarbital sódico por vía intraperitoneal (i.p.) a la dosis de 40 mg/kg de peso corporal. Después de lavar la piel con agua y jabón, se realizó desinfección local con hibitane-alcohólico y posteriormente el área quirúrgica se cubrió con paños estériles, y se procedió a realizar colgajos curvos de 2 cm de base en forma de media luna a ambos lados de la línea media para lo cual se utilizó un instrumento creado por González-Quevedo y otros.7 Se resecó la piel con la grasa subyacente hasta exponer la aponeurosis y se hizo por electrocauterización una buena hemostasia. La herida derecha se inoculó por hisopado de los bordes cruentos de la piel, tejido graso y superficie aponeurótica con un crecimiento en caldo corazón de Staphylococcus aureus a una concentración de 2 x 109 UFC, y la herida izquierda se tomó como control no inoculado. Seguidamente se suturó con seda 3/0. Los animales se colocaron en cajas individuales con viruta estéril previa desinfección mecánica y química con fenol al 2 %. Las lesiones hísticas se observaron diariamente durante 72 h para detectar la aparición de rubicundez, aumento de volumen, formación de absceso y pus. El sacrificio se realizó por vía inhalatoria con dosis excesiva de halotane y se tomaron muestras para estudios histológicos y microbiológicos, previamente de la retirada de los puntos de las heridas. El corte de los tejidos se realizó en forma de tajada de melón.

Las muestras para los estudios histológicos se procesaron por inclusión en parafina, fueron coloreadas con hematoxilina-eosina y diagnosticadas en microscopio óptico profesional Carl Zeiss con lente 40 x. El estudio microbiológico se realizó por hisopado de la herida infectada a las 72 h de evolución y siembra en Agar Sangre y medio líquido de tioglicolato incubado por 24 h a 37 ºC.

Toda la investigación se realizó de acuerdo con las normas establecidas en la declaración de Helsinki de 1975 para animales de laboratorio.

Resultados

La observación de la evolución de las heridas controles e infectadas en los 10 animales estudiados mostró los siguientes resultados:

A las 24 h se observó una reacción inflamatoria caracterizada por rubor y calor debido a vasodilatación local en el 100 % de los animales estudiados.

A las 48 h se evidenció una ligera costra tanto en las heridas controles como en las heridas infectadas con un ligero aumento de volumen de estas últimas.

A las 72 h se observó la formación de tejido granuloso con coloración rosada en las heridas controles en el 100 % de los animales estudiados y en la herida infectada se notaban signos locales de inflamación: calor, rubor y ligero aumento de volumen. Al retirar los puntos, la zona se observaba húmeda con exudado amarillo-verdoso (pus) y en el corte más profundo se apreció zonas muy vascularizadas con la formación de absceso.

En el estudio histológico microscópico que se realizó a las 72 h de evolución de las heridas (figs. 1 y 2), se observó un predominio de infiltrado inflamatorio agudo constituido por leucocitos polimorfonucleares. Dos animales no presentaron signos de infiltración en las heridas controles y en siete de los 10 animales (70 %) este fue muy ligero. El análisis de los resultados histológicos obtenidos para las heridas infectadas demostró que estas presentaron una infiltración moderada a severa en ocho de los 10 animales en estudio (80 %) que afectó toda la piel desde la epidermis a la dermis inferior y en 3 de los 10 animales infectados (30 %) incluyó la muscular con presencia de fibrina.

FIG. 1. Corte histológico de la herida control. 40 x.

FIG. 2 Corte histológico de la herida experimental. 40 x.

En las muestras tomadas para estudio microbiológico del exudado de las lesiones se recuperó una cepa de Staphylococcus aureus con idéntico patrón antibiotipo al de la cepa inoculada.

Discusión

Estos estudios demostraron que una dosis de 2 x 109 reprodujo el efecto esperado en nuestras condiciones experimentales, lo que coincide con lo reportado por Rottinger y otros.

Los signos observados a las 24 h tanto en las heridas controles como en las heridas infectadas se explican por la lesión traumática ocasionada por el acto quirúrgico que provoca una reacción inflamatoria en los tejidos, caracterizada por vasodilatación local, aumento de la permeabilidad capilar con ligero escape de líquido y tumefacción hística.

Los resultados del cultivo microbiológico y las lesiones histológicas macroscópicas y microscópicas observadas a las 48 y 72 h de evolución demuestran la presencia de infección en los tejidos inoculados con Staphylococcus aureus, coco grampositivo que causa infección en quemaduras extensas y heridas quirúrgicas. Este germen tiene receptores de fibrinógeno y vitro nectina en su superficie, moléculas que utiliza como puente para unirse a las células endoteliales del huésped; además posee un receptor de láminas similares al de los tumores que permiten la unión de las bacterias a las proteínas de la matriz extracelular del huésped e invasión de los tejidos. Su virulencia se relaciona con la producción de toxinas y enzimas que dan origen a una respuesta inflamatoria en los tejidos infectados. La capacidad de sobrevivir en el interior de los leucocitos polimorfonucleares es otro mecanismo de virulencia que se reporta más recientemente y se ha relacionado con la aparición de infecciones persistentes.8

La presencia de absceso se explica por la existencia de una lipasa que degrada los lípidos de la superficie cutánea.1

Summary

Infected wound model

A biological model was established to reproduce an infection in surgical wounds due to Staphylococcus aureus in 10 male Hartley Guinea pigs with a variable weight between 269 and 320 g. Curve flaps were made in the skin at each side of the median line of approximately 2 cm of diameter and a bacterial culture of Staphylococcus aureus from a clinical isolation was applied with a brush at a concentration of 2 x 109UFC. Next, the skin was sutured in its normal position and the signs of infection were evaluated during 72 hours. After that, the sacrifice was carried out and a sample of the infected tissue was taken for histopathological study. From the macroscopic point of view, edema, rubor, exudation and abscess were observed. On the microscopic study, it was found predominance of acute infiltrate from the epidermis and inferior dermis that in 30 % of the animals included the muscular dermis with presence of fibrin. In the microbiological study, Staphylococcus aureus was recovered with an antibiotype pattern similar to that of the innoculated strain. These results allow to conclude that the infection of surgical wounds was attained under specific working conditions, which coincides with what is reported at the international level. This model is an efficient aid in the therapeutical studies of the infections caused by this germ.

Key words: Staphylococcus aureus, surgical wound, experimental model, Guinea pigs

Referencias Bibliográficas

1. Ramzi S, Contran MD. Robbins. Patología estructural y funcional. En: Enfermedades infecciosas. Madrid: Mc Graw Hill Interamericana; 1999. p. 356-66.

2. Mongodin E, Bajolet O, Hinnrasky J, Puchelle E, Bentzmann S. Cell wall associated protein A as a tool for human airway epithelium. J Histochem 2000; 28(4):523-34.

3. Reglamento para el Aseguramiento Médico de las Fuerzas Armadas Revolucionarias. Artículo 60. Capítulo II. La Habana: Dirección Política de las FAR. 1974.

4. Bergamini TM, Lamont PM, Cheadle WG, Polk HC. Combined topical and systemic antibiotic prophyloxis in experimental wound infection. Am J Surg 1984;147(6):753-6.

5. Rottinger W, Edgerton MT, Kurtz LD, Prusak M, Esich RF: Role of inoculation site as a determinant of infection in soft, tissue wounds. Am J Surg 1973;125(2):126-354.

6. Simmos RL, Adhernholz DH. Infecciones de la piel y de los tejidos blandos. En: Richard L, Simmos DM, Richard J. Infecciones quirúrgicas. La Habana: Ed. Científica Técnica; 1984. p. 523-8.

7. González-Quevedo M, Abela Cañizares I, Hurtado de Mendoza J, Larionova M, López-Calleja C. Estudio pre-clínico de acción cicatrizante que ejerce sobre las heridas abiertas los extractos inyectables confeccionados con variedades diferentes de Aloe que crecen en Cuba. En: Gonzalez-Quevedo M. Compendio de investigaciones sobre Aloe barbadensis Miller (sábila) cultivado en Cuba (I). La Habana: Dirección Política de las FAR; 1990. p.37.

8. Gresham HD, Lowrance JH, Caver TE, Wilson BS, Cheung AL, Lindberg FP. Survival of Staphylococcus aureus inside neutrophils contributes to infection. J Inmunol 2000;164(7):3713-22.

Recibido: 17 de enero de 2005. Aprobado: 17 de febrero de 2005.
Lic. Gladis María Valle Álvarez. Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto". Ave Monumental, Habana del Este, CP 11 700, Ciudad de La Habana, Cuba.

1Licenciada en Enfermería. Aspirante a Investigadora.
2Especialista de I Grado en Microbiología. Investigadora Agregada. Profesora Asistente.
3Especialista de I Grado en Anatomía Patológica.
4Técnica en Microbiología.
5Técnica A en Investigaciones Fisiológicas.
6Técnico en Medicina Veterinaria.