Artículo Original

Ocurrencia de Babesia spp. en perros sin dueño de La Habana, Cuba

Occurrence of Babesia spp. in stray dogs from Havana, Cuba

0000-0002-3246-1026Lisset Roblejo-Arias^{1  **}, 0000-0002-2035-1663Cristian Díaz-Corona^{1  **}, 0000-0001-7743-7794Adrian Alberto Díaz-Sánchez¹  , 0000-0002-8103-4821Evelyn Lobo-Rivero¹  , 0000-0002-0864-8034Roxana Marrero-Perera¹  , 0000-0002-6926-2194Elianne Piloto Sardiñas¹  , 0000-0002-2302-5361Belkis Corona-González¹  , 0000-0001-6137-3837Ernesto Vega-Cañizares^{1  *} 

¹Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, CP 32 700, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

RESUMEN

Los perros pueden ser afectados por varias especies del género Babesia que causan enfermedades importantes en diferentes regiones del mundo. Dentro de estas especies se encuentran Babesia canis, B. vogeli, B. rossi, B. gibsoni y B. vulves. El presente trabajo tuvo como objetivo detectar la presencia de Babesia spp. en perros sin dueño de La Habana. Se estudiaron 60 perros, a los que se les realizó examen hematológico, frotis sanguíneo y PCR, que amplifica el ARNr 18S. Tres animales (5 %) presentaron valores de hematocrito superiores a los valores de referencia y 23 (38,3 %) mostraron valores de hematocrito inferiores, lo que indica la presencia de un síndrome anémico en estos perros. Como resultado del leucograma, cinco perros (8,3 %) tenían leucocitosis y 7 (11,6 %) leucopenia; 31 animales estaban infestados con garrapatas Rhipicephalus sanguineus sensu lato y 10 estaban coinfestados con Rhipicepahalus microplus. El 20 % de las muestras fueron positivas por PCR, mientras que en la examinación microscópica solo en el 13,3 % de las muestras se observaron merozoitos de Babesia spp. Se observó relación entre los animales positivos por PCR y la disminución del valor del hematocrito. No existió asociación entre la presencia de garrapatas y el sexo en los animales positivos a Babesia spp. El presente estudio demuestra la presencia de Babesia spp. en perros sin dueño de La Habana.

Palabras-clave: Babesia spp.; hematocrito; anemia; frotis sanguíneo; PCR

ABSTRACT

Dogs can be affected by several species of the genus Babesia causing important diseases in different regions of the world. Among these species are Babesia canis, B. vogeli, B. rossi, B. gibsoni, and B. vulves. The aim of this study was to detect the presence of Babesia spp. in stray dogs from Havana province. Sixty dogs were studied and subjected to haematological examination, blood smear and PCR, which amplified 18S rRNA. Three animals (5 %) showed hematocrit values higher than reference values while 23 (38.3 %) showed lower hematocrit values, indicating the presence of an anemic syndrome in those dogs. According to the leukogram analysis, five dogs (8.3 %) had leukocytosis and 7 (11.6 %) had leukopenia. Thirty-one animals were infested with Rhipicephalus sanguineus sensu lato ticks and 10 were co-infested with Rhipicepahalus microplus ticks. Twenty percent of the samples tested positive by PCR, while microscopic examination revealed Babesia spp. merozoites in only 13.3 % of the samples. A relationship was observed between PCR-positive animals and the decrease in hematocrit value. There was no association between the presence of ticks and sex in animals positive to Babesia spp. The present study demonstrates the presence of Babesia spp. in stray dogs from Havana province.

Key words: Babesia spp.; hematocrit; anemia; blood smear; PCR

INTRODUCCIÓN

Los perros pueden ser afectados por varios patógenos transmitidos por garrapatas, como Erhrilichia canis, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys y varias especies del género Babesia que causan enfermedades importantes en perros de varias regiones del mundo. Dentro de estas especies se puede citar a Babesia canis, B. vogeli, B. rossi y B. gibsoni. (¹). Varias manifestaciones clínicas y los hallazgos de laboratorio como fiebre, anorexia, anemia y trombocitopenia se presentan en las infecciones con estos patógenos (²); además, en los frotis sanguíneos se puede observar la presencia de cuerpos compatibles con estos patógenos, de gran importancia en la medicina veterinaria (³).

Los ensayos de inmunofluorescencia son las pruebas de diagnóstico serológico más ampliamente utilizadas para la babesiosis canina en los últimos 30 años; sin embargo, la baja especificidad debido a las reacciones cruzadas entre Babesia spp. y otros parásitos ha sido un factor limitante para continuar con su uso (⁴). Los ensayos de PCR han aumentado en gran medida la sensibilidad y especificidad de la detección del parásito y se adaptan bien a estudios epidemiológicos y filogenéticos para el diagnóstico de la babesiosis (⁵).

En América Latina la babesiosis en perros es causada principalmente por Babesia vogeli y Babesia gibsoni (⁶-⁸). La enfermedad se ha reportado específicamente en América del Sur, mientras que los reportes de América Central son escasos. Se considera que en América Latina Babesia vogeli se transmite directamente por la picadura de la garrapata Rhipicephalus sanguineus s.l., mientras que B. gibsoni se pudiera transmitir a través de transferencia de sangre por mordeduras, transfusiones de sangre o por vía transplacental (⁹).

En Cuba, el género Babesia se ha informado en perros, pero su diagnóstico se ha basado en la observación de signos clínicos, hallazgos hematológicos, observación directa mediante frotis de sangre y la detección de anticuerpos a través de métodos serológicos (¹⁰). Estas técnicas no permiten realizar un diagnóstico certero, debido a la similitud de los síntomas clínicos con otros hemoparásitos que pueden afectar a los perros y la baja sensibilidad de estos métodos (¹¹,¹²).

González et al. (¹³) realizaron la primera detección molecular de B. vogeli infectando garrapatas R. sanguineus s.l. colectadas de perros con dueño y plantearon la necesidad de la detección de las especies de Babesia infectando perros, así como determinar la asociación de R. sanguineus s.l. en la transmisión de estos hemoparásitos en animales de compañía en Cuba; sin embargo, hasta la fecha no se han realizado estudios de este tipo en perros sin dueño, los cuales pueden constituir una importante fuente de infección de enfermedades transmitidas por garrapatas en las zonas urbanas y suburbanas de Cuba. El presente trabajo tuvo como objetivo detectar la presencia de Babesia spp. en perros sin dueño de La Habana.

MATERIALES Y MÉTODOS

Toma de muestras

Para la recolección de las muestras se realizó un estudio transversal, con una observación única, durante el periodo de septiembre de 2016 a julio de 2018, a 60 perros sin dueño, procedentes de 11 municipios de la provincia La Habana (Boyeros, Habana Vieja, Playa, Guanabacoa, Habana del Este, Arroyo Naranjo, Cotorro, Centro Habana, La Lisa, Marianao y 10 de octubre) que fueron capturados por el Centro de Control Contra las Zoonosis.

A los animales se les realizó examen físico y se les determinó la temperatura rectal. De cada animal se registraron los datos referentes a sexo y presencia de garrapatas.

Extracción de la sangre

La sangre se obtuvo mediante punción de la vena yugular, utilizando agujas hipodérmicas calibre 25 X 0,8 mm (21G) y tubos para extracción de sangre por sistema de vacío de 4 mL (BD Vacutainer®), con 7,2 mg de EDTA K2 como anticoagulante. Una parte de la sangre colectada se empleó para el análisis de los parámetros hematológicos y realización del frotis sanguíneo, y el resto se conservó en crioviales (Neogene) a -20^ºC para posteriormente realizar la extracción de ADN.

Análisis hematológico

Se determinó el hematocrito (Hto) y se realizó conteo de leucocitos totales (LT). Para determinar el hematocrito se utilizó una centrífuga de microhematocrito (JOVEL Hema-C). El conteo de LT se realizó mediante una cámara de Neubauer, con el empleo de ácido acético 2 % y sangre diluida 1/20. Los parámetros hematológicos se analizaron comparando con los valores de referencia descritos para la especie canina por Ettinger y Feldman (¹⁴). Todas las muestras se trabajaron en las primeras 24 horas después de la recolección. Los niveles de Hto se clasificaron con relación a la severidad de la anemia según lo descrito por Piratae et al. (¹⁵): ≥0,37 L/L (no anemia), 0,30-0,36 L/L (anemia media), 0,20-0,29 L/L (anemia moderada) y ≤0,20 L/L (anemia severa).

Colecta de garrapatas

El examen para la colecta de garrapatas se realizó según lo describen Shoorijeh et al. (¹⁶). De cada animal se trató de extraer al menos 10 de las garrapatas presentes.

Las garrapatas se retiraron manualmente y, en algunos casos, se utilizaron pinzas planas, que se colocaron tan cerca como fuera posible al capítulo de las garrapatas, para evitar el deterioro de la muestra. Las garrapatas colectadas se preservaron en etanol al 70 % y se transportaron al laboratorio en recipientes rotulados para su identificación en un microscopio estereoscopio (Leica, Wetzlar, Alemania). Para la identificación taxonómica se empleó la clave publicada por Nava et al. (¹⁷). Las garrapatas colectadas de cada animal se agruparon por especie, estadio y sexo; se depositaron en tubos plásticos estériles de 1,5 mL y se conservaron a -80°C para estudios posteriores.

Diagnóstico por frotis sanguíneo

Las extensiones se fijaron con metanol absoluto (Uni-Chem) y se tiñeron durante 30 minutos con Giemsa, según Holbrook et al. (¹⁸). La lectura se realizó en un microscopio óptico (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania), con lente de inmersión a una magnificación final de 1000X. Se analizaron 25 campos por lámina como mínimo, en la periferia del frotis sanguíneo (cola del frotis sanguíneo) para determinar la presencia de Babesiaspp. La identificación de estos hemoparásitos se realizó basada en parámetros morfológicos y biométricos, tales como la forma, la localización y el tamaño. Las formaciones compatibles con Babesia spp. se identificaron como inclusiones intracitoplasmáticas, ubicadas en los eritrocitos, en forma de peras, simples, pariadas o múltiples; según lo descrito por Lempereur et al. (¹⁹) o extracelulares, según Ćoralić et al. (²⁰).

Extracción y calidad del ADN

Se utilizaron 300 µL de sangre con anticoagulante para la extracción del ADN mediante el juego de reactivos Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, EE.UU), según las indicaciones del fabricante. El ADN se resuspendió en 100 uL de solución tampón de elusión (Promega). La calidad y concentración del ADN se determinaron en el equipo Thermo Scientific Nanodrop 2000 Spectrophotometer.

Para detectar la presencia de posibles inhibidores en el ADN extraído, se amplificó un fragmento del gen gapdh (gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa), según los cebadores y las condiciones de amplificación descritos por Birkenheuer et al. (²¹), que amplifican una región de 346-400 pb.

Diagnóstico de Babesia spp.

Se seleccionaron los cebadores descritos por Birkenheuer et al. (²¹) con los que se amplifica en un primer ensayo de PCR los genes ARNr 18S de Babesia y en un segundo ensayo de PCR se amplifica una región de aproximadamente 340 pb dentro de este gen (Tabla 1).

Tabla 1 Secuencia de los cebadores para la detección por PCR de Babesia spp. / Sequence of primers for the detection of Babesia spp. by PCR. 

Secuencia [5´……. 3´]	Gen a amplificar	Referencia
5´ GTTGATCCTGCCAGTAGT3´	ARNr 18S	Birkenheuer et al. (21)
5´AACCTTGTTACGACTTCTC3´
5´GTCTTGTAATTGGAATGATGGTGAC3´
5´ATGCCCCCAACCGTTCCTATTA3´

Como control positivo de los ensayos de PCR, se utilizó ADN de Babesia canis, gentilmente donado por el Laboratorio de Enfermedades Parasitarias de la Universidad Federal Rural de Rio de Janeiro (UFRRJ), Brasil.

Los ensayos de PCR se realizaron en un volumen final de 25 μL, conteniendo 1X GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison, EE.UU.), 0,8 μM de cada cebador. En el PCR1 se utilizaron 2 μL de ADN y en el PCR2 se utilizó 1 uL del PCR1. Todos los reactivos se manipularon en flujo laminar (Ikem), usando puntas con filtros (Eppendorf) resistentes a aerosoles. Las reacciones se desarrollaron en un termociclador Eppendorf Mastercycler gradient 96 (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania), y se utilizó un programa de amplificación que consistió en un ciclo de 95°C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de 95°C por 45 segundos, 58°C durante 30 segundos, 72°C por 45 segundos y una extensión final de 72°C durante 10 minutos.

Visualización de los resultados del PCR

Los resultados del PCR se aplicaron en geles de agarosa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EE.UU.) al 2% en tampón TBE 0,5X, se corrieron a 100 Volts y 50 mA en cámara de electroforesis Maxiphor 2012 (LKB, Bromma, Suecia), durante 35 minutos en tampón de corrida (TBE 0,5X). Los geles se tiñeron con Bromuro de Etidio (0,5 μg/mL) durante 15 minutos y los resultados se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta Macro Vue (Pharmacia Biotech Inc., EE.UU.). En todos los casos se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb (Promega, Madison, EE.UU.).

Análisis estadístico

Los datos se agruparon conformando una base de datos en Microsoft Excel 2016 (Microsoft Corporation, Redmond, WA). Se determinaron los estadígrafos de dispersión valor máximo, valor mínimo y su desviación estándar, así como el estadígrafo de tendencia central, valor medio, del Hto y los LT.

La prueba t de Student se utilizó para determinar si existían diferencias entre la media del valor del Hto de animales positivos y negativos a Babesia spp. por PCR. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas para p≤0,05. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para determinar si existía asociación entre las variables infestación por garrapatas y el sexo del animal, con la infección por Babesia spp. El análisis de los datos obtenidos se realizó con el empleo del Software R, Package stats version 3.6.0. (R Development Core Team, 2019) con un 95 % de intervalo de confianza (IC).

Consideraciones éticas

En todos los casos se emplearon los métodos de manejo y sujeción correctos para el procedimiento, según lo describe Radostits et al. (²²). Las muestras se colectaron por veterinarios clínicos; las normas éticas y de bienestar animal (Organización Mundial para la Sanidad Animal, 2010) se respetaron estrictamente. Se siguieron, además, los principios de la Guía Internacional para investigaciones biomédicas que involucran animales (²³).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De los 60 animales en estudio, 27 (45 %) eran hembras y 33 (55 %) machos. A la exploración clínica 13/60 (21,6 %) animales tenían temperaturas ≥ 39,5°C y no mostraban signos de deshidratación.

Tabla 2 Valores medio, máximo, mínimo y desviación estándar de los parámetros hematológicos determinados en sangre de perros sin dueño de La Habana. / Mean, maximum, minimum and standard deviation values of hematological parameters determined in the blood of stray dogs from Havana province. 

Parámetros	Hto	LT
Valores Normales	0,37-0,55 L/L	6-17 x10^9c/L
X ± DS	0,38 ± 0,10	10,21 ± 4,08
Vmax / Vmin	0,76 / 0,16	21,10 / 3,62

Leyenda: Vmin: Valor mínimo; Vmax: Valor máximo; X: media; DS: desviación estándar.

En la Tabla 2 se puede observar el comportamiento de los parámetros hematológicos. La media de los valores de Hto y LT estuvo entre los valores de referencia descritos para la especie canina por Ettinger y Feldman (¹⁴). Sin embargo, el valor mínimo para estos parámetros fue inferior y el valor máximo superior a los valores de referencia.

Al analizar los valores del Hto, tres (3/60) animales (5 %) presentaban valores superiores a los descritos por Ettinger y Feldman (¹⁴) y 34 (56,6 %) mostraron valores de hematocrito dentro de los valores de referencia. Se plantea que estos valores están presentes en caninos con un estado de salud aceptable o en aquellos casos donde existe una hemoconcentración producto a la deshidratación del animal, que puede incrementar en forma falsa los indicadores de la masa de glóbulos rojos. Este último criterio se reporta de manera común en perros callejeros (²⁴); sin embargo, en el presente estudio no se incluyeron animales con estado de deshidratación.

El 38,3 % de los animales analizados (23/60) mostraron un valor de hematocrito inferior a 0,37 L/L; 10 animales (16,6 %) tenían anemia media, 11 (18,3 %) anemia moderada y dos animales (3.3 %) anemia severa, según la clasificación descrita por Piratae et al. (¹⁵). La anemia en estos perros pudiera estar influenciada por la condición de perros callejeros, que carecen de una alimentación adecuada, y tienen mayor exposición a microorganismos patógenos causantes de pérdidas eritrocitarias.

El resultado del leucograma mostró que 5/60 (8,3 %) presentaron leucocitosis. Estos animales no disponen de cuidados apropiados ni atención médica periódica y están expuestos a un mayor número de enfermedades de diversos orígenes (bacterianas, virales y parasitarias), que pueden producir una estimulación del sistema inmune con un incremento de la serie celular blanca (²⁵). Según Buckner y Ewing (²⁶), durante la fase recuperativa de la babesiosis canina se observa lecocitosis.

Por otra parte, 7/60 (11,6 %) mostraron valores de leucocitos totales por debajo del valor de referencia. Según Mandal (²⁷), la leucopenia puede ser provocada por enfermedades virales, sin infección bacteriana secundaria, como la que se presenta en el moquillo canino, la hepatitis infecciosa canina y el parvovirus canino, algunas infecciones bacterianas como toxemias bacterianas, septicemia provocada por salmonelosis y toxoplasmosis aguda; la anafilaxis, las neoplasias de la médula ósea, entre otras patologías. Buckner y Ewing (²⁶) plantearon que la leucopenia puede estar presente en las primeras etapas de la babesiosis canina.

A la exploración clínica, 31/60 animales (51,6 %) estaban infestados con garrapatas. Se colectaron 69 garrapatas adultas (30 hembras y 39 machos) y tres ninfas de R. sanguineus s.l. (Figs. 1 y 2). Un resultado inesperado fue la casi ausencia de formas inmaduras en la colecta. Es posible que algunas larvas y las ninfas puedan haber sido ignoradas por el examen realizado, pues al tratarse de perros sin dueño, estos se crían más libremente y no están acostumbrados al manejo, lo que pudo dificultar el examen; sin embargo, si hubiera existido infestaciones masivas de larvas y ninfas, aún en estas condiciones de colecta, no se habrían perdido. En este caso, es posible que el corto período de muestreo estuvo fuera de temporada para larvas y ninfas de R. sanguineus s.l. Resultados similares fueron obtenidos por Szabó et al. (²⁸), que estudiaron las especies de garrapatas presentes en perros en Brasil y solo encontraron cuatro ninfas de R. sanguineus s.l. en un perro de un área urbana.

Figura 1 Garrapata Rhipicephalus sanguineus s.l. (hembra) colectada de uno de los perros en estudio. / Rhipicephalus sanguineus s.l. tick (female) collected from one of the dogs under study. 

Figura 2 Garrapata Rhipicephalus sanguineus s.l. (macho) colectada de uno de los perros en estudio. / Rhipicephalus sanguineus s.l. tick (male) collected from one of the dogs under study. 

La garrapata R. sanguineus s.l. tiene una distribución cosmopolita y el perro constituye el principal hospedero de esta especie en áreas rurales y urbanas (⁶,²⁹). En islas del Caribe como Granada, Trinidad, Saint Kitts y Nevis, Martinica, Aruba, Puerto Rico y Haití se reporta una alta frecuencia de aparición de esta especie de garrapata en perros (⁹,³⁰-³³). En Cuba, Pérez-Vigueras (¹⁰) reportó la presencia de la garrapata R. sanguineus en todo el país; sin embargo, Barros-Battesti et al. (³⁴) notificaron que esta especie se encuentra distribuida geográficamente hacia la zona occidental de Cuba.

Investigaciones recientes sugieren que R. sanguineus es un taxón con una definición morfológica incierta y se han reunido evidencias irrefutables que respaldan la existencia de un complejo de especies bajo el nombre R. sanguineus s.l., cuyo número de especies en todo el mundo aún no se ha determinado. Esta hipótesis sugiere que el estado taxonómico de R. sanguineus podría requerir revisión (³⁵).

En 10 de los perros donde se encontró R. sanguineus s.l. también se colectaron 15 garrapatas adultas hembras y dos ninfas de Rhipicephalus microplus. Estos perros pudieron estar en contacto con otros animales (hospederos principales) infestados con esta especie de garrapata y convertirse en hospederos accidentales. Resultados similares se obtuvieron por Szabó et al. (²⁸), que en 140 perros en estudio, cinco estaban infestados con R. microplus y uno tenía infestación mixta con R. sanguineus s.l. Según estos autores, esto podría deberse a que los perros tuvieron intercambio de hábitat con otros animales domésticos o salvajes que actúan como hospederos principales de R. microplus.

A pesar de que R. microplus es la garrapata del ganado bovino, estudios realizados por Ueti et al. (³⁶) demostraron que es capaz de ser infectada eficientemente por Theileria equi durante la infección aguda y persistente y transmitirlo de forma intraestadial y transestadial a caballos. Estos resultados evidencian la capacidad vectorial de esta garrapata de transmitir patógenos a hospederos accidentales.

En el presente estudio se realizaron los frotis sanguíneos a partir de sangre venosa con anticoagulante, teniendo en cuenta que, con excepción de las especies de Babesia, como Babesia bovis que se acumulan en los capilares y los tejidos, el resto de las especies de Babesia se diagnostica mejor en frotis de sangre venosa con anticoagulante, que en frotis de sangre capilar colectada de la oreja o de la cola (¹⁹). Es importante conocer que los microorganismos como Babesia spp. están presentes frecuentemente en los márgenes de los frotis de sangre, ya que los eritrocitos que contienen parásitos tienden a migrar a los márgenes durante la preparación del frotis (³⁷).

Se observó que 7/60 animales (11,6 %) presentaron formaciones intraeritrocíticas compatibles con Babesia spp. (Fig. 3).Este diagnóstico se basó en las características morfológicas y estructurales descritas para estos hemoparásitos por Lempereur et al. (¹⁹). Se visualizaron microorganismos intraeritrocíticos en forma de pera en pares o simples. Según estos autores, estas características morfológicas permiten la identificación preliminar de B. canis, B. vogelio B. rossi; sin embargo, se necesita la realización de técnicas moleculares para poder tener una identificación certera de la especie que está presente.

Figura 3 Visualización de cuerpos intraeritrocitarios compatibles con Babesia spp. en frotis sanguíneos de dos perros en estudio. / Visualization of intraerythrocytic inclusion bodies compatible with Babesia spp. observed in blood smears from two dogs under study. . 

En un animal (1/60) (1,6 %) se observaron merozoitos extracelulares; resultados que coinciden con los descritos por Izzi et al. (³⁸) y Ćoralić et al. (²⁰), quienes encontraron trofozoitos de Babesia spp. en eritrocitos de perros, de forma individual, en parejas o en grupos de cuatro, y también extracelularmente de forma oval a piriforme y que se concentraron principalmente en el borde de los frotis. Izzi et al. (³⁸) determinaron por PCR en tiempo real que se trataba de B. vogeli.

En la presente investigación, 8/60 (13,3 %) de los animales resultaron positivos a Babesia spp. mediante visualización de los frotis sanguíneos. Ćoralić et al. (²⁰), en un estudio realizado en 144 perros con dueño que presentaban signos y síntomas compatibles con hemoparasitosis, encontraron que el 80 % de los animales fueron positivos por examinación de los frotis sanguíneos.

Babesia spp. grandes, previamente se consideraba que eran B. canis, pero en la actualidad están divididas en tres especies separadas: B. canis, B. vogeli y B. rossi (³⁹). B. canis, transmitida por Dermacentor reticulatus, es la especie de Babesia más común en Europa y Asia y se describe que puede aparecer simple o pareada, pero usualmente aparece pareada y las formas piriformes tienen un tamaño entre 2,5-3 X 5 µm. En las regiones tropicales y subtropicales R. sanguineus s.l. es el vector de B. vogeli, una especie grande, que puede aparecer simple o pareada con un tamaño de 2,5 X 4,5 µm, siendo menor que B. canis. B. rossi se describe en regiones de África y se transmite por Haemaphysalis elliptica (formalmente H. leachi) (⁴⁰). Esta especie también puede aparecer en forma de peras simples o pareadas con un tamaño similar a B. vogeli.

B. gibsoni y B. vulpes son piroplasmas pequeños, que también pueden causar babesiosis en perros (¹⁹). B. gibsoni se describe en Asia, Estados Unidos y Europa, con un tamaño de 1,2-2 X 2-3,2 µm y con formas piriformes o ameboides. B. vulpes está descrita en varios países de Europa y se observa en forma de pera simple con un tamaño de 2,5 X 1 µm (⁴¹).

Barros-Battesti et at. (2009) describieron la presencia en Cuba de nueve especies de Ixodes. Entre las garrapatas que pueden transmitir a los perros las especies de Babesia mencionadas con anterioridad, solo está presente en Cuba R. sanguineus s.l. González et al. (¹³) describieron la presencia de B. vogeli en garrapatas R. sanguineus s.l. colectadas de perros con dueño de La Habana mediante ensayos de PCR anidado. Teniendo en cuenta estos precedentes y los resultados obtenidos de la visualización de los frotis sanguíneos, se pudiera inferir que la especie que se visualizó seaB. vogeli; pero estos resultados tienen que ser confirmados con ensayos de PCR especie-específicos y secuenciación, debido a que el rango geográfico de piroplasmas infectando perros parece estar expandiéndose, la ubicación no debería utilizarse como único criterio para la identificación de especies o subespecies (²¹).

Según Miró et al. (⁴²), mediante la visualización de los frotis sanguíneos no es posible realizar la diferenciación de las especies. En la India, las enfermedades transmitidas por garrapatas se han diagnosticado por métodos que utilizan la observación microscópica de frotis de sangre; sin embargo, Amritpal et al. (⁴³) plantean que este método no permite la identificación confiable de la especie.

En lo que respecta al diagnóstico de babesiosis canina, el examen microscópico directo del frotis de sangre teñido es el método más comúnmente utilizado, ya que es factible de realizar, pero no necesariamente detecta los parásitos en perros con infecciones no aparentes o crónicas, debido a que el nivel de parasitemia es muy bajo (⁴⁴). En el presente estudio, por tratarse de perros callejeros, resulta difícil poder determinar la presencia de la mayoría de los signos clínicos relacionados con la babesiosis canina. Según Quiroz (⁴⁵), en los casos crónicos la fiebre falta totalmente o puede observarse en los primeros días de la enfermedad o es de tipo intermitente en algunos casos.

La microscopía sigue siendo la más simple y accesible prueba de diagnóstico para la mayoría de los veterinarios y, durante la fase aguda, la microscopía de infecciones es razonablemente sensible para detectar parásitos intraeritrocíticos en frotis de sangre teñidos con Giemsa o con tinción de Wright, pues permite la diferenciación entre las babesias grandes y las pequeñas. Sin embargo, para poder determinar la especie se necesitan herramientas moleculares (⁴²).

Todos los ADN tenían la concentración y calidad requeridas para ser utilizados en ensayos de PCR, según el análisis por espectrofotometría. Con el ensayo de PCR para el gen gapdh, en todas las muestras se amplificó un fragmento entre 346 y 400 pb, lo que demuestra que no hay presencia de inhibidores y que los ADN tienen la calidad requerida para ser usados en ensayos de PCR.

Como resultado del diagnóstico molecular mediante PCR, 12/60 (20 %) animales resultaron positivos a la presencia de Babesia spp. En todas las muestras positivas se visualizó una banda de 340 pb, lo que se corresponde con lo descrito para este ensayo por Birkenheuer et al. (²¹). Resultados similares se describieron por Agustine et al. (246), cuando emplearon este ensayo para el diagnóstico de Babesia spp. en perros naturalmente infectados de Kerala, India.

El gen ARNr 18S es el gen más comúnmente utilizado para el diagnóstico de Babesia spp. y de las especies, debido a su conservación y la repetición dentro del genoma que proporciona una amplia cantidad de ADN blanco para ser amplificado mediante PCR (⁴⁷). Para la identificación de las especies se pueden utilizar ensayos de PCR anidado especie-específicos (²¹) o métodos moleculares alternativos (⁴⁸-⁵⁰).

En la detección de Babesia spp. el frotis sanguíneo mostró un bajo desempeño con respecto al PCR. El 20 % de las muestras fueron positivas por PCR, mientras que en la examinación microscópica solo en el 13,3 % de las muestras se observaron merozoitos de Babesia spp. Resultados similares se obtuvieron por O’Dwyer et al. (⁵¹), pues reportaron el 8 % de las muestras positivas por PCR y solo en el 2 % se observaron los merozoitos de Babesia spp.

Los resultados obtenidos por ambas técnicas corroboran que el frotis sanguíneo no es una prueba diagnóstica lo suficientemente sensible para la identificación de animales en la fase crónica de la enfermedad, ya que no necesariamente detecta los parásitos en perros con infecciones no aparentes o crónicas, debido a que el nivel de parasitemia es muy bajo (⁴⁴).

La Tabla 3 muestra una comparación de las medias del valor del Hto entre los animales positivos y negativos a Babesia spp. por PCR. La media del Hto de los animales positivos a Babesia spp. está por debajo de los valores de referencia. Los animales negativos tienen una media del valor del hematocrito estadísticamente significativa superior a la media de los animales positivos.

Tabla 3 Comparación de los valores de hematocrito entre animales positivos y negativos a Babesia spp. por PCR. / Comparison of hematocrit values between animals positive and negative to Babesia spp. by PCR. . 

Variable	PCR	n	Media	Mediana	D.S.	E.E.	p
Hto (0,37-0,55 L/L)	Negativos	48	0,399	0,400	0,102	0,0147	0,02
	Positivos	12	0,319	0,350	0,0974	0,0281

D.S.: Desviación estándar; E.E.:Error estándar

Se observa una relación entre los animales positivos y la disminución del valor del Hto que coincide con los resultados encontrados por Avinash et al. (⁵²), quienes reportaron una disminución estadísticamente significativa del valor del Hto, el recuento total de eritrocitos y la concentración de hemoglobina en perros positivos a Babesia spp. en comparación con perros sanos.

Según Ćoralić et al. (²⁰), la anemia y el íctero se pueden tener en cuenta como parámetros clínicos que indican fuertemente infección por Babesia spp. La anemia puede ser causada por efectos mecánicos, inmunológicos y tóxicos del parásito, lo que provoca ictericia como consecuencia de la lisis de los eritrocitos. La hemólisis de eritrocitos infectados, debido al daño directo inducido por parásitos,es un hallazgo bien documentado en la babesiosis canina.

Estos resultados son similares a los obtenidos por Jain et al. (⁵³), quienes compararon los valores medios del Hto, el recuento total de eritrocitos y la concentración de hemoglobina con los valores de referencia reportados por Meinkoth et al. (⁵⁴) y revelaron que la anemia y la trombocitopenia eran evidentes en las infecciones crónicas por B. gibsoni. Además, plantearon que las alteraciones hematológicas significativas y la posibilidad de no detectar los parásitos por la microscopía convencional, debido a la baja sensibilidad de este ensayo en las etapas iniciales de la enfermedad, exige el uso de un protocolo de PCR sensible para la detección rápida de la infección y la selección de opciones de tratamiento oportunas.

A pesar de que la leucopenia se considera como uno de los signos presentes en la babesiosis, específicamente para B. canis (²⁵), en el presente estudio solo tres animales positivos a Babesia spp. tenían leucopenia, lo que coincide con los resultados obtenidos por Ćoralić et al. (²⁰).

El estudio de asociación entre el sexo de los animales y la presencia de garrapatas con la infección por Babesia spp. mostró que no existe asociación entre las variables evaluadas para un valor de p=1 (Tabla 4).

Tabla 4 Asociación de las variables en estudio con la presencia de Babesia spp. en perros callejeros de La Habana. / Association of the variables under study with the presence of Babesia spp. in stray dogs in Havana province. 

		PCR
Variables independientes	Categorías	Positivos	Negativos	Total	Prueba exacta de Fisher	p
Garrapatas	Sí	6	25	31	0.921	1.000
	No	6	23	29
	Total	12	48	60
Sexo	Femenino	7	26	33	1.18	1.000
	Masculino	5	22	27
	Total	12	48	60

*Diferencias estadísticamente significativas (p<0,05).

Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Singh et al. (⁵⁵), pues no encontraron diferencias estadísticamente significativas (p≤0,05) entre el sexo y la infección por Babesia spp. en perros de la India. Estos autores plantean que existen otros factores de riesgo como la edad (animales jóvenes) y la época del año (verano) que sí influyen de forma directa en la presencia de Babesia spp. en perros.

En el caso de la infestación por garrapatas, Galay et al. (⁵⁶) también reportaron que no existía asociación entre esta variable y la infección por Babesia spp. La garrapata R. sanguineus es nidícola y endófila, por lo que prefiere vivir en interiores en contacto cercano con su huésped. Los perros con hogar que viven en lugares con alta población de garrapatas tienen una mayor probabilidad de infestarse repetidamente que los perros callejeros que se mueven constantemente de un lugar a otro, lo que pudiera explicar los resultados encontrados en esta investigación. Cabe destacar que los perros callejeros pueden ser vehículos para las garrapatas y difundirlas; de esta manera contribuyen a la propagación de las hemoparasitosis, por lo que la prevención de la babesiosis canina, así como cualquier enfermedad transmitida por garrapatas, se logra eliminando la posibilidad de exposición al vector mediante un control activo del ambiente (⁵⁶).

Las manifestaciones clínicas de la babesiosis canina varían con la especie del agente infeccioso, así como con la edad, el estado inmune y la fase de la enfermedad. B. rossi es altamente patogénica, provoca anemia hemolítica y complicaciones graves que incluyen signos neurológicos, fallo renal agudo y edema pulmonar. Las infecciones por B. vogeli son normalmente subclínicas en perros adultos, pero puede ser fatal en animales de tres a cuatro meses de edad. Las infecciones por B. canis, B. gibsoni y B. conradae cursan como enfermedad media a severa (⁴⁰).

Frente a la posibilidad de hallazgos clínicos no característicos de una enfermedad en específico, se recomienda a los veterinarios considerar la parasitosis por Babesia spp. y realizar un análisis parasitológico seguido de la detección molecular y la determinación de las especies (⁵⁷,⁵⁸).

Hasta donde los autores conocen, este es el primer estudio de detección Babesias pp. en perros sin dueño de Cuba y demuestra la necesidad de investigaciones futuras dirigidas a determinar la especie, con estudios adicionales sobre los vectores que la pueden transmitir.

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Recibido: 04 de Noviembre de 2020; Aprobado: 12 de Marzo de 2021

^*Autor para la correspondencia: Ernesto Vega Cañizares. E-mail: [e-mail].

Conflicto de Intereses: Los autores declaran que no existen conflictos de intereses relacionados con el presente artículo.

^**

Los autores Lisset Roblejo-Arias y Cristian Díaz-Corona tuvieron la misma contribución.

Contribución de los autores: Lisset Roblejo-Arias: participó en el diseño y ejecución de los experimentos, en el análisis de los resultados y en la escritura del documento. Cristian Díaz-Corona: participó en el diseño y ejecución de los experimentos, en el análisis de los resultados y en la escritura del documento. Adrian Alberto Díaz-Sánchez: participó en el diseño y ejecución de los experimentos y en el análisis de los resultados. Evelyn Lobo-Rivero: participó en la escritura y revisión del documento. Roxana Marrero-Perera: participó en la realización de los experimentos. Elianne Piloto Sardiñas: participó en la realización de los experimentos. Belkis Corona-González: participó en el diseño de los experimentos y en la escritura y revisión del documento. Ernesto Vega-Cañizares: participó en el diseño y realización de los experimentos y en la escritura y revisión del documento. Todos los autores revisaron y aceptaron la versión final del documento.