Rev Cubana Med Trop 1996;48(1)

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Validación de un ultramicroELISA de detección de anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B

Dra. LICEL RODRIGUEZ,¹ Dr. ANGEL BALMASEDA,¹ Dr. JOSE BRAVO,² Lic. JANETTE TRUJILLO,³ Lic. LETICIA MARTINEZ,⁴ Dr. ROLANDO OCHOA,⁵ Dr. MANUEL DIAZ,⁶ Lic. JOSE LAFERTE⁷ y Téc. FRANCISCO RAMOS⁸

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¹ Especialista de I Grado en Microbiología. Investigador Agregado. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).
² Especialista de I Grado en Bioestadística. Investigador Auxiliar. IPK.
³ Licenciada en Microbiología. Aspirante a Investigadora. Centro de Inmunoensayo (CIE).
⁴ Licenciada en Bioquímica. Especialista B de Laboratorio. CIE.
⁵ Especialista de I Grado en Inmunología. CIE.
⁶ Especialista de I Grado en Epidemiología. Investigador Agregado. Subdirector de Epidemiología. IPK.
⁷ Licenciado en Bioquímica. Investigador Agregado. IPK.
⁸ Técnico Medio en Microbiología. IPK.

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RESUMEN

Se presentan los resultados del estudio de validación del ensayo ultramicroanalítico de detección de anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (UMELISA anti-HBsAg), que se realizó comparando los resultados obtenidos, con el juego diagnóstico comercial Hepanostika anti-HBsAg. Se utilizaron para ello sueros procedentes de los ensayos clínicos de la vacuna recombinante cubana contra la hepatitis B. Con el primer panel de sueros (n = 300) se obtuvo el 93,1 % de sensibilidad, el 98,5 % de especificidad y una concordancia del 94,3 %. El coeficiente de correlación indicó una tendencia similar de los resultados (p < 0,01) y no se encontraron diferencias significativas en el título promedio geométrico (TPG) entre ambos ensayos (p 0,05). Con el segundo panel (n = 100), realizado en el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK) y el Centro de Inmunoensayo (CIE) simultáneamente, se obtuvo una sensibilidad del 96,25 % en ambos centros, una especificidad del 75 % en el IPK y del 90 % en el CIE y una coincidencia del 92 y 95 %, respectivamente. El coeficiente de correlación mostró valores similares y no hubo diferencias significativas entre las TPG alcanzadas por los 2 métodos (p 0,05). Los resultados obtenidos en general muestran la validez del nuevo ensayo y la factibilidad de su utilización en la práctica, ya sea para el seguimiento de la infección o para la realización de ensayos clínicos de evaluación de vacunas.

Palabras clave: ELISA/métodos; ANTIGENOS DE SUPERFICIE DE LA HEPATITIS B/análisis; ANTICUERPOS ANTIHEPATITIS/análisis; VACUNAS SINTETICAS; VACUNAS CONTRA HEPATITIS B; JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO; ENSAYOS CLINICOS.

INTRODUCCION

Al nivel internacional el avance logrado en el campo de la hepatitis viral tipo B ha sido notable, merece destacarse la existencia de pruebas sensibles para la búsqueda de indicado res de la infección y la obtención de vacunas inmunogénicas; no obstante, la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) y sus secuelas continúan siendo un gran problema en la Salud Pública.

En la actualidad se encuentran disponibles varios ensayos comerciales para la detección de los diferentes marcadores del VHB, los inmu noensayos enzimáticos constituyen uno de los métodos más universalmente empleados.1-5 El anticuerpo contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (Anti-HBsAg) es un marcador de importancia en el monitoreo de la infección, para el pesquisaje de individuos de alto riesgo y en los estudios pre y posvacunales, donde el conocimiento cuantitativo preciso del anti-HBsAg juega un papel importante en múltiples aspectos de estos ensayos.

Con la tecnología SUMA (ultramicroELISA de 10 mL) se han desarrollado diversos ensayos en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, cuya evaluación ha probado las múltiples ventajas del método.6-10 El sistema UMELISA de detección del anti-HBsAg, cuya técnica se basa en un principio de inhibición, permite la cuantificación de estos anticuerpos en Unidades Internacionales por litro (UI/L) con la utilización de una curva calibrada con el antisuero de referencia de la OMS, lo cual facilita su comparación con los juegos diagnósticos internacionales disponibles.

Nosotros reportamos los resultados de la evaluación del UMELISA anti-HBsAg mediante su comparación con el juego comercial Hepa nostika anti-HBs Ag de la firma Organon Tech- nika empleando sueros de individuos vacunados incluidos en los diferentes ensayos clínicos de fases I y II de la vacuna recombinante cubana contra la hepatitis B.

MATERIAL Y METODO

DISEÑO MUESTRAL
 
Se disponía de 2 233 muestras de sueros conservados a temperatura de menos de 70 oC, los cuales procedían de los ensayos clínicos de fases I y II de la vacuna recombinante cubana contra la hepatitis B (Heberbiovac HB) y habían sido procesados el año anterior, mediante el juego comercial Hepanostika anti-HBsAg.

De este total, 1 425 (63,81 %) procedían de individuos vacunados en los cuales se confirmó la presencia del anti-HBsAg y 808 (36,18 %) pertenecían al pesquisaje prevacunal requerido para comenzar el ensayo clínico (se excluyeron los casos con los marcadores HBsAg y anti-HBsAg).

Panel 1 (n = 300). A partir de una tabla de números aleatorios, se seleccionaron 300 sueros al azar, tanto positivos como negativos, y se procedió a recodificarlos de forma tal que sus resultados no fueran conocidos por el laboratorio.

Panel 2 (n = 100). De forma similar, por medio de una tabla de números aleatorios se seleccionaron los sueros pero, en este caso, en 2 grupos (positivo y negativo) para garantizar un porcentaje fijo de los negativos (20 %). Cada suero se distribuyó en 2 viales para ser analiza dos por los laboratorios del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK) y del Centro de Inmunoensayo (CEI), simultánea mente. Igualmente al panel anterior, los sueros se recodificaron para que no fueran reconocidos por los laboratorios. En este panel los resultados se obtuvieron por duplicado en cada laboratorio.
 
UMELISA ANTI-HBsAg
 
La técnica se basa en un principio de inhibición, que consta de 2 pasos:

1. Incubación de la muestra de suero con una cantidad fija de HBsAg (12 +/- 2 UI/mL de HbsAg subtipo ad de origen plasmático) a la temperatura de 37 oC durante 16 a 24 horas. Si ésta contiene anticuerpos específicos, bloquearán los determinantes antigénicos.
2. Reacción inmunoenzimática en la cual el HBsAg libre de la muestra preincubada se une a los anticuerpos monoclonales que recubren la placa incluida en el estuche. La posterior adición de un conjugado anti- -HBsAg con fosfatasa alcalina y un sustrato fluorescente (4 metilumbeliferil fosfato), evidenciará la reacción producida.

La lectura, validación e interpretación de los resultados son realizados automáticamente mediante el programa UMELISA anti-HBsAg ingresado al equipo SUMA.

La curva de calibración se construye con el control positivo de 50 UI/L de anti-HBsAg (calibrado frente al patrón de la OMS) y un control de 25 UI/L, que se obtiene diluyendo a la mitad el patrón suministrado. Los resultados pueden calcularse hasta 10 UI/L extrapolando la recta obtenida anteriormente.

Los resultados de las muestras se calculan interpolando el porcentaje de actividad inhibioria correspondiente sobre la curva de calibración. La fórmula utilizada es la siguiente:

% AI = 100 - (F/Fo x 100)

donde:

% AI= porcentaje de actividad inhibitoria.

F =promedio de las fluorescencias de las muestras.

Fo =promedio de las fluorescencias del control negativo.

Cuando el valor extrapolado es inferior a 10 UI/L, el resultado se expresa como < 10 UI/L; cuando es superior a 50 UI/L, se expresa como 50 UI/L, en este último caso es necesario la dilución de la muestra a cuantificar.
 
ELISA HEPANOSTIKA ANTI-HBsAG (ORGANON TECHNIKA)
 
Los resultados obtenidos con este juego comercial en los ensayos clínicos de la vacuna cubana, constituyeron el "criterio de la verdad" en la validación del sistema UMELISA anti- HBsAg. Esta técnica se realizó siguiendo las instrucciones adjuntas. Es un sistema ELISA basado en un principio de inhibición.
 
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS
 
Se calcularon los porcentajes de sensibilidad, especificidad y concordancia usando como técnica de referencia a Hepanostika anti- HBsAg.

Se calculó el coeficiente de correlación (r) entre los valores obtenidos por los 2 métodos, el título promedio geométrico (TPG) y un intervalo de confianza con el 95 % de confiabilidad. Se utilizó además el Indice de Kappa (K) para determinar la concordancia entre los laboratorios del IPK y del CIE.

RESULTADOS

Los criterios de validación de un sistema diagnóstico son necesarios ya que la tecnología se encuentra cambiando o mejorando constante mente y es esencial para establecer la confiabilidad del método en cuestión. Parámetros tales como sensibilidad, especificidad, coincidencia y reproducibilidad del análisis son importantes para definir su aceptación.

En la tabla 1 se exponen los resultados obtenidos con el UMELISA anti-HBsAg tomando como criterio de la verdad a Hepanostika anti-HBsAg. En un total de 300 sueros (panel 1) se obtuvo una sensibilidad del 93,1 %, una especificidad del 98,5 % y una concordancia del 94,3 %.

TABLA 1. Resultados obtenidos con UMELISA anti-HBsAg y HEPANOSTIKA anti-HBsAg. Panel 1

Hepanostika	+	-	Total
S +	217	1	218
U
M
A -	16	66	82
Total	233	67	300

Sensibilidad 93,1 %. Especificidad 98,5 %. Coincidencia 94,3 %.

El coeficiente de correlación entre los valores obtenidos por los 2 métodos fue de r = 0,86 (p < 0,01). El TPG de los sueros con anticuerpos fue de Xg= 115,7 UI/L por Hepa- nostika y Xg = 91,9 UI/L por UMELISA. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las medias geométricas (p 0,05). Los intervalos de confianza, con el 95 % de confiabilidad, fueron [81,7; 163,9] por Hepanostika y [69,3; 121,9] por UMELISA.

En las tablas 2 y 3 se recogen los resultados obtenidos en la evaluación del segundo panel en el IPK y el CIE respectivamente. En el IPK se logró el 96,25 % de sensibilidad, el 75 % de especificidad y el 92 % de coincidencia. En el CIE los resultados del panel se igualan en sensibilidad, no así en la especificidad que se eleva al 90 % y una coincidencia del 95 %.

TABLA 2. Resultados obtenidos con UMELISA anti-HBsAg y HEPANOSTIKA anti-HBsAg. Panel 2. IPK

Hepanostika	+	-	Total
S +	77	5	82
U
M
A -	3	15	18
Total	80	20	100

  Sensibilidad 96,25 %. Especificidad 75 %. Coincidencia 92 %. TABLA 3. Resultados obtenidos con UMELISA anti-HBsAg y HEPANOSTIKA anti-HBsAg. Panel 2. CIE

Hepanostika	+	-	Total
S +	77	2	79
U
M
A -	3	18	21
Total	80	20	100

  Sensibilidad 96,24 %. Especificidad 90 %. Coincidencia 95 %.

El coeficiente de correlación resultó de la siguiente forma: IPK - Hepanostika r = 0,89; CIE - Hepanostika r = 0,89 e IPK - CIE r = 0,91 (p < 0,01).

Al hallar los TPG de los sueros con anticuerpos obtuvimos los siguientes resulta dos: Hepanostika Xg = 161,66 UI/L, IPK Xg = 138,52 UI/L y CIE Xg= 129,24 UI/L; no se demostraron diferencias estadísticamente signi-ficativas cuando se comparan las medias obtenidas por UMELISA (IPK y CIE) y Hepanostika (p 0,05), ni tampoco entre las medidas alcanzadas por el método UMELISA (IPK y CIE) entre sí (p 0,05). Los intervalos de confianza con el 95 % de confiabilidad fueron [86,62; 221,48] por UMELISA-IPK y de [78,60; 202,96] por UMELISA-CIE. El índice de Kappa entre los resultados en el IPK y el CIE con el segundo panel fue de k= 0,52.

DISCUSION

Al analizar los parámetros señalados en los resultados, nos percatamos que la sensibilidad y la coincidencia es alta en ambos paneles y se comportan de manera similar con fluctuaciones insignificantes, no así la especificidad que es muy alta en el primer panel y disminuye su valor a 75 y 90 % con el segundo en el IPK y el CIE, respectivamente. Al revisar los resultados del laboratorio una vez decodificados los datos observamos que 2 de los sueros positivos por UMELISA y menores de 10 UI/L por Hepanos tika, en el primer análisis fueron menores de 10 UI/L y en el duplicado eran positivos (S1= 12,8 UI/L y S2= 10,8 UI/L), en el resulta do final fueron considerados como positivos de título bajo; en el caso que hubiéramos dado estos 2 resultados como menores de 10 UI/L, la especificidad se hubiera elevado al 85 % y se acercarían más a los resultados finales de ambos laboratorios.

El coeficiente de correlación (r) entre ambos métodos es muy bueno lo que nos demuestra tendencias similares entre ellos.

Si analizamos las TPG obtenidas en ambos paneles, observamos que siempre con el UMELISA se recogen valores absolutos ligera mente inferiores al de Hepanostika; sin embar go, en la literatura revisada se plantea que los compuestos fluorescentes pueden ser detectados o medidos incluso cuando están presentes en cantidades extremadamente pequeñas,11 lo que aumenta la sensibilidad de los inmunoensayos, de ahí el amplio uso de los sustratos fluorigénicos.12 Nosotros pensamos que los valores inferiores, aunque no significativos, de los TPG obtenidos por el UMELISA anti-HBsAg en relación con los de Hepanostika es debido al tiempo (1 año) que medió en la realización de ambos ensayos; que, aunque los sueros se encontraban congelados a una temperatura estable; siempre se afecta el título de anticuer pos en esto coincidimos con algunos autores que han observado de forma general una disminución del título de anticuerpos en sueros congela dos a través del tiempo.13,14

Lo anterior explica el resultado de por lo menos 15 de los 16 sueros negativos por UMELISA y positivos por Hepanostika en el panel 1 (Tabla 4); se observa que un solo suero poseía títulos por encima de 100 UI/L, el resto estaba por debajo de esta cifra, con valores extremos de 12 y 63 UI/L y media de 35,2 UI/L. El indice de Kappa obtenido indica una buena concordancia y asociación entre los resultados del segundo panel en el centro productor y el evaluador, a pesar de la diferencia en la especificidad.

TABLA 4. Títulos por HEPANOSTIKA anti-HBsAg en los 16 sueros negativos por UMELISA anti-HBsAg. Panel 1

	Hepanostika	Suma
No.	UI/L	UI/L
1	151	< 10
2	36	< 10
3	63	< 10
4	20	< 10
5	38	< 10
6	16	< 10
7	20	< 10
8	35	< 10
9	16	< 10
10	12	< 10
11	20	< 10
12	56	< 10
13	41	< 10
14	59	< 10
15	56	< 10
16	40	< 10

 
Los métodos de validación incluyen todos aquellos procedimientos requeridos para demostrar que un método en particular es confiable para la aplicación propuesta,15 y por tanto asegura que el bioensayo es aplicable al estudio problema y garantiza que los lotes subsiguientes tengan similares características.

Teniendo en cuenta estos criterios, nosotros concluimos que el UMELISA anti-HBsAg es un método útil para la detección y cuantificación de los anticuerpos anti-HBsAg, que requiere gran precisión de los instrumentos y equipos necesarios para su realización, es confiable y relativa mente fácil de ejecutar y por tanto avalamos su utilización para el monitoreo de la infección por el virus de la hepatitis B y en ensayos clínicos de vacunas.

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Recibido: 10 de agosto de 1995. Aprobado: 29 de octubre de 1995.

A.R. Bahrmand. Deparment of Microbiology, Pasteur Institute, Tehran-Iran.