Rev Cubana Med Trop 1996;48(1)

Comunicación Breve

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Secuenciación directa de un producto amplificado de una muestra de suero

Lic. MAYLING ALVAREZ,¹ Dra. MARÍA G. GUZMAN,² Dra. DELFINA ROSARIO,³ Lic. SUSANA VÁZQUEZ,⁴ Lic. JOSÉ L. PELEGRINO,⁵ Dr. CARLOS A. SARIOL⁶ y Dr. GUSTAVO KOUR⁷

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¹ Licenciada en Microbiología.
² Doctora en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología. Investigadora y Profesora Titular. Jefa del Departamento de Virología.
³ Especialista de I Grado en Microbiología. Investigadora Agregada.
⁴ Licenciada en Bioquímica. Investigadora Auxiliar.
⁵ Licenciado en Biología. Investigador Agregado.
⁶ Especialista de I Grado en Microbiología.
⁷ Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología. Profesor e Investigador Titular. Director del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí".

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RESUMEN

Se reporta la secuencia nucleotída y aminoacídica de una zona de gran variabilidad en el genoma del virus dengue 2 a partir del ARN del virus original sin pase en ningún sistema de aislamiento y se compara con la primera cepa de dengue 2 aislada durante la epidemia de 1981 con 4 pases en ratón lactante. Los resultados demuestran que la secuencia nucleotídica del suero y de la cepa A15 son iguales.

Palabras clave: VIRUS DEL DENGUE/genética; GENOMA VIRAL; ARN/sange; ADN/sangre; REACCION EN CADENA POR POLIMERASA; SECUENCIA DE BASES/genética; SECUENCIA DE AMINOACIDOS/genética.

La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) revolucionó la biología molecular al permitir obtener niveles elevados de ADN que pueden ser caracterizados al nivel molecular sin la propagación extensiva del virus y sin necesidad de realizar el clonaje molecular.1

En América, en el transcurso de este siglo no se habían comunicado casos de fiebre hemorrágica del dengue síndrome de choque del dengue (FHD/SCD) hasta 1981 en Cuba, donde se produjo un brote causado por el virus tipo 2, el cual afectó al país completo y produjo un gran número de casos y muertes. Esta epidemia fue la primera de este tipo reportada en la región de Las Américas y probablemente la mayor epidemia ocurrida en el mundo, la que abrió un nuevo capítulo.2

Las variaciones de los virus del dengue han sido estudiadas por secuenciación nucleotíca de los genes virales. El análisis de una pequeña secuencia genómica permite la determinación de la variabilidad genética y una clasificación geográfica rápida de los aislamientos de dengue. Deubet et al.3 estudiando una zona del gen de la envoltura (aa 22-97) que codifica para un péptido hidrofílico, reportaron 5 grupos genotípicos con menos del 6 % de divergencia nucleotídica. Las secuencias nucleotídicas mostraron cambios significativos entre variantes pertenecientes a un mismo serotipo.

Con el objetivo de obtener el ARN del virus original sin pase en ningún sistema de aislamiento y emplearlo en el estudio de la secuencia nucleotídica y aminoacídica de una zona de gran variabilidad en el genoma del virus dengue 2 que codifica la proteína de la envoltura, y compararla con la secuencia de la primera cepa de dengue 2 (cepa A15) previamente estudiada en esta zona y aislada durante la epidemia de 1981 de un paciente con fiebre del dengue (FD), se estudiaron 14 muestras de suero de la fase aguda de pacientes con FD y FHD conservadas a -70 oC desde el año 1981. A cada una de estas muestras se le realizó extracción de ARN, síntesis de cADN y PCR según Deubel et al.3 usando un par de cebadores específicos para el serotipo 2; considerando que este serotipo fue el agente causal de esta epidemia (22 cepas de dengue 2 fueron aisladas).

La tabla compara los resultados del aislamiento viral con los del PCR. El ARN del virus fue detectado por PCR en 12 muestras. En 7 (58,3 %) de ellas, el virus de dengue 2 fue previamente aislado en 1981 usando ratones lactantes y la línea celular LLCMK2. Este hecho demuestra la mayor sensibilidad del PCR con respecto a los sistemas de aislamiento emplea dos.

TABLA. Comparación de los resultados obtenidos por aislamiento con los obtenidos por PCR  

Días de evolución	No. de la enfermedad	Caso clínico	Aislamiento	PCR
37	7	FD	Negativo	Positivo
38	10	DH	Positivo	Positivo
48	<7	FD	Positivo	Positivo
49	<7	DH	Positivo	Positivo
86	1	FD	Positivo	Positivo
90	2	FD	Negativo	Positivo
91	3	FD	Negativo	Positivo
95	1	FD	Negativo	Positivo
97	1	FD	Negativo	Positivo
101	1	DH	Positivo	Positivo
106	1	FD	Negativo	Positivo
108	1	FD	Positivo	Positivo
109	2	FD	Positivo	Negativo
111	1	FD	Positivo	Positivo

 
Se seleccionó para secuenciar la muestra 49, en la cual se había aislado e identificado el virus dengue 2 en el año 1981 y detectado en cADN por PCR en este estudio con un rendimiento elevado. Además, por ser este suero de un paciente con FD al igual que la cepa A15. La figura muestra la comparación de la secuencia nuclotídica y aminoácida del ARN con la cepa A15.

La secuencia nucleotídica presente en el suero 49 y la de la cepa A15 son iguales (figura). Este resultado sugiere que al menos en esta zona de alta variabilidad genética no se produjeron cambios en la primera cepa aislada en 1981, a pesar de tener 4 pases en ratón lactante tal cual ha sido reportado por Rico-Hesse.4

Cuando la secuencia nucleotídica fue comparada con la secuencia de otras cepas de dengue 2 (dato no mostrado), ésta mostró gran similitud con cepas viejas de Nueva Guinea, 1944; Tailandia, 1964; Sri Lanka, 1968 y Burma, 1976.5

Este resultado da evidencias adicionales a los previos reportes de similitud de la cepa cubana de dengue 2 con cepas viejas del Sudeste de Asia. Estos factores virológicos y la situación epidemiológica particular de Cuba en 1981 probablemente determinaron la severidad de esta epidemia.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Recibido: 24 de julio de 1995. Aprobado: 8 de noviembre de 1995.

Lic. Marité Bello. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.