Rev Cubana Med Trop 1996;48(2)

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Estimación del título de anticuerpos IgG a Adenovirus utilizando una curva patrón y un ensayo de ultramicroELISA indirecto

Lic. JOSE LAFERTE, Lic. CLARA SAVON, Dr. ANGEL GOYENECHEA, Lic. VALEXIS VAZQUEZ, Lic. ANSELMO OTERO, Téc. YAISEL TEJERO y Téc. BARBARA HERNANDEZ⁶

RESUMEN

Se logró normalizar un procedimiento que combinaba un ensayo de ultramicroELISA indirecto con una curva patrón y que permitió estimar el título de anticuerpos IgG a Adenovirus en muestras de suero humano utilizando una sola dilución de éstos. Basándose en el título a punto final previamente determinado para un panel de 117 muestras de suero, se seleccionaron 90 de éstas (r² = 0,98) para construir 4 curvas patrones que relacionaron el logaritmo natural de las respuestas de fluorescencia y el logaritmo natural del título a punto final para un rango amplio de diluciones del suero (1:40 hastra 1:320). Se seleccionó la curva correspondiente a la dilución 1:40 del suero (r² = 0,81), la cual posibilitó una óptima utilización de los accesorios diseñados para la manipulación de los volúmenes en el rango ultramicro y, por tanto, la automatización de todo el procedimiento. Los resultados obtenidos con respecto a la técnica de fijación del complemento (100 % de sensibilidad y 97,3 % de especificidad) respaldan la utiización de este método como una herramienta complementaria en la ejecución de estudios seroepidemiológicos a gran escala y con fines diagnósticos.

Palabras clave: IGG/análisis; ANTICUERPOS ANTIIDIOTIPICOS/análisis; ADENOVIRUS HUMANO/análisis; ELISA/métodos; TESTS DE FIJACION DE COMPLEMENTO; ANALISIS DE REGRESION.

INTRODUCCION

Los ensayos inmunoenzimáticos sobre fase sólida han sido ampliamente utilizados en los estudios serológicos de las enfermedades infecciosas, éstos presentan un gran número de ventajas sobre la mayoría de los procedimientos convencionales utilizados para este fin.^1,2 La cuantificación de los niveles de inmunoglobulinas mediante este método ha sido realizada utilizando diluciones dobles de las muestras de suero^3-5 o mediante dilución única de éstas en conjunción con una curva patrón. Este último ha sido aplicado a un gran número de agentes virales, que incluyen el virus de la influenza, virus sincitial respiratorio, citomegalovirus, virus de la parotiditis, Adenovirus, Rotavirus y el virus del Herpes Simple.^6,10 En este caso las muestras de suero son evaluadas en una sola dilución y los resultados son convertidos a título de anticuerpos,^2,11 unidades arbitrarias¹⁰ o unidades internacionales¹² por referencia a una curva patrón.

En nuestro laboratorio el desarrollo del sistema SUMA¹³ ha permitido la incor-poración de los ultramicroELISA fluorescentes (UMELISAS) a la serología de varias entidades virales y los resultados han sido expresados tanto cualitativa como cuantitativamente.^14-17

En este trabajo se presentan los resultados obtenidos en la aplicación del método de la curva patrón para la estimación del título de anticuerpos IgG a Adenovirus utilizando una sola dilución de las muestras de suero y un ensayo de ultramicroELISA indirecto. Se discute la utilidad del método en la realización de estudios seroepidemiológicos a gran escala y con fines diagnósticos.

MATERIAL Y METODO

Antígeno. Se empleó el mismo antígeno preparado para el ensayo de UMELISA indirecto según la metodología reportada por Savón et al.¹⁸

Muestras de suero. Se evaluó un total de 819 muestras de suero, divididas en 4 grupos.

El grupo 1 comprendió 117 monosueros pertenecientes a niños (entre 0 y 14 años) los cuales presentaban enfermedades somáticas no respiratorias. Estas muestras fueron previamente tituladas en el UMELISA indirecto para la detección de anticuerpos IgG a Adenovirus¹⁸ y posteriormente utilizadas para determinar el título a punto final de cada suero mediante un análisis de regresión lineal individual. Se seleccionaron 90 de estas muestras para construir 4 curvas patrones a las diluciones de 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320.

Un segundo grupo de 50 muestras de sueros pareados pertenecientes a adultos con sospecha de infección respiratoria aguda (IRA) en las cuales se había determinado el título de anticuerpos a Adenovirus mediante UMELISA indirecto utilizando diluciones dobles de las muestras de suero, fue seleccionado al azar con el objetivo de comparar los títulos obtenidos con aquéllos observados por el método de la curva patrón utilizando una sola dilución de las muestras de suero.

El grupo 3 estuvo conformado por 222 mo-nosueros de niños con una edad entre 0 y 14 años, los cuales presentaban infecciones somáticas no respiratorias. Estas muestras fueron utilizadas para la comparación de los títulos de anticuerpos a Adenovirus detectados por UMELISA y la técnica de fijación del complemento (FC').

Con el objetivo de comprobar la efectividad del método de la curva patrón en la detección de la infección reciente por este agente, se realizó un estudio a doble ciegas por UMELISA y FC'. Este estudio incluyó un cuarto grupo constituido por 190 pares de sueros los cuales representaron el 73,3 % de las muestras de adultos enviadas a nuestro laboratorio durante los meses de septiembre a diciembre de 1994 para el diagnóstico serológico de las IRA.

TECNICA DE FIJACION DEL COMPLEMENTO (FC')

Se utilizó la técnica de fijación del complemento recomendada por Palmer et al,¹⁹ los resultados se interpretaron de acuerdo con las normas establecidas para ésta.

UMELISA

El procedimiento se basó en el ensayo de UMELISA indirecto descrito por Savón et al.¹⁸ Las muestras de suero previamente diluidas (1:40, 1:80, 1:160, 1:320) en tampón Tris 15 mM pH 7,8; que contenían suero de carnero normal al 5 %, fueron incubadas sobre placas de cloruro de polivinilo (PCV SUMA) previamente sensibilizadas con antígeno y el control de antígeno a una concentración de 30 mg/mL en tampón carbonato-bicarbonato pH 9,6. Un conjugado antiIgG humana/fosfatasa alcalina fue utilizado en una dilución 1:2 000 en el mismo diluente de las muestras de suero. En estos 2 pasos las placas fueron incubadas 30 minutos a 37 °C en cámara húmeda. El sustrato fluorigénico de la fosfatasa alcalina fue adicionado en las placas a razón de 10 mL/pozo en una concentración final de 0,13 mg/mL en tampón dietanolamina pH 9,8. Las placas se incubaron 30 min a temperatura ambiente en cámara húmeda y la fluorescencia resultante fue estimada en un fluorímetro de la serie SUMA modelo 321. Los resultados fueron expresados en tantos por cientos de fluorescencia según la relación:

F = delta M/delta P

Delta M: diferencia de la fluorescencia obtenida con el antígeno y el control de antígeno para las muestras de suero.

Delta P: diferencia de la fluorescencia obtenida con el antígeno y el control de antígeno para el suero control positivo.

Determinación del título de anticuerpos a Adenovirus en el UMELISA mediante diluciones seriadas de las muestras de suero. El título de anticuerpos a Adenovirus para cada suero fue estimado seleccionando la dilución más alta de las muestras de suero para el cual el valor de fluorescencia (F) era mayor o igual que el valor de corte previamente utilizado para este UMELISA.¹⁸

Determinación del título a punto final de las muestras de suero en el UMELISA mediante un análisis de regresión lineal. El título de anticuerpos a punto final a Adenovirus (TPF) fue determinado con el gráfico del valor de corte del UMELISA (0,366) en un análisis de regresión lineal entre el logaritmo natural de los valores de F y el logaritmo natural del recíproco de las diluciones para cada muestra de suero. Los títulos obtenidos se agruparon en 5 grupos, los cuales oscilaron desde menor de 1:40 hasta mayor de 1:320. Se seleccionaron 90 sueros (r² mayor o igual que 0,98) para construir 4 curvas patrones que relacionaban el logaritmo natural de F con el logaritmo natural del título a punto final para cada una de estas muestras a las diluciones de 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320 respectivamente, según Van Loon et al.¹¹

ANALISIS ESTADISTICO

Se utilizó un análisis de regresión lineal con transformación logarítmica de los datos y una prueba de correlación por rangos de Sperman's. Los tantos por cientos de sensibilidad, especificidad y concordancia con el método de referencia fueron calculados según Griner et al.²⁰

RESULTADOS

Determinación del título de anticuerpos a punto final a Adenovirus (TPF) mediante UMELISA. La figura 1 muestra un análisis de regresión lineal entre el logaritmo natural de los valores de F y logaritmo natural del recíproco de las diluciones de suero, para uno de los 90 sueros seleccionados. Graficando el logaritmo natural del valor de corte del UMELISA (0,366) en la línea de regresión, se obtiene directamente el valor del logaritmo natural del TPF, el cual fue analíticamente calculado por la ecuación de regresión. El rango de títulos para estos 90 sueros (r² = 0,98) coincidió con el obtenido mediante diluciones seriadas de las muestras de suero.

Determinación del título de anticuerpos a Adenovirus en el UMELISA utilizando una sola dilución de las muestras de suero. Los títulos de cada suero fueron calculados utilizando una curva patrón de 90 sueros (figura 2) cuya ecuación de regresión resultó en:

Y = -1,2467 + 0,53814X

Con un r = 0,90 y un r² = 0,81 para el cual los valores de F correspondían con la dilución 1:40 de las muestras de suero.

Los valores de r y r² para el resto de las curvas consideradas (1:80, 1:160 y 1:320) fueron respectivamente 0,91 y 0,82; 0,95 y 0,90; y 0,93 y 0,86.

Comparación de los títulos de anticuerpos obtenidos por la curva patrón y los obtenidos mediante diluciones seriadas de las muestras de suero en el UMELISA. La comparación entre ambos métodos utilizando un total de 50 muestras de sueros pareados seleccionados al azar dentro de un grupo de adultos con sospecha de infección respiratoria aguda mostró un coeficiente de correlación por rangos de Sperman's (r_s) de 0,95 para una p < 0,001.

Comparación de los títulos de anticuerpos obtenidos por la curva patrón en el UMELISA y los obtenidos mediante la técnica de fijación del complemento. La tabla 1 muestra la comparación entre ambos métodos utilizando un total de 222 monosueros de niños con infecciones somáticas no respiratorias. Por UMELISA, el 91,4 % de las muestras de suero (203/222) presentaron títulos de anticuerpos mayores o iguales que 1:40, con un título promedio geométrico (TPG) de 75,6 . En contraste, sólo el 74,3 % (165/222) resultó positivo por la técnica de FC', con un TPG de 5,9. Los resultados de ambas técnicas no mostraron correlación (r_s = 0,227 para una p < 0,001) y los títulos de anticuerpos por UMELISA resultaron muy superiores a los de la FC'.

TABLA 1. Comparación de la curva patrón del UMELISA y la técnica de FC' utilizando 222 monosueros de niños con infecciones somáticas no respiratorias

	FC'	Curva patrón
Monosueros evaluados	222,0	222,0
Monosueros positivos	165,0	203,0
Positividad (%)	74,3	91,4
TPG	5,9	75,6

TPG: Título promedio geométrico.

Evaluación de la efectividad del método de la curva patrón para detectar la infección reciente por Adenovirus en muestras de sueros pares. La tabla 2 muestra los resultados obtenidos cuando se validó en nuestro laboratorio el método de la curva patrón después de un período de 4 meses de ensayos. Teniendo en cuenta que para ambas técnicas el criterio de seroconversión o infección reciente por Adenoivirus fue un incremento de 4 veces o más en el título de anticuerpos detectado entre el primero y el segundo sueros, el UMELISA con respecto a la FC'presentó el 100 % de sensibilidad y el 97,3 % de especificidad y coincidencia. La FC'detectó el 1 % de positividad (2/190), en tanto el UMELISA detectó el 3,6 % (7/190). Los títulos de anticuerpos de-tectados por ambos métodos en el total de sue-ros pares analizados no mostraron, al igual que para los monosueros, una buena correlación (r_s = 0,316 para una p < 0,001), los estimados por la curva patrón del UMELISA fueron muy superiores a los detectados por la FC'.

DISCUSION

El ELISA ha sido una técnica de elección para realizar la serología de los Adenovirus. Lo anterior ha estado condicionado a la elevada sensibilidad y especificidad de este método, así como a la rapidez, facilidad de ejecución y posibilidad de automatización del procedimiento, las cuales lo convierten en una atractiva alternativa para la ejecución de estudios a gran escala. Adicionalmente, este ensayo no sólo permite la estimación del título de anticuerpos IgG e IgM simultáneamente,^18,21 sino además la detección específica de los diferentes serotipos de Adenovirus los cuales han sido asociados con diversas infecciones.²²

En el presente estudio se logró normalizar un procedimiento que, combinando un ensayo de UMELISA indirecto con una curva patrón, permite la estimación del título de anticuerpos IgG a Adenovirus en monosueros y muestras de sueros pares. El método resulta fácil de ejecutar, requiere sólo 10 mL de muestras y reactivos y los resultados son obtenidos en un tiempo máximo de 90 min.

Cuando se aplicó este método se encontró una regresión lineal entre el logaritmo natural de las respuestas de fluorescencia de las muestras de suero y el logaritmo natural del título a punto final para un rango amplio de las diluciones del suero, lo cual había sido previamente reportado con los valores de absorbancia y los títulos de anticuerpos en varios sistemas de microELISA con la utilización de diferentes antígenos.^23,24

A pesar de que otros autores han referido la necesidad de utilizar en ensayos de ELISA diluciones altas de las muestras de suero para evitar el fenómeno de saturación y la interferencia de otras inmunoglobulinas,⁷ en nuestro caso la selección de la dilución 1:40 para las muestras de suero no ofreció estos inconvenientes y resultó la más adecuada entre las otras diluciones evaluadas en las condiciones del UMELISA, y proporcionaba una óptima utilización de los accesorios diseñados para la manipulación de los volúmenes en el rango ultramicro y por tanto la automatización total del procedimiento.

La comparación entre el método de la curva patrón y el método tradicional que realiza diluciones seriadas de las muestras de suero mostró una adecuada correlación; no obstante, el primero eliminó los errores inherentes a la preparación de diluciones dobles de éstas al aumentar el número de muestras que pueden ser procesadas en cada placa y por ser además más sensibles en la detección al expresar la variación de los títulos de anticuerpos como una magnitud continua. La no coincidencia de estos métodos está focalizada en aquellos valores muy cercanos al valor de corte, donde se ha reportado una pérdida de la sensibilidad para el método de titulación tradicional.¹⁷

La funcionalidad del método de la curva patrón en la detección de la infección reciente por Adenovirus fue corroborada al evaluar un total de 190 pares de sueros de adultos enviados a nuestro laboratorio para el diagnóstico serológico de las IRA durante un período de 4 meses. Con respecto a la FC' se obtuvo una sensibilidad del 100 %. El UMELISA detectó 5 seroconversiones que no fueron detectadas por la FC' para una especificidad y concordancia del 97,3 % (tabla 2).

TABLA 2. Comparación de la curva patrón del UMELISA y la técnica de FC' utilizando 190 pares de suero de adultos con sospecha de IRA

FC'	UM	ELISA
Pares evaluados	190,0	190,0
Pares positivos	5,0	7,0
Positividad (%)	2,6	3,6

Goffrey et al.²¹ utilizando un panel de 20 monosueros de individuos sanos no encontraron una buena correlación entre los títulos de anticuerpos determinados por el ELISA, la IFI y la FC', los títulos de anticuerpos eran muy superiores para la técnica del ELISA. En nuestro caso a pesar de utilizar una muestra mayor y de composición heterogénea (222 mo-nosueros de niños sanos y 190 pares de sueros de adultos con sospecha de IRA), tampoco se encontró una buena correlación entre los títulos de anticuerpos detectados por la curva patrón del UMELISA y la FC', el TPG de los monosueros en el UMELISA era 12,8 veces mayor que el observado para la FC'.

La baja sensibilidad de la FC'en la detección de anticuerpos IgG ha sido previamente reconocida²⁵ y algunos autores han atribuido las diferencias en la reactividad de esta técnica con respecto al ELISA o la IFI, al hecho de utilizar diferentes antígenos; así, en la FC' se utilizan extractos que contienen predominantemente antígenos grupo específicos de todos los Adenovirus, en tanto la IFI o el ELISA pueden resultar más sensibles al utilizar células o extractos de células donde pueden estar presentes antígenos de subgrupo, tipo y subtipo específico.²¹ Lo anterior unido a lo engorroso que resulta el procedimiento de la FC', la ponen en franca desventaja cuando se compara con técnicas rápidas y precisas como los inmunoensayos.¹⁸

El procedimiento reportado en este trabajo representa una alternativa práctica para la estimación del título de anticuerpos IgG a los Adenovirus en monosueros o muestras de sueros pares, y puede ser adaptado a la serología cuantitativa de otros agentes infecciosos. Los resultados obtenidos respaldan la utilización de este método en nuestro laboratorio como una herramienta complementaria en la ejecución de estudios seroepidemiológicos a gran escala y con fines diagnósticos.

La adopción de esta metodología y la distribución de un suero patrón podrían facilitar la comparación de los resultados entre los diferentes laboratorios de la red UMELISA.

SUMMARY

It was possible to standardize a procedure which combined an indirect microELISA assay with a standard curve and that allowed to estimate the titre of IgG antibodies to Adenovirus in samples of human serum, using only one dilution of these. Based on the end-point titre previously determined for a panel of 117 serum samples, we selected 90 of these samples (r² = 0,98) to build 4 standard curves that related the natural logarithm of the fluorescence responses to the natural logarithm of the end-point titre for a wide range of serum dilutions (1:40=1:320). It was selected the curve corresponding to serum dilution 1:40 (r² = 0,81), which made possible an optium utilization of those accessories designed to handle the volumes in the ultramicro range and, therefore, the automation of the whole procedure. The results obtained as regards the complement fixation test (100 % of sensitivity and 97,3 % of specificity) support the use of this method in our laboratory as a complementary tool to carry out seroepidemilogical studies on a large scale and with diagnostic ends.

Key words: IGG/analysis; ANTIBODIES, ANTIIDIOTYPIC/analysis; ADENOVIRUSES; HUMAN/analysis; ENZIME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY/methods: COMPLEMENT FIXATION TEST; REGRESSION ANALYSIS.

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Recibido: 21 de agosto de 1995. Aprobado: 11 de abril de 1996.

Lic. José Laferté. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.