Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Comparación de la línea NCI-H292 con otras líneas continuas para la multiplicación de virus respiratorios

Lic. LUIS MORIER,¹ Lic. LISSETTE PÉREZ,² Dr. REYNEL CANCIO,³ Lic. CLARA SAVÓN,⁴ Lic. ZOILA GONZÁLEZ⁵ y Dr. ANGEL GOYENECHEA⁶

RESUMEN

La línea continua NCI-H292 de células mucoepidermoides de pulmón humano ha sido reportada ser de utilidad para la propagación de muchos virus, principalmente Adenovirus y Paramyxovirus. Se plantea la posible sustitución de cultivos primarios de riñón de mono por NCI-H292 para el aislamiento de dichos agentes. En el presente trabajo se evalúa la utilidad de esta nueva línea para la multiplicación de los virus sincitial respiratorio, Adenovirus 3 y 7 y los virus parainfluenza 1, 2 y 3 en comparación con las líneas celulares continuas utilizadas tradicionalmente para la propagación de éstos; para lo cual se inocularon cepas de los virus en cuestión en las líneas Vero, HEp-2 y HeLa, según sus sensibilidades conocidas, y en NCI-H292 paralelamente. La multiplicación viral se detectó por aparición de efecto citopático o por hemadsorción. Como resultado se corroboró la capacidad de multiplicación de la línea NCI-H292 para los Adenovirus 3 y 7 y el parainfluenza 3, siendo más útil para la multiplicación de éstos que las líneas tradicionalmente usadas.

Palabras clave: VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO; INFECCIONES POR PARAMYXOVIRUS; INFECCIONES POR ADENOVIRUS; LÍNEA CELULAR; CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS; NEOPLASMAS PULMONARES; ADENOVIRUS HUMANO/aislamiento & purificación; VIRUS DE LA PARAINFLUENZA/aislamiento & purificación.

INTRODUCCIÓN

NCI-H292 es una línea continua de células mucoepidermoides obtenida a partir de un carcinoma de pulmón humano,^1,2 la cual ha sido reportada como sustituto de los cultivos primarios de riñón de mono para el aislamiento y la propagación de los Paramyxovirus humanos.^3,4 Estudios más recientes demuestran que esta nueva línea también es sensible a Adenovirus y Enterovirus, entre otros, y se compara con cultivos primarios destinados al aislamiento de dichos agentes.⁵ El presente trabajo tiene como objetivo evaluar la utilidad de la línea NCI-H292 para la propagación de los virus sincitial respiratorio,⁶ Adenovirus 3 y 7,⁷ y Paramyxovirus 1, 2 y 3,⁸ mediante un estudio comparativo con las líneas celulares continuas Hep-2 y Vero para el primero, HeLa y Vero para el caso de los Adenovirus y Vero solamente para los últimos, teniendo en cuenta que estas son líneas celulares utilizadas tradicionalmente para el aislamiento y la propagación de estos agentes.

MÉTODOS

La línea NCI-H292 (ATCC CRL-1848) fue recibida del CDC de Atlanta, EE.UU. en subcultivo 78^9,10 y fue crecida en medio RPMI-1640 suplementado con 20 mM de glutamina y 10% de suero fetal bovino(SFB). El medio de inoculación fue RPMI-1640 con 20 mM de glutamina y 1,5 mg/mL de tripsina (Difco 1:250).³ Se trabajaron en subcultivo del 81 al 86.

La línea celular continua HeLa fue lograda en 1951 a partir de un carcinoma de cérvix humano. Fue recibida de la ATCC en subcultivo 105 y trabajadas del 107 al 111.⁹ Se usó como medio de cultivo, medio mínimo esencial (Eagle E-MEM) con aminoácidos no esenciales suplementado con 10 % de SFB. El medio posinoculación fue E-MEM con 2 % de SFB y 1,5 mg de tripsina/mL.

La línea continua HEp-2 se obtuvo en 1952 a partir de un carcinoma epidermoide de laringe humano. Fue recibida de la ATCC (CCL-23) en el Sc 363 y trabajada en 366 al 372⁹ con medio de cultivo E-MEM con 10 % de SFB. El medio posinoculación fue E-MEM al 2 % de SFB y 1,5 mg de tripsina/mL.

La línea Vero fue obtenida en 1962 a partir de un mono verde africano adulto normal (ATCC-CCL 81). Se trabajó en el Sc 126-132.⁹ El medio de cultivo usado fue 199 con 5 % de SFB. El medio posinoculación fue 199 con 1 % de SFB y 1,5 mg de tripsina/mL.

Para las inoculaciones virales se utilizó la cepa 5-1058 de Adenovirus 7 y la cepa Sutherland de Adenovirus 3 provenientes del Centro de Control de Enfermedades de Suecia. Presentaba 8 pases en Vero y 6 pases en HeLa.

Del virus sincitial respiratorio (VSR) fue utilizada la cepa Long proveniente del Centro antes mencionado, con 2 pases en HEp-2. Por último la cepa 15090 de parainfluenza 3, era proveniente del CDC de Atlanta, EE.UU. con 2 pases en NCI-H292.

PROCEDIMIENTO

Se sembraron las células en tubos de cultivo, en sus respectivos medios de crecimiento a razón de 150 000 células/mL. cuando la monocapa fue confluente, se retiró el medio y se inocularon 100 mL de las cepas virales en los tubos, dejándose 1 h de contacto a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se añadió 1 mL de medio de mantenimiento posinoculación respectivo por tubo y se incubó a 37 ^oC. Se observaron los tubos inoculados diariamente hasta el séptimo día. En los casos de los tubos inoculados con los Parainfluenza se aplicó la hemadsorción a los días 3, 5 y 7 posinoculación según la técnica descrita por Shanock.⁸ Los tubos donde se observó efecto citopático (ECP) de más del 75 % de las células o hemadsorción positiva de más del 75 %, se congelaron a - 70 ^oC.

Los tubos donde no se evidenció ECP o hemadsorción, también se congelaron al séptimo día. Se efectuaron 6 pases de todas las cepas.

Para comprobar la multiplicación viral se inocularon en placas de 24 pozuelos los primeros y sextos pases de cada uno de los virus en estudio, en diluciones de 10^-1 a 10^-10 para observar ECP. En el caso de los Parainfluenza se aplicó hemadsorción. Todas las cepas fueron inoculadas en NCI-H292, se tomaron como patrón de comparación para los Adenovirus 3 y 7, las líneas HeLa y Vero.

Para el VSR se inocularon, además, en las líneas HEp-2 y Vero, y para los parainfluenza se inoculó en Vero.

RESULTADOS

El Adenovirus 3 mostró en NCI-H292 efecto citopático en el segundo pase a partir de 72 h posinoculación y fue adelantando su aparición hasta las 24 h al cuarto pase.

En HeLa el ECP apareció desde el primer pase a las 24 h posinoculación, se comportó de igual forma en Vero.

El Adenovirus 7 en NCI tuvo igual conducta que el Adenovirus 3 y en los sistemas controles también se observó el mismo comportamiento.

El VSR en NCI mostró ECP en el segundo pase al quinto día, adelantando la aparición en el cuarto pase a las 48 h.

En Vero apareció ECP en el segundo pase al quinto día llegando a tener ECP al tercer día en el cuarto pase.

En HEp-2 el ECP apareció al segundo pase a las 48 h y se mantuvo en el resto de los pases al mismo tiempo.

En los parainfluenza 1 y 2 no se mostró hemadsorción en los días 3, 5 y 7 en ninguna de las líneas celulares. El parainfluenza 3 en el segundo pase en el tercer día tuvo hemadsorción positiva en NCI-H292 y en Vero al quinto día.

En la tabla se muestran los resultados de la inoculación de los virus en dilución desde 10^-1 a 10^-10 en los pases 1 y 6, se expresan en tantos por cientos de células infectadas, ya sea visualizado por ECP o por hemadsorción, en dependencia del virus.

TABLA. Resultados de la inoculación de los virus en diluciones en los 4 sistemas celulares (ECP o la hemadsorción se expresan en tantos por ciento de cé1ulas infectadas)
 

Virus	Línea	ler. pase	6to. pase
Adeno 3	Hela	10^-4 (100 %)	10^-5 (50 %)
Adeno 3	Vero	10^-2 (100 %)	10^-3 (100 %)
Adeno 3	NCI	10^-3 (100 %)	10^-5 (100 %)
Adeno 7	Hola	10^-4 (100 %)	10^-5 (100 %)
Adeno 7	Vero	10^-4 (100 %)	10^-5 (100 %)
Adeno 7	NCI	10^-3 (100 %)	10^-6 (100 %)
VSR	Hep^-2	10^-4 (100 %)	10^-6 (100 %)
VSR	Vero	10^-3 (100 %)	10^-4 (100 %)
VSR	NCI	10^-1 (100 %)	10^-3 (100 %)
Para 3	Vero	10^-2 (100 %)	10^-4(100 %)
Para 3	NCI	10^-1 (100 %)	10^-6 (100 %)

DISCUSIÓN

La línea NCI-H292 ha sido comparada anteriormente con cultivos primarios para el aislamiento de virus respiratorios,⁵ resultando de utilidad sobre todo para los virus parainfluenza. En nuestro caso hubimos de comparar la NCI-H292 con líneas celulares continuas que se usan de rutina en el laboratorio de virus respiratorios.

En este primer trabajo, utilizando cepas de referencia, obtuvimos que los Adenovirus 3 y 7 luego de pasarse 4 veces en NCI-H292 mostraron ECP a las 24 h posinoculación, que se mantuvo durante los 6 pases de estudio. Los sistemas controles mostraron ECP a las 24 h de inoculación desde el primer pase. Los virus en NCI-H292 aumentaron 2 diluciones del primer pase al sexto, mientras que en HeLa y Vero solo aumentaron 1 dilución, como se muestra en la tabla, lo que puede explicar que el retraso de la aparición del ECP pudo haberse debido a la adaptación del virus a las células. Las diluciones virales más altas detectadas fueron las de Adenovirus 3 en NCI-H292. Resultados similares obtuvieron Hierholzer y otros respecto a la sensibilidad de esta línea a los Adenovirus.⁵

El VSR, luego de 4 pases en NCI-H292, estabilizó el tiempo de aparición de su ECP a 48 h posinoculación y al pasarse 6 veces en dichas células aumentó en 2 diluciones el virus hasta 10^-6. En HeLa y Vero, aumentó en 1 dilución del primer pase al sexo, de 10^-4 hasta 10^-5 (tabla).

De igual forma a lo observado con los Adenovirus el VSR, luego de la adaptación al nuevo sistema, logró multiplicarse en éste mejor que en Vero y con igual eficiencia que en HEp-2, que es la línea más utilizada para dicho agente.⁶

Para el virus de parainfluenza 3, NCI-H292 parece ser el sistema más útil, pues se obtuvo hemadsorción desde el segundo pase al tercer día posinoculación, mientras que en Vero fue al quinto día.

A pesar de que otros autores plantean que para obtenerse una buena multiplicación de virus parainfluenza deben inocularse los cultivos en rotación, el resultado obtenido por nosotros en cultivos estacionarios es satisfactorio, lo que demuestra que NCI-H292 logra multiplicar este virus de ambas formas.^5,8

En general, la línea en estudio ha demostrado ser útil para la multiplicación de los Adenovirus 3 y 7, del parainfluenza 3 y pudiera utilizarse como sistema alternativo para el VSR. Actualmente se estudia su capacidad para el aislamiento de virus a partir de muestras clínicas en comparación con las líneas celulares continuas utilizadas para cada agente.

SUMMARY

The NCI-H292 continual line of mucoepidermoid cells of the human lungs has been reported to be useful for the propagation of many viruses, mainly Adenovirus and Paraxymovirus. It is stated the possible substitution of primary cultures of monkey kidney for NCI-H292 in order to isolate such agents. In the present paper it is evaluated the utility of this line for multiplying the respiratory syncytial viruses Adenovirus 3 and 7, and the parainfluenza viruses 1, 2, and 3, in comparison with the continual cellular lines traditionally used for the propagation of these viruses, whose strains were inoculated this time in the Vero, HEp-2, and HeLa lines, according to their know sensitivities as well as in NCI-H292 simultaneously. The viral multiplication was detected by the appareance of the cytopathic effect or by hemaadsorption. As a result, it was demostrated the multiplication capacity of the NCI-H292 line for Adenoviruses 3 and 7 and parainfluenza 3, being more useful for their multiplication than the tradicionally used lines.

Key words: RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUSES; PARAMYXOVIRUS INFECTIONS; ADENOVIRUS INFECTIONS; CELL LINE; CARCINOMA; SQUAMOUS CELL; LUNG NEOPLASMS; ADENOVIRUSES; HUMAN/isolation & purification; PARAINFLUENZA VIRUSES/isolation & purification.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Banks-Schlegel, SP; Gazdar AF, Harris CC. Intermediate filament and cross-linked envelope expresion in human lung tumor cell line. Cancer Res 1985;45(6):1187-97.
2. Carney ND;Gazdar AF; Bepler G; Guccion JG; Marangos PJ; Moody, TW, et al. Establishment and identification of small cell lung cancer cell lines having classic and variant features. Cancer Res, 1985;45(8):2913-23.
3. Castells E; George VG, Hierholzer JC. NCIH 292 as an alternative cell line for the isolation and propagation of the humanparamixoviruses. Arch Virol 1990;115(2):277-88.
4. Kinsburg DW. Paramixovirus and their replication. En: Fields, Knipe DM, eds. Virology. 2 ed. New York: Raven Press, 1990; Vol 1:945-62.
5. Hierholzer JC; Castells E, Bank K, Bryan JA, Mc Ewen CT. Sensitivity of NCI-H 292 human lung mucoepidermoid cell for respiratory and other human viruses. J Clin Microbiol 1993;31(6):1504-10.
6. Mc Intosh K, Chanock RM. Respiratory syncytial viruses En: Fields, Knipe DM, eds. Virology 2 ed. New York: Raven Press, 1990;Vol 1:1045-72.
7. Horwitz S. Adenovirus and their replication. En: Fields, Knipe DM, eds. Virology. 2 ed. New York: Raven Press, 1990; Vol 2: 1723-40.
8. Shanock RM Mc Intosh K. Parainfluenza virus. En: Fields, Knipe DM, eds. Virology 2 ed. New York Raven Press, 1990; vol 1:963-87.
9. American Type Culture Collection. Catalogue of Cell lines and Hybridomes. Maryland, 1992:17.
10. Hillark J, Kreuzberg-Duffy U, Mac Donal C, Morilsdale H, Golding J, Griffiths B. Human virus detection using cells inmortalised by oncogenes. En: Beubery, Griffiths, Zeylemaker eds, Animal Cell Technology. Dorchecht: Kluwer Academic 1995:51.

Recibido: 23 de julio de 1996. Aprobado: 4 de septiembre de 1996.

Lic. Luis Morier. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.

¹ Licenciado en Microbiología. Investigador Auxiliar.
² Licenciada en Microbiología.
³ Residente de 3er. año en Microbiología.
⁴ Doctora en Ciencias Biológicas. Licenciada en Biología. Investigadora Auxiliar.
⁵ Licenciada en Pedagogía (Biología). Especialista A en Microbiología.
⁶ Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Titular.