Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Anticuerpos monoclonales (AcM) que reconocen el virus herpes simple (HSV) y su posible aplicación al diagnóstico

Lic. MARITZA PUPO ANTÚNEZ,¹ Lic. CARMEN HERMIDA DÍAZ,² Lic. LUIS MORIER DÍAZ,³ Téc. SERAFINA GARCÍA INFANTE⁴ y Dra. SONIA RESIK AGUIRRE⁵

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1. Master in Sciences en Virología. Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).
2. Licenciada en Bioquímica. Investigadora Auxiliar. Centro de Inmunología Molecular.
3. Licenciado en Microbiología. Investigador Auxiliar. IPK.
4. Técnico en Microbiología. IPK.
5. Especialista de I Grado en Virología. IPK

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RESUMEN

Se reporta la obtención de anticuerpos monoclonales mediante la tecnología convencional de fusión celular, capaces de reconocer a los virus HSV-1 y HSV-2. Los anticuerpos monoclonales de mayor positividad por la técnica de inmunofluorescencia indirecta fueron caracterizados parcialmente. Se determinó la capacidad neutralizante de 2 de ellos (278-F7 y 70-G10), los que fueron utilizados en la identificación de aislamientos de muestras clínicas mediante inmunofluorescencia indirecta. Estos anticuerpos monoclonales reconocieron al HSV-1 hasta una dilución de 1:2 560.

DESCRIPTORES DeCS: ANTICUERPOS MONOCLONALES/uso diagnóstico; HERPESVIRUS HOMINIS/aislamiento & purificación; HIBRIDOMAS; TECNICA DEL ANTICUERPO FLUORESCENTE; HIBRIDIZACION; CELULAS VERO; RATONES CONSANGUINEOS BALB C.

Los virus herpes simple (HSV) son posiblemente los agentes virales más frecuentemente aislados de especímenes clínicos, tales como exudados bucales (HSV-1) y genitales (HSV-2). El diagnóstico rápido a las infecciones por HSV es de gran importancia debido a numerosas razones, entre las cuales se encuentran el alto riesgo en la transmisión, las complicaciones de HSV en pacientes inmunocomprometidos, pacientes con virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) e incluso por la asociación actual que tiene con el tan controvertido síndrome de fatiga crónica.^1-3

Los métodos clásicos para la confirmación de las infecciones por HSV son el aislamiento y la detección en cultivos celulares mediante la observación del efecto citopático (ECP) y la detección inmunoquímica con anticuerpos fluorescentes.^4,5 Son numerosas las técnicas descritas para la detección del antígeno, entre las cuales se encuentran la inmunofluorescencia,⁶ la que puede estar ligada a la citometría de flujo;⁷ los ensayos inmunoenzimáticos;⁸ la tinción con inmunoperoxidasa,⁹ la hibridización in situ;¹⁰ el análisis de restricción¹¹ y la reacción en cadena de la polimerasa.¹². En muchos de estos ensayos han sido aplicados los anticuerpos monoclonales (AcM) como reactivos homogéneos y de exquisita especificidad y éstos a su vez han hecho posible el desarrollo de una nueva generación de inmunoensayos rápidos y altamente sensibles sobre todo para el uso diagnóstico y en las investigaciones biomédicas.¹³

El presente trabajo reporta la obtención de AcM que reconocen a los virus HSV-1 y 2, su caracterización parcial y la posible utilización de éstos en el diagnóstico.

MÉTODOS

Obtención de antígeno. El antígeno se obtuvo según ha sido reportado por Ashley y otros.¹⁴ Las células de riñón de mono verde africano (Vero) ATCC¹⁵ crecieron en frascos de Roux en medio 199 suplementado con 2 % de suero fetal, penicilina y estreptomicina al 0,1 % (M199) y se inocularon con una cepa de referencia de HSV-1 F procedente del Hospi-tal Trousseau de París, con un título de 3 x 10⁶ TCID₅₀ (dosis infectiva en cultivo de tejidos).

Inmunización. Se inocularon 10 ratones hembras BALB/c de 6 a 8 semanas con 0,2 mL de antígeno en adyuvante completo de Freund v/v por vía intraperitoneal (ip) y subcutánea (sc), mientras que por la vía intramuscular (im) se aplicó 0,1 mL de la preparación. Se realizaron 4 inoculaciones a intervalos de 7 d. Los ratones fueron sangrados por la vena retrorbital 10 d después de la última inoculación con el fin de medir los niveles de anticuerpos en éstos mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI), antes de la inoculación recordatorio final previa a la hibridización celular.

Hibridización celular. Las células de plasmacitoma de ratón P3X63.Ag8.653 crecidas en medio RPMI suplementado con 10 % de suero bovino fetal, glutamina 0,1 % y piruvato de sodio se cosecharon en fase exponencial para ser fusionadas con polietilenglicol 4 000 45 %, pH 8 a 8,2 a las células esplénicas de los ratones seleccionados, en una proporción 1:10. Los hibridomas positivos mediante la IFI fueron clonados y reclonados por dilución limitante.¹⁶

IFI. Se llevó a cabo sobre células Vero inoculadas con: HSV-1, HSV-2 cepas de referencias, virus obtenidos a partir de muestras clínicas y con otros herpesvirus como Citomegalovirus (CMV) cepa AD 169 y en células Raji (American Type Cell Collection)¹⁵ que expresan un antígeno del virus Epstein Bar (EBV).

El tamizaje primario de los hibridomas se realizó sólo contra las cepas HSV-1 y HSV-2.

Brevemente, las células fueron lavadas por centrifugación 3 veces con solución salina tamponada a pH 7 y goteadas en un volumen de 15 mL en láminas para fluorescencia a una concentración de 10⁶ células/mL, dejadas secar al aire y fijadas en acetona fría por 15 min. Las muestras, tanto los sueros de los ratones inmunizados en diluciones de 1:5 a 1 600, sobrenadantes de cultivo de las células híbridas y los líquidos ascíticos en diluciones de 1:5 a 1:10 240, fueron incubadas por 1 h a 37 EC. Después de los lavados adecuados se añadió un anticuerpo anti-ratón de inmunoglobulinas totales conjugado con isotiocianato de fluoresceína en una dilución 1:20. Como controles, positivo y negativo, se utilizaron el suero de ratón seleccionado para la hibridización y un suero normal de ratón en diluciones de 1:100 respectivamente. Las láminas se observaron con el microscopio de fluorescencia.

Determinación del isotipo de inmunoglobulina. El isotopaje de los AcM fue llevado a cabo mediante un ELISA directo con el empleo de un antisuero de carnero específico (anti-IgM, anti-IgG1, anti-IgG2a, anti-IgG2b y anti-IgG3) (Sigma ISO-2) de acuerdo con las instrucciones del productor.

Producción de los AcM in vivo. Fueron inoculados ratones BALB/c de 18 a 20 g de peso vía ip con 0,3 mL de Pristane (Sigma) 8 d antes de la inoculación de 0,5 mL de las célu-las híbridas en una concentración de 10⁶ - 10⁷ células/mL. Los líquidos ascíticos (LA) que contenían los AcM se extrajeron entre los 10 y 12 d posinoculación, se centrifugaron a 3 000 rpm y se congelaron a 20 EC hasta su utilización.

Neutralización. Se mezclaron diluciones desde 10^-1 hasta 10^-8 de HSV-1 con un título de 10⁶ TCID₅₀ con una dilución LA (1:5) de los AcM v/v. La mezcla fue incubada a 37EC 1 h en atmósfera de CO₂ al 5% e inoculada posteriormente sobre células Vero crecidas en placas de 96 pocillos. Las placas fueron incubadas a 37EC en CO₂ y observadas hasta la aparición del ECP.¹⁴

Muestras clínicas. Las muestras fueron colectadas de la boca o genitales de 6 pacientes sospechosos de infección por HSV con aplicadores de algodón de estériles, y colocadas en M 199 que contenía 1% de penicilina-estreptomicina, hasta su inoculación.

Las muestras fueron inoculadas sobre células Vero en tubos de cultivo (16 x 125 mm) para el aislamiento viral. Una vez aparecido el ECP fueron cosechadas para realizar la IFI. Se utilizó como control el sistema empleado en el laboratorio de diagnóstico de Enfermedades de Transmisión Sexual del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri", (IPK), donde se utiliza un suero policlonal humano positivo a HSV (dilución 1:1 280).

RESULTADOS

Los ratones presentaron niveles de anticuerpos a HSV entre 1:100 y 1:1 600, se seleccionó el de más alto título para realizar la hibridización celular.

Se obtuvo un total de 364 híbridos, de éstos sólo 71 resultaron positivos para un 18,5 % , de los cuales, sólo 29 reconocieron al serotipo 1, mientras 41 tuvieron reactividad cruzada. El criterio de positividad estuvo basado en la fluorescencia presentada por la muestra con respecto al control positivo. Del total de híbridos positivos fueron seleccionados 6 con una reactividad entre 3 y 4+.

Los AcM escogidos para su caracterización parcial (tabla 1) presentaron, en general, altos títulos al HSV-1, sólo el 278-F7 y el 79-F7 reconocieron de forma cruzada al HSV-2 y en ningún caso hubo reactividad a CMV o EBV. El único AcM con capacidad neutralizante resultó ser el 278-F7 y todos presentaron el mismo isotipo de inmunoglobulina, lgG1.

TABLA 1. Características de los AcM seleccionados

IFI	Nt (título TCID50)
AcM	HSV-1	HSV-2	CMV	EBV	HSV-1	HSV-2
278-F7	4+	2+	!	!	10^-3	!
70-G10	4+	!	!	!	!
184-C5	3+	!	!	!	!	!
79-F7	3+	2+	!	!	!	!
132-D5	4+	!	!	!	!	!
179-B5	4+	!	!	!	!	!
SCP	4+	!	!	!	NR	NR

SCP: Suero control positivo. NR: No realizado.

Los AcM 278-F7 y 70-G10 mostraron una fluorescencia positiva hasta diluciones de 1:2 560 (tabla 2) cuando se enfrentaron a aislamientos de muestras de pacientes con infección por HSV-1 mientras que resultaron negativos al serotipo 2.

TABLA 2. Reactividad de 2 AcM en aislamientos de muestras clínicas

	AcM
Muestras*	278-F7	70-G10
1	+	+
2	+	+
3	+	+
4	!	!
5	!	!
6	!	!
Células/HSV-1	+	+
Células/HSV-2	!	!
Células Vero	!	!

^* Muestras de la 1 a la 3 obtenidas de raspados bucales (HSV-1). Muestras de la 4 a la 6 obtenidas de raspados genitales (HSV-2).

DISCUSIÓN

El aislamiento viral en cultivo de células es el método por excelencia para el diagnóstico e identificación de las infecciones por HSV. No obstante, no descarta la utilización de otras técnicas, sobre todo, si éstas mantienen la sensiblidad y la eficacia y agilizan el resultado del diagnóstico; tal es el caso de la inmunofluorescencia con el empleo de AcM.¹⁷

En nuestro trabajo, los AcM(278-F7 y70-G10) que presentaron mayor estabilidad y reactividad mediante IFI, pudieron ser utilizados en la identificación de aislamientos de pacientes con infecciones por HSV.

El AcM 278-F7 a pesar de haber reconocido el HSV-2 en los primeros ensayos no fue capaz, en la misma dilución, de reaccionar con los aislamientos de las muestras de pacientes sospechosos a esta infección. Esto pudo ser debido a una insuficiente expresión de la proteína viral compartida entre ambos virus. Si tenemos en cuenta que la especificidad de los AcM está dada en su capacidad de reconocer determinados epitopes dentro de toda la proteína, es de esperar que la señal en los casos de reactividad cruzada no mantenga la misma intensidad y dependa de la cantidad o expresión de éstos.

Este AcM resultó ser el único con capacidad neutralizante, lo que pudiera sugerir un posible reconocimiento a las glicoproteínas C ó D, las que son capaces de inducir neutralización in vitro y protección pasiva in vivo frente a un reto viral, cuando se han empleado AcM contra dichas proteínas.^14,18

Estos AcM pudieran ser una valiosa herramienta en el diagnóstico e identificación de infecciones por HSV, con la utilización de técnicas alternativas de menor costo y mayor rapidez en la obtención de los resultados que el cultivo de células. Por lo cual nos proponemos la caracterización total de los AcM y el empleo de éstos en improntas de pacientes sospechosos previo a la amplificación viral en cultivo de células.

SUMMARY

It is reported the obtention of monoclonal antibodies, which are capable of recognizing HSV-1 and HSV-2 viruses, by the conventional technology of cellular fusion. The monoclonal antibodies of highest positivity according to the indirect immunofluorescence technique were partially characterized. It was determined the neutralizing capacity of 2 of them (278-F7 and 70-G10), which were used to identify isolations of clinical specimens by indirect immunofluorescence. These monoclonal antibodies recognized HSV-1 up to a dilution of 1:2 560.

Subject headings: ANTIBODIES, MONOCLONAL/diagnostic use; HERPESVIRUS HOMINIS/isolation & purification; HY-BRIDOMAS; FLUORESCENT ANTIBODY TECHNIQUE; HYBRIDIZATION; VERO CELLS; MICE, INBRED BALB C.

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Recibido: 27 de enero de 1997. Aprobado: 23 de abril de 1997. Lic Maritza Pupo Antúnez. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.