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Introducción
Las infecciones causadas por Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa tipo KPC (KPC) constituyen un grave problema de salud pública por las altas tasas de morbilidad y mortalidad asociadas, su poder de diseminación y el incremento en los costos y estadías hospitalarias.1,2
El tratamiento de las infecciones por KPC es complicado debido a las escasas opciones terapéuticas existentes. Ceftazidima/avibactam y meropenem/vaborbactam, fármacos de reciente aprobación, son las mejores opciones terapéuticas disponibles actualmente, sin embargo no se comercializan todavía en algunos países de América del Sur3,4 y resultan muy costosos para países de bajos y medianos ingresos.
La falta de consenso y las pocas opciones de antimicrobianos disponibles para el tratamiento de las infecciones por KPC, obliga en ciertas regiones a optimizar los esquemas terapéuticos disponibles. Los esquemas combinados que incluyen carbapenemes (meropenem y doripenem) a dosis altas junto con colistina y tigeciclina han demostrado, muy buena eficacia clínica con reducción de la mortalidad en infecciones causadas por KPC cuando la concentración mínima inhibitoria (CMI) del carbapenem es ≤8 µg/mL.5,6,7,8,9,10 Por lo tanto, el meropenem constituye una alternativa válida en ciertas regiones donde los nuevos antibióticos no están disponibles, sin embargo, su uso depende de la CMI del microorganismo aislado.
El uso de sistemas automatizados para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana se ha generalizado en América Latina. Sin embargo, a pesar de su uso extendido en diversas regiones, existen reportes de falta de precisión para la determinación de la susceptibilidad de diversos microorganismos para ciertos antimicrobianos, entre ellos los carbapenémicos.11,12,13
Por todo lo anterior y unido a la falta de consenso en los esquemas terapéuticos, la no disponibilidad comercial de las nuevas drogas y el incremento de la resistencia a tigecilina y colistina14,15 en patógenos productores de carbapenemasas, nos propusimos como objetivo estudiar la concordancia de la tarjeta AST-N272 del Sistema Vitek 2 Compact (BioMérieux Inc, Francia) y las tiras M.I.C.ETM Evaluator (Oxoid, Reino Unido), con la dilución en agar para la determinación de la CMI del meropenem en Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa tipo KPC.
Métodos
Aislados bacterianos
Se estudiaron 53 aislados no clonales de Klebsiella pneumoniae bla KPC positivo, provenientes de hisopados rectales recolectados en diferentes unidades hospitalarias públicas y privadas de segundo y tercer nivel de atención de la ciudad de Guayaquil, Ecuador, durante el período comprendido entre enero a junio de 2016. La determinación del gen bla KPC se realizó por reacción en cadena de la polimerasa con metodología previamente descrita.16
Susceptibilidad antimicrobiana
La CMI de meropenem por dilución en agar y con las tiras M.I.C.ETM (Oxoid, Reino Unido) se realizó en el Centro Nacional de Referencia de Bacteriología del INSPI-LIP. Los análisis con el Sistema Vitek 2 Compact (BioMérieux Inc, Francia) (V2C) se realizaron en el laboratorio de bacteriología del Hospital “Dr. Abel Gilbert Ponton” (Equipo 0000148FF9E0. Versión 07.01) con la tarjeta AST-N272 (lote 682380010).
Dilución en agar: Se realizó por triplicado según metodología del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI M07-A8).17 Se utilizó meropenem trihidrato en grado analítico (Sigma-Aldrich Lote SZBF160XV) y agar Mueller-Hinton (Becton Dickinson, Reino Unido). El rango de concentraciones utilizado fue de 0,06 µg/mL a 32 µg/mL. Las placas se prepararon y almacenaron a 4 °C, utilizándose dentro de las 48 h.
Difusión por gradiente: La CMI de meropenem con las tiras M.I.C.ETM (Oxoid, Reino Unido) se realizó por duplicado siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando agar Mueller-Hinton (Becton Dickinson, Reino Unido). El rango de concentraciones fue de 0,03 µg/mL a 32 µg/mL y para la lectura se siguieron las indicaciones del fabricante.
El inóculo bacteriano utilizado en las metodologías anteriormente descritas (dilución en agar y difusión de gradiente de concentración) se ajustó al 0,5 de la escala MacFarland utilizando el equipo DensiCheck (BioMérieux Inc, Francia).
Sistema Vitek 2 Compact: Las pruebas se realizaron por duplicado siguiendo las recomendaciones del fabricante. El inóculo bacteriano se ajustó al 0,5 de la escala Mac. Farland con el equipo DensiCheck (BioMérieux Inc, Francia) y posteriormente se diluyó un volumen de 145 µL de la suspensión bacteriana previamente ajustada en 3 mL de solución salina al 0,45 % siguiendo las recomendaciones del fabricante. La interpretación de las categorías (sensible, intermedio y resistente) las realizó el equipo con el sistema Experto (versión CLSI 2016).18
Todas las pruebas fueron realizadas por el mismo operador, las pruebas por difusión por gradiente y por el sistema V2C fueron realizadas el mismo día, con diferente inóculo.
Control de calidad
Cepa sensible a carbapenémicos: Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Cepa resistente a carbapenémico: Klebsiella pneumoniae ATCC 1705.
Para el sistema V2C se incluyó un control diario de esterilidad de la solución salina (SS) (1 mL de SS en caldo tioglicolato incubado a 35 (C por 48 h). A las suspensiones bacterianas realizadas para el equipo V2C se les realizó control de pureza inoculando 5 (L de la suspensión bacteriana en agar tripticasa soya e incubando a 35 (C por 24 h. El control del recuento bacteriano se realizó con las cepas ATCC haciendo una dilución 1:100 de la suspensión bacteriana realizada y sembrando en agar tripticasa soya incubando a 35 (C por 24 h.
Interpretación de resultados
La dilución en agar se consideró como el método de referencia. Se definió como concordancia esencial (CE) los valores de CMI iguales o ± 1 dilución y valores de CMI ≥ 16 µg/mL. Todos los aislados fueron considerados como resistentes indistintamente de su valor de CMI, según recomendaciones del CLSI.18
Aspectos éticos
Protección de personas y animales: Los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni animales.
Confidencialidad de los datos: Los autores declaran que en esta publicación no aparecen datos que permitan la identificación de los pacientes.
Derecho a la privacidad y consentimiento informado: Los autores declaran que en esta publicación no aparecen datos de pacientes.
Resultados
El rango de la CMI de meropenem de los aislados estudiados fue de 1 a ≥32 µg/mL, con una CMI50= 4 µg/mL y una CMI90= ≥ 32 µg/mL. El 86,79% (n= 46) de los aislados tuvo una CMI≤ 8 µg/mL. En la tabla 1 se describen los valores obtenidos por triplicado por el método de referencia.
Tabla 1 Valores de concentración mínima inhibitoria y desviación estándar de meropenem en Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa tipo KPC obtenida por el método de dilución en agar (n= 53)
CMI: concentración mínima inhibitoria.
El sistema automatizado V2C tuvo un bajo desempeño para la determinación de la CMI de meropenem, mostrando una concordancia esencial (CE) de 15,09 % al compararlo con el método de referencia, mientras que las tiras M.I.C.ETM (Oxoid, Reino Unido) obtuvieron una CE 94,33 % (No. 50). En la tabla 2 se detallan las CMIs obtenidas por cada metodología.
Tabla 2 Distribución de la concentración mínima inhibitoria de meropenem en Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa tipo KPC (n= 53)
CMI: concentración mínima inhibitoria; KPC: Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa tipo KPC.
El 100 % de los aislados fueron identificados por el sistema Experto del equipo Vitek 2 Compact (BioMérieux, Francia) como sospechosas de producir carbapenemasas.
Discusión
La falta de disponibilidad de las nuevas drogas como ceftazidima/avibactarm o meropenem/varvobactam para el tratamiento de bacilos gramnegativos productores de carbapenemasas en ciertas regiones, obliga a optimizar los esquemas terapéuticos disponibles.5 El meropenem constituye una opción válida cuando su CMI es ≤8 µg/mL en terapia combinada junto con colistina o tigeciclina para tratar infecciones por patógenos productores de KPC,5,6,7,8,9,10 por lo tanto un resultado confiable de una CMI de meropenem es un requisito fundamental para el tratamiento de estas infecciones.
La AST-N272 es una tarjeta de distribución regional para el V2 en América Latina. Sin embargo, existe poca evidencia del desempeño de las tarjetas en Enterobacteriales con KPC, a pesar la alta prevalencia mundial de estos patógenos multidrogorresistentes.
Este estudio encontró un 15,09 % de CE para la CMI de meropenem para el Vitek 2 Compact (BioMérieux, Francia) en comparación con el método de referencia, a diferencia de lo reportado por otros autores para este método comercial, como Bulik y otros,11) quien en el año 2010 demostró un 30,4 % de CE para la CMI de meropenem en aislados de K. pneumoniae productora de carbapenemasa , y Lat y otros,12 quien obtuvo un 23 % de CE para este mismo antibiótico. La CE obtenida en la presente investigación es mucho más baja que la reportada por ambos estudios, lo cual podría deberse a la tarjeta utilizada (AST-GN28). Sin embargo, la CMI50 de los aislados incluidos en este estudio fue 4 µg/mL mientras que en los estudios anteriormente mencionados la CMI50 fue 32 µg/mL, lo cual pudo haber influido en la CE ligeramente más alta reportada por ambos autores. Una diferencia notable entre este trabajo y esos estudios es que las CMIs reportadas con la tarjeta AST-GN28 fueron menores que el método de referencia utilizado (microdilución) lo cual fue atribuido por estos autores al menor inóculo bacteriano utilizado por el equipo automatizado.19 En esta investigación, el 83,01 % de las CMIs obtenidas con la tarjeta AST-N272 fueron mayores que el método de referencia utilizado (dilución en agar), lo cual pudiera deberse al algoritmo dinámico utilizado por el equipo para el cálculo de la CMI y al número de pocillos que contiene la tarjeta utilizada, la que incluye solo cuatro concentraciones del antimicrobiano (0,5; 2; 6 y 12 µg/mL) a diferencia de la tarjeta AST-GN28, que tiene siete concentraciones seriadas dobles (0,25; 1; 2; 4; 8 y 16 µg/mL;1 hasta 16 µg/mL).
En Enterobacteriales, CMIs altas de meropenem han sido reportadas por otros autores con el equipo V2C19, inclusive en microorganismos que no poseen carbapenemasas.
Las tiras M.I.C.ETM (Oxoid, Reino Unido) tuvieron una excelente concordancia esencial (94,33 %) con el método de referencia, situación similar a la descrita por otros autores que reportaron un 100 % de CE para el imipenem.20 Estudios comparativos utilizando esta marca comercial son escasos, sin embargo se ha reportado una concordancia superior al 90 % para otros antibióticos y otros grupos de patógenos.21,22 Se ha referido que las CMIs reportadas por esta metodología tienden a ser más altas, lo cual es atribuido a la presencia de microcolonias con mecanismos de resistencia adicionales, lo cual dificulta la lectura con el consiguiente aumento de la CMI. Esta lectura, también depende de la experticia del técnico que la realiza.11 A pesar de la baja CE con el Vitek 2 Compact (BioMérieux, Francia), este sistema fue capaz de detectar la presencia de carbapenemasas en el 100 % de los aislados testados, como se describe en la literatura.23
Una de las limitantes del estudio es que solo se incluyeron aislados de K. pneumoniae con un único tipo de carbapenemasa (KPC), por lo cual los datos no podrían extrapolarse a otros Enterobacteriales resistentes a carbapenemes por otro mecanismo de resistencia diferente al incluido, adicionalmente no se utilizaron aislados susceptibles o con sensibilidad intermedia y los experimentos no fueron ejecutados con el mismo inóculo bacteriano al mismo tiempo. Sin embargo, los métodos comerciales fueron ejecutados por duplicado y por el mismo operador en el mismo día.
A pesar de las limitaciones, el presente trabajo contiene evidencia científica adicional sobre la falta de robustez del Sistema Vitek 2 Compact (BioMérieux, Francia) para la detección adecuada de la resistencia a carbapenémicos en bacterias gramnegativas, cuyo uso se extiende cada vez más en los laboratorios de microbiología clínica de Latinoamérica en medio de un incremento en la prevalencia de Enterobacteriales y bacilos no fermentadores productores de carbapenemasas.
