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Introducción
Los clorofenoles (CF) son un grupo de sustancias químicas producidas por halogenación electrofílica de fenol con cloro. Existen 5 tipos básicos y 19 especies diferentes. Algunos son usados como pesticidas y herbicidas, otros como antisépticos y desinfectantes.1
De acuerdo con Carey2 y los resúmenes publicados por la Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades3, los CF constituyen un grupo de compuestos orgánicos tóxicos, incoloros y débilmente ácidos. La mayoría de sus aplicaciones se basan en su toxicidad y se utilizan para controlar bacterias, hongos, insectos, entre otros.
El sitio web Drugbank4, al referirse a las propiedades físico-químicas de los fenoles clorados, plantea que su mecanismo de acción parece ser el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa de la cadena transportadora de electrones en la mitocondria, cuya fuerza del efecto está relacionada con el grado de cloración; el 4-clorofenol (p-clorofenol, 4-CF) es considerado el inhibidor más fuerte.
Aunque se posee poca información sobre su farmacodinamia, volumen de distribución en los líquidos corporales y enlace a proteínas plasmáticas, es conocido que el 4-CF se absorbe por el tracto gastrointestinal y que su metabolismo a través de ensayos en animales de experimentación produce: p-cloroanisol en cobayos; 4-clorocatecol, p-clorofenil-beta-D-glucorónido y p-clorofenil sulfato en conejos, así como sulfato de p-clorofenilo en ratas.
En la especialidad de Estomatología, uno de los clorofenoles empleado como agente antibacteriano y de uso común en la desinfección del conducto dentario radicular durante el tratamiento pulporradicular, lo constituye el p-clorofenol alcanforado (PCFA); mezcla integrada por p-clorofenol más alcanfor. Este último, además de servirle como vehículo, reduce su acción irritante tisular al permitir la lenta liberación de los iones cloro del anillo bencénico.4
Aun así, el PCFA se considera como citotóxico. Estudios realizados por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos5, confirman reportes de signos y síntomas en seres humanos que evocan la necesidad de emplear este producto de manera racional, dosificándolo adecuadamente en función del tiempo y su concentración, pues se utiliza en la práctica clínica estomatológica de forma empírica, mediante un cono de papel o bolilla estéril de algodón embebidos en el producto y colocados en la entrada del conducto radicular (cámara pulpar).
De acuerdo con la literatura, el p-clorofenol y, en especial, el PCFA, representan un serio problema de salud pública debido a sus efectos disrruptores del sistema endocrino, mutagénicos y/o cancerígenos. Kadmi, et al.6, Ge, et al.7 y Anku, et al.8) aseveran que cuando el p-clorofenol no se diluye adecuadamente, blanquea y cauteriza la piel y membranas mucosas, produce daño a una concentración umbral de 0,75 % y su acumulación crónica en humanos puede lesionar a órganos como hígado, cerebro, tracto gastrointestinal, tracto respiratorio superior y sistema nervioso central (SNC).
Rincón Silva, et al.9 sostienen por su parte, que el p-clorofenol cuando es ingerido produce un aumento en la presión sanguínea y retarda el pulso, aumenta la glucemia, causa daños en el ácido desoxirribonucleico (ADN), colapso vascular y puede producir la muerte.
A pesar de innumerables investigaciones como las de Rodríguez Guerrero10, Pedraza Maquera11 e Himadri P12, que avalan sin duda alguna la efectividad del PCFA como agente bactericida, otros estudios como el de Canalda C13, sugieren que sus efectos no se limitan solo al conducto dentario radicular principal. Su baja tensión superficial puede facilitar la difusión a través de los túbulos dentinarios y conductos secundarios, así como sus vapores atravesar el ápice radicular con un efecto potencial en el área periapical.
Hallazgos de su presencia en sangre y orina como expresara dicho autor13, indican su posible acción en otros órganos distantes como los vasos sanguíneos y, en especial, el músculo liso vascular arterial, ejerciendo quizás efectos vasomotores y hemodinámicos que modifican el flujo sanguíneo tisular, afectando la irrigación de las estructuras de soporte del diente, modulando de forma no controlada el proceso inflamatorio en las distintas afecciones pulporradiculares y retardando los procesos de reparación tisular.
Teniendo en cuenta lo expresado con anterioridad y los escasos reportes científicos en relación con el efecto del p-clorofenol alcanforado sobre la musculatura lisa vascular arterial, los autores de la investigación se trazaron como propósito: determinar el efecto del p-clorofenol alcanforado sobre la dinámica contráctil del músculo liso vascular arterial en el tiempo.
Método
Se realizó una investigación experimental preclínica en el Instituto de Fisiología Oscar Langerdorff, Universidad de Rostock, Alemania, entre octubre y diciembre de 2018, con el propósito de determinar el efecto del p-clorofenol alcanforado sobre la dinámica contráctil del músculo liso vascular arterial en el tiempo.
El universo estuvo constituido por el total de arterias aortas de ratas Wistar de ambos sexos, con un peso entre 200-250 g. A través de un muestreo probabilístico aleatorio simple se seleccionó una muestra (n=8).
Cada arteria fue seccionada en 3 anillos concéntricos de 5 mm cada uno aproximadamente para un total de 24. Se emplearon 14 para los experimentos con el medicamento y 10 como grupo de prueba o control para probar reactivos, sustancias preactivadoras y soluciones del medicamento antes de la experimentación.
A cada anillo se le practicó con ayuda de un microscopio estereoscópico un corte helicoidal cuidadoso preservando la integridad del endotelio y la capa de fibras musculares lisas.
Para dar cumplimiento al objetivo planteado se tuvieron en cuenta las variables: tensión basal espontánea (TBE), tensión base inicial (TBI) y tensión inducida por p-clorofenol alcanforado, las que se operacionalizaron de la siguiente forma:
Tensión basal espontánea (TBE): tensión alcanzada por el músculo liso vascular tras la adición en 30 ml de solución Krebs fisiológica. Se registró en mN/g de músculo y se evaluó de mínima (menor de 5), promedio (entre 5 y 10) y máxima (igual o mayor de 10).
Tensión base inicial (TBI): tensión máxima alcanzada por el músculo liso vascular tras la preactivación con noradrenalina (10-5 mol/L en baño de órgano). Se registró al minuto 0.
Tensión inducida por p-clorofenol alcanforado: tensión desarrollada por el músculo liso vascular (previamente preactivado con noradrenalina), tras la adición de 7 μl de PCFA. Se registró al minuto 1, 3 y 5.
Las preparaciones para registrar la TBE se colocaron en un baño de órganos [Tissue Bath Station, BIOPACTM] con 30 ml de solución Krebs fisiológica (NaCl: 112; NaHCO3: 25; KH2PO4: 1,2; KCl: 4,7; MgCl2 + 6H2O: 1,2; CaCl2 + 2H2O: 3,6; glucosa: 11,5 mmol respectivamente), a 36,5 °C, se mantuvo un suministro continuo de carbógeno (95 % de O2 y 5 % de CO2). Posteriormente, se estandarizó dicha tensión mediante un peso de tracción de 1 g realizando ajustes de calibración. La garantía de su estabilidad se consiguió con el lavado de las muestras biológicas cada 15 minutos durante una hora con solución Krebs fisiológica fresca.14,15
Para medir la TBI, los anillos se preactivaron con 10 μL de noradrenalina (10-5 mol/L en baño de órganos) hasta alcanzar la máxima vasoconstricción (meseta) aproximadamente a los 10 minutos. A continuación, se añadieron 7 μL de p-clorofenol alcanforado, determinándose los niveles de tensión muscular resultante de manera continua durante 5 minutos. Se registraron para su estudio los minutos 1, 3 y 5.
Los registros gráficos de la actividad contráctil espontánea e inducida del músculo liso vascular se obtuvieron mediante el empleo el software LabChart 7.2 de ADInstruments. Tales registros se almacenaron en soporte digital para su posterior análisis e interpretación. La información obtenida se procesó con el paquete estadístico SPSS (Statistical Package for Social Sciences) versión 22.0. Se empleó la media aritmética y desviación estándar.
El porcentaje de relajación del músculo liso vascular inducido por PCFA para cada uno de los intervalos de tiempo se calculó mediante la expresión matemática:
Por ciento de relajación vascular = [(Tensión Máxima Constricción - Tensión Inducida) / (Tensión Máxima Constricción - Tensión Basal Espontánea)] x 100.
Se compararon los valores promedios de tensión registrados en los diferentes intervalos de tiempo con los de la tensión espontánea basal y tensión base inicial, a través de comparaciones de medias relacionadas con la aplicación del test de Wilcoxon de los rangos con signo. El nivel de significación empleado fue de α = 0,05, los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
El estudio constituye parte de los resultados de la investigación doctoral del primer autor, derivado de un proyecto institucional con colaboración internacional aprobado por el Consejo Científico y Comité de Ética de Investigaciones en Salud, Facultad de Estomatología, Universidad de Ciencias Médicas de Santiago de Cuba. Todo el diseño experimental se realizó de acuerdo a las normas éticas alemanas relacionadas con el cuidado, uso y manejo de animales de experimentación.
Resultados
Las tensiones registradas en el tiempo por acción del p-clorofenol alcanforado sobre el músculo liso vascular de los anillos aórticos se ilustran en la Figura 1.
Fig. 1 Tensión desarrollada por el músculo liso vascular tras la adición de p-clorofenol alcanforado en el tiempo (la línea discontinua horizontal representa la tensión media general).
Como se destaca, el medicamento produjo una disminución apreciable del tono muscular, con una diferencia al minuto cinco de 1,74 mN con respecto a la tensión base inicial y 1,09 mN con respecto a la media general de 11,21 ± 0,07 mN/g de músculo (línea azul discontinua horizontal). Las cifras de tensión se situaron por debajo de esta última a partir de los 2 minutos con 50 segundos aproximadamente (línea azul discontinua vertical).
El intervalo de tiempo donde se produjo la mayor disminución de la fuerza muscular fue entre el tercer y quinto minutos, con un descenso en 1,05 mN/g, lo que representó el 62,6 % de toda la variación experimentada.
Los valores de desviación estándar y coeficiente de variación calculados evidenciaron poca dispersión de los datos con respecto a la media.
La Figura 2 exhibe en término de porcentaje de relajación vascular, los efectos producidos por el p-clorofenol alcanforado sobre el músculo liso vascular de los anillos de aorta. Nótese como el por ciento de vasorrelajación y vasodilatación resultante se incrementó de forma progresiva en el tiempo, alcanzando al final del estudio más de un 50 %. La mayor variación del por ciento de inhibición de la musculatura lisa vascular se produjo entre el tercer y quinto minuto, con un incremento en 18,9 unidades porcentuales.
Fig. 2 Efecto del p-clorofenol alcanforado sobre el músculo liso vascular de anillos aórticos según tiempo de aplicación.
Todos los estadígrafos Z calculados a través de las pruebas de Wilcoxon de los rangos con signo mostraron la existencia de diferencias significativas con un intervalo de confianza del 95 % (Z<-1,96; p<0,05), entre las cifras promedios de tensión registradas en los diferentes intervalos de tiempo, con respecto a las de la tensión base inicial y espontánea basal.
Discusión
Los resultados del estudio sugieren que, in vitro, el p-clorofenol alcanforado tiene efecto vasorrelajante, que varía según el tiempo de exposición al medicamento. La inhibición de la vasoconstricción observada podría ser explicada a criterio de los autores de esta investigación, a través de dos mecanismos morfofuncionales combinados: el primero (a corto plazo) como propone Martin16, a la producción de derivados epoxilados del ácido araquidónico (AA) en el endotelio vascular, los llamados ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs), obtenidos por las epoxigenasas de la familia 2 del sistema citocromo P450 (CIP-450), que actuarían como factores hiperpolarizantes derivados del endotelio (EDHF) no dependientes de óxido nítrico ni prostanoides, y que provocarían en el músculo liso vascular vasorrelajación, al incrementar la apertura gradual y sostenida de canales de potasio con la consiguiente hiperpolarización del sarcolema.
El segundo mecanismo (a largo plazo) como sugiere Syed, et al.17, que el PCFA al desacoplar la fosforilación oxidativa de la cadena transportadora de electrones a nivel mitocondrial, reduzca la producción de trifosfato de adenosina (ATP) por debajo de un punto crítico de 1 mmol/L, lo que conduciría a la activación de canales de potasio sensibles a ATP (KATP) e involucrados en la regulación del flujo sanguíneo local, la consiguiente hiperpolarización del sarcolema, el bloqueo de los canales de calcio dependientes de voltaje tipo L (CCDVs) y no selectivos de potencial transitorio (TRP), produciendo inhibición de la musculatura lisa vascular y vasodilatación.
Los cambios más notables observados en cuanto al por ciento de relajación vascular producidos por el PCFA, y ocurridos entre el tercer y quinto minutos, guardan estrecha relación con el cierre de una fracción mayor de canales de calcio en un tiempo menor que en los restantes intervalos registrados. Durante la preactivación con noradrenalina, como plantea Ávila Medina J.18, casi la totalidad de los canales de calcio dependientes de voltaje, los operados por receptor y de estiramiento se hallan abiertos, mayor es el influjo de calcio hacia el interior del sarcolema, su concentración en el interior de la fibra muscular lisa vascular y el número de puentes cruzados entre los filamentos de actina y miosina, traducido en el estado de máxima vasoconstricción considerado en el estudio realizado como tensión base inicial (TBI).
Tras la adición de los 7 μL de p-clorofenol alcanforado, los EETs liposolubles producidos por el endotelio vascular con un tiempo de vida media corta y acción paracrina, hiperpolarizan la membrana de la fibra muscular lisa de forma rápida, al causar en pocos minutos una apertura mayor de canales de potasio dependientes de voltaje (Kv), y de calcio de gran conductancia (BKCa)19,20, hecho evidenciado experimentalmente por el incremento notable del porcentaje de vasorrelajación observado entre el minuto tres y cinco.
La existencia de diferencias significativas entre los valores promedios de tensión registrados en los diferentes intervalos de tiempo, con relación a la tensión basal espontánea y tensión base inicial, permitieron afirmar con un margen de error del 5 %, que el p-clorofenol alcanforado produjo un efecto relajante vascular significativo en esa muestra de anillos de aorta. Estos resultados demuestran la necesidad de tener en cuenta in vivo, el uso adecuado de este medicamento en cuanto a la cantidad a utilizar y el tiempo de aplicación como medicación intraconducto durante los tratamientos pulporradiculares en Estomatología (Endodoncia). Téngase en cuenta lo expresado por Canalda C.13, que este medicamento colocado en el conducto dentario radicular, difunde hacia los tejidos adyacentes al ápice de la raíz dentaria; así como, la poca información relacionada con la acción del mismo en el músculo liso vascular arterial.
Dadas las limitaciones del estudio en cuanto al número de muestras e intervalos de tiempo empleados, se sugiere para futuras investigaciones incrementar el número de preparaciones, así como usar soluciones del medicamento en diferentes dosis y concentraciones, en aras de comparar nuevas evidencias experimentales con los resultados obtenidos en la investigación.
