Servicios personalizados
Español (pdf)
Articulo en XML
Referencias del artículo
Enviar articulo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
Introducción
Mycoplasma genitalium es un patógeno emergente de transmisión sexual y el aumento de la resistencia a los macrólidos se considera un problema de salud a nivel mundial.1 En esta bacteria, la resistencia a los macrólidos está mediada principalmente por mutaciones puntuales en las posiciones A2058 y A2059 (numeración de Escherichia coli) en la región V del ARN ribosómico 23S. Estas mutaciones están asociadas con el fracaso del tratamiento con azitromicina y una concentración inhibitoria mínima (MIC) alta para los macrólidos como se documenta en varias cepas de M. genitalium.2),(3
La prevalencia de cepas con mutaciones mediadoras de resistencia a macrólidos (MRM) es muy variable y desconocida en muchas regiones. En Europa, Australia y Asia, generalmente es superior al 30 % y, en casos extremos, como en Groenlandia, el 100 % de las cepas de M. genitalium portan MRM.4),(5),(6),(7),(8 En Cuba, los macrólidos se usan como tratamiento de primera línea para los síndromes urogenitales causados por infecciones de transmisión sexual (ITS), incluidas las infecciones por M. genitalium y clamidia.
Desde 2007, el diagnóstico de M. genitalium se ha realizado en el Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí (IPK), y en los últimos años se han detectado varios casos de fracaso del tratamiento con 1 g de dosis única y regímenes de azitromicina extendida en la clínica IPK - ITS. En 2015, se aisló una nueva cepa de M. genitalium resistente a macrólidos (mutación B19, A2059G) de uno de estos pacientes mediante el cultivo conjunto de células Vero9) y los patrones de susceptibilidad a los antimicrobianos se determinaron mediante un procedimiento de clasificación celular.10 Sin embargo, no hay datos disponibles sobre la frecuencia de cepas de M. genitalium con MRM en Cuba, pero la experiencia clínica de fracasos del tratamiento con macrólidos y el aislamiento de al menos una cepa con MRM sugiere la posible circulación de MRM con cepas de M. genitalium en pacientes cubanos después de 2015, que tiene implicaciones directas para la efectividad del tratamiento sindrómico de las ITS.
El objetivo de la presente investigación fue implementar una PCR en Tiempo Real (qPCR) que permita determinar la frecuencia de MRMM en M. genitalium - muestras positivas conservadas en el Laboratorio Nacional de Referencia de Investigación de Micoplasma de Cuba en IPK entre 2009 y 2019.
Métodos
Se implementó una PCR en tiempo real que permite determinar la presencia de M. genitalium y su susceptibilidad antimicrobiana a los macrólidos, directamente en las muestras clínicas, lo que disminuye el tiempo entre el diagnóstico y el tratamiento y erradicación de este microorganismo en los pacientes positivos. Este hecho contribuye a cortar las cadenas de trasmisión de las ITS causadas por esta bacteria, incidiendo de forma positiva en el programa de control de las ITS en Cuba.
Los resultados del método molecular fueron corroborados mediante el aislamiento en cultivos celulares y ensayos fenotípicos de susceptibilidad antimicrobiana, logrando una total coincidencia entre el resultado de la qPCR en la muestra clínicas y los aislados correspondientes.
Resultados
Resultados de la implementación del qPCR para la detección de resistencia a macrólidos
Con la modificación realizada a la metodología desarrollada por Kristiansen et al.11 se obtuvo una correcta identificación de las cepas utilizadas, tanto de las resistentes como de las sensibles. Comparando el presente ensayo con los resultados publicados en el artículo original se obtuvieron los mismos patrones gráficos, distribuyéndose cada genotipo (sensible y resistente) en las agrupaciones espaciales previamente explicadas. Todas las muestras amplificaron en los dos canales de emisión de fluorescencia (rojo y verde).
Por otra parte, el límite de detección del qPCR MRM fue 1 geq/µL. El bajo límite de detección que presenta el qPCR le confiere una alta sensibilidad, y por tanto una mayor eficiencia para confirmar la presencia de mutaciones que condicionan la resistencia a macrólidos.
Los macrólidos son considerados la primera línea de tratamiento contra las infecciones causadas por Mycoplasma genitalium. Sin embargo, los altos niveles de resistencia desarrollados por dicho patógeno, hacia esta clase de antibióticos, constituyen una problemática a nivel mundial. Por ello se hace necesario el desarrollo y puesta en práctica de nuevos métodos moleculares que identifiquen con una mayor rapidez y precisión los determinantes genéticos que condicionan este fenotipo.12
Hasta el momento, la metodología planteada en este estudio para identificación de mutaciones puntuales, basadas en el polimorfismo del simple nucleótido constituye una de las mejores alternativas para el diagnóstico de infecciones de transmisión sexual asociadas a M. genitalium. La alta sensibilidad de esta técnica y el fácil manejo de la misma condicionan su uso como ensayo rutinario en las distintas clínicas del mundo.
Frecuencia de aislados resistentes a macrólidos en muestras clínicas positivas a Mycoplasma genitalium
La frecuencia total de M. genitalium resistente a macrólidos, en este estudio, fue de un 49 % (301/615). Las mutaciones A2058G/A2059G fueron registradas en 279 de las muestras con genotipo resistente; mientras que en las 22 restantes se registraron las mutaciones A2058C/T. Los valores referentes a la cantidad de muestras positivas a M. genitalium, en cada año de la investigación, así como la cantidad de muestras sensibles, resistentes y aquellas que no amplificaron; se recogen en una tabla (tabla 1). Fueron encontradas diferencias, estadísticamente significativas, en la frecuencia de positividad a MRM, por años, de las muestras clínicas analizadas (p = 0,0352*).
La prevalencia de MRM en Cuba, después del año 2014, fue alta (32,1 %) y con un marcado incremento en el 2016 (89,7 %) (p = 0,0391*). En el año 2015, todas las muestras tomadas que se identificaron con el genotipo mutante presentaron fallos al tratamiento con azitromicina y la infección fue erradicada con una terapia combinada de levofloxacina y doxiciclina. Para el 2019 prácticamente todas las muestras positivas a M. genitalium portaban MRM (98 %) lo que nos da una idea de los altos niveles de circulación de este genotipo en el país.
Tabla 1 Total de muestras positivas a Mycoplasma genitalium, con el número de muestras sensibles, resistentes y las que no amplificaron en cada año del estudio
| Año de estudio | Número de muestras sensibles (%) | Número de muestras resistentes (%) | Muestras no amplificables | |
| 2009 | 3 (100 %) | - | 3 | 0 |
| 2010 | 5 (100 %) | - | 8 | 3 |
| 2011 | 21 (100 %) | - | 24 | 3 |
| 2012 | 8 (100 %) | - | 8 | 0 |
| 2013 | 28 (100 %) | - | 39 | 11 |
| 2014 | 38 (67,9 %) | 18 (32,1 %) | 77 | 21 |
| 2015 | 31 (73,8 %) | 11 (26,2%) | 65 | 23 |
| 2016 | 4 (10,3 %) | 5 (89,7 %) | 56 | 17 |
| 2017 | 37 (46 %) | 44 (54,0 %) | 81 | 0 |
| 2018 | 28 (27 %) | 77 (73,0 %) | 105 | 0 |
| 2019 | 3 (2,0 %) | 146 (98,0 %) | 149 | 0 |
El incremento de la resistencia a macrólidos también se informa en Groenlandia, donde alcanzan el 100 %. En dicha región, se emplea el manejo sindrómico contra los cuadros clínicos de síndrome uretral y cervicitis. Además, mantienen un tratamiento de régimen extendido, incluso, con las infecciones por Chlamydia trachomatis5 Este sistema de tratamiento se relaciona, directamente, con la selección de resistencia a macrólidos; de ahí el elevado índice. El nivel de resistencia y los genotipos de las mutaciones más frecuentes publicados en la presente investigación, son similares a los reportados en Dinamarca, Reino Unido y Australia, donde se registran índices de prevalencia del 40 %, 41 % y 43 % respectivamente.4),(3),(8 Sin embargo, en Australia, en el año 2017, M. genitalium MRM se ha incrementado hasta 63 % (estudio en Melbourne); semejante a los niveles en Nueva Zelanda (74 %).13),(14 A pesar de la no existencia de datos acerca de M. genitalium MRM en otras regiones de América Latina o que simplemente esa información no se encuentra disponible, no debería ser alarmante encontrar niveles de M. genitalium MRM en otras regiones donde se empleen estrategias de tratamientos, con macrólidos, en el caso de las infecciones de transmisión sexual.
En el 2016 las Guías Europeas para el diagnóstico y el tratamiento de las infecciones por M. genitalium sugieren la detección inicial del patógeno mediante pruebas de amplificación de ácidos nucleicos, seguidas por ensayos para determinar la resistencia a macrólidos, con el objetivo de establecer una línea a seguir en las decisiones terapéuticas sobre el tratamiento de elección. La necesidad de emplear un segundo ensayo para determinar la resistencia a macrólidos está aparejado a la rápida distribución y diseminación geográfica de MRM en M. genitalium. En la mayoría de las clínicas, la azitromicina constituye una de las primeras líneas de elección frente a la uretritis y cervicitis y si bien es cierto que fue inicialmente, altamente, efectiva contra M. genitalium; los niveles de cura luego de haber sido administrado una dosis de 1g han disminuido en un 69 %, según estudios, después del 2009.15),(16),(17
Ante este análisis, en enero del 2017, se estableció en el LNRM-IPK una nueva estrategia de diagnóstico molecular para las muestras que llegaban al laboratorio con posibles infecciones con M. genitalium. Primeramente, a las muestras se les realizaba el PCR mgpB para identificar la presencia del patógeno y aquellas que resultaron positivas se les realizó el qPCR MRM. Solo las muestras con una carga bacteriana por debajo de 1geq/µL resultaron negativas al qPCR MRM.
Esta nueva estrategia de diagnóstico justifica la disminución en la prevalencia de MRM en el 2017 ya que se cambió del manejo sindrómico de las muestras al diagnóstico etiológico del agente infeccioso, evitando de esta manera la administración de dosis subóptimas de azitromocina que seleccionen la resistencia en pacientes que estuviesen infectados con cepas sensibles. El nuevo tratamiento a seguir consistía en la aplicación de un régimen extendido de azitromicina, donde a cada paciente se le administró 1,5 g del antibiótico. En caso de fallo al tratamiento con persistencia de la infección fueron administradas, en combinación, doxiciclina y levofloxacina. La doxiciclina se administró 100 mg, cada doce horas, durante catorce días y la levofloxacina 400 mg cada doce horas también durante la misma cantidad de días.
Se lograron obtener un total de catorce aislados; de los cuales 6 (B1, B5, B6, B8, B10 y B11) fueron previamente obtenidos, en el laboratorio, antes del presente estudio. Los 8 aislados restantes fueron: B25, B26, B27, B28, B29, B30, B31 y B32.
Al realizar el ensayo de genotipificación a cada aislado y compararlos con las secuencias depositadas en el GeneBank se observaron 5 diferentes genotipos, entre los que se encontraban el genotipo 4, el genotipo 7, los genotipos Cuba 1 y 2 y una secuencia no registrada hasta el momento en la literatura que se identificó, en este estudio, como Cuba 3.
Determinación de los patrones de susceptibilidad antimicrobiana de los aislados de Mycoplasma genitalium
De los catorce aislados empleados en este ensayo (sin contar los 3 controles), un total de diez aislados (B1, B5, B6, B8, B10, B11, B27, B28, B29 y B32) se caracterizaron como genotipo salvaje mediante la genotipificación con el qPCR MRM y dicho resultado se corresponde con el análisis fenotípico mediante el CMI, donde todos fueron sensibles a la azitromicina con valores de CMI ≤ 0,125 mg/L. Los 4 aislados restantes (B25, B26, B30 y B31) fueron resistentes a la azitromicina con valores de CMI ≥ 16 mg/L y estos resultados también coincidieron con la caracterización por el qPCR MRM, donde fueron identificados como resistentes a macrólidos con las posibles mutaciones A2058G y A2059G.
Para las tetraciclinas los valores de CMI también oscilaban entre 0,125-2 mg/L en la mayoría de los aislados. El aislado B11 fue el único que resultó ser resistente a esta droga con un valor de CMI ≥ 16 mg/L. Por otra parte, en el caso de las fluoroquinolonas, la moxifloxacina fue el antibiótico del ensayo con mayor actividad; siendo todos los aislados sensibles a este antimicrobiano con valores de CMI ≤ 0,125 mg/L. En cuanto a la levofloxacina, tampoco se detectó resistencia con valores de CMI que oscilaban entre 0,125-2 mg/L.
Aunque no se hayan encontrado aislados resistentes a fluoroquinolonas, no podemos afirmar la no circulación de cepas con este genotipo, ya que la cantidad de aislados obtenidos en este estudio, no son representativos para indicar la prevalencia de resistencia a esta clase de antimicrobiano. El primer reporte de resistencia a moxifloxacina fue en Australia, Sydney18 (Couldwell et al., 2015). Al igual en Japón se registran valores cercanos al 47 % de prevalencia.19
De esta forma se implementa una herramienta de diagnóstico molecular rápido y sensible basada en PCR en tiempo real, que permite determinar la presencia de M. genitalium y su susceptibilidad antimicrobiana a los macrólidos, directamente en las muestras clínicas, lo que disminuye el tiempo entre el diagnóstico y el tratamiento y erradicación de este microorganismo en los pacientes positivos. Este hecho contribuye a cortar las cadenas de trasmisión de las ITS causadas por esta bacteria, incidiendo de forma positiva en el programa de control de las ITS en Cuba. Los resultados del método molecular fueron corroborados mediante el aislamiento en cultivos celulares y ensayos fenotípicos de susceptibilidad antimicrobiana, logrando una total coincidencia entre el resultado de la qPCR en las muestras clínicas y los aislados correspondientes. La detección del incremento sustancial de la resistencia a macrólidos en M. genitalium desde un 18 % en 2014 hasta un 98 % en 2019, ha permitido a las autoridades sanitarias implementar protocolos de tratamiento sindrómicos antimicrobiano para las ITS más exactos, lo cual se corrobora en las bases normativas para el manejo de las ITS, recogidas en el Plan Estratégico Nacional para el Control de las ITS, el VIH, y las hepatitis 2019-2023, vigente en Cuba, contribuyendo a un mejor uso de los antibióticos en nuestro país, en consonancias a las políticas actuales de la OMS para el uso racional de los antimicrobianos.
