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INTRODUCCIÓN
En Chile hay escasa información de la composición fenólica de especies vegetales nativas del bosque mediterráneo. Entre las especies arbóreas más importantes de la región mediterránea, se destaca Cryptocarya alba (Mol.) Looser (peumo), un árbol endémico de Chile, que crece desde el sur de la provincia de Limarí (30° 30' S y 71° 00' O), hasta la provincia de Cautín (entre los 37º 35' y los 39º 35' de latitud Sur) (Rodríguez et al., 1983). Un uso potencial en la medicina tradicional, tiene esta especie, porque para el género Cryptocarya, se han descrito, aproximadamente, 40 alcaloides con propiedades antitumorales, bactericidas, antimicrobianas, fungicidas, insecticidas o antioxidantes (Avello et al., 2012; Di Cosmo et al., 2015; Bravo et al., 2017; Viktorová et al., 2020). Específicamente para C. alba, se ha encontrado un alcaloide con propiedades hepatoprotectoras, aislado de hojas y corteza (Vogel et al., 2008, Castro-Saavedra et al., 2016). También se han aislado aceites esenciales de sus hojas, como p-cymol, alfapineno, linalol, limoneno, borneol, betapineno, el 1-terpinen-4-ol, betaterpineno y eucaliptol (Vogel et al., 2008; Avello et al., 2012; Bravo et al., 2017), y flavonoides en hojas y tallos, glicósidos y ácido clorogénico (Vogel et al., 2008; Castro-Saavedra et al., 2016). Se desconocen las variaciones que presenta C. alba durante las estaciones del año y tampoco se conoce si existen cambios en las concentraciones de los compuestos fenólicos dependiente de la localización de la especie.
El objetivo de este estudio fue caracterizar y cuantificar la composición fenólica de Cryptocarya alba, en hojas y ramas jóvenes, en distintas localidades y estaciones del año. Conocer esta respuesta permitirá evaluar el potencial de Cryptocarya alba como fuente de compuestos fenólicos, y generar propuestas de zonas y épocas de mejor aprovechamiento de extracción de biomasa.
MATERIALES Y METODOS
El muestreo se realizó en siete localidades de la zona central de Chile, durante las estaciones de invierno (julio 2009), primavera (octubre 2009) y verano (diciembre 2009-enero 2010) (Figura 1). Las condiciones climáticas del periodo estival y del periodo invernal de estas localidades son mostradas en la Tabla 1. En estas localidades se seleccionaron árboles adultos, similares en tamaño y desarrollo.
Tabla 1 - Valores promedio de temperaturas media y precipitación normal anual en las localidades estudiadas, del periodo 1980-2010 (Santibáñez et al., 2016)
| Localidad | Temperatura media de verano (°C) | Temperatura media de invierno (°C) | Precipitación normal anual (mm) |
| Casablanca | 17,7 | 10,4 | 466 |
| Chorombo* | 19,3 | 9,6 | 472 |
| Til Til (alto) | 19,5 | 8,8 | 408 |
| Til Til (bajo) | 20,5 | 9,4 | 338 |
| Alhué | 19,4 | 8,6 | 554 |
| Rengo | 16,7 | 6,0 | 760 |
| Peralillo | 19,9 | 9,4 | 616 |
*Se empleó para este estudio, la estación climática más próxima: María Pinto.
Se colectaron ramillas de 20 cm de largo, con un diámetro máximo de 1,5 cm. La colecta se realizó en la sección media alta de la copa de árboles adultos, en cuatro exposiciones de la misma (Norte, Sur, Este, Oeste). Estas contenían hojas del año en curso y del anterior, completamente desarrolladas, vivas y funcionales. Se desecharon las hojas que se encontraban con síntomas de senescencia. Para el estudio de los compuestos fenólicos (polifenoles de bajo peso molecular), se utilizó un equipo de cromatografía líquida de alta resolución (HPLCDAD) marca Agilent, modelo 1200. Se empleó una columna Nova-PaK (Waters) C-18 (3,9x300mm). La separación se ejecutó con un gradiente con ácido acético al 2 % (A), acetonitrilo: ácido acético: agua (20:2:78 %; B) y metanol (C). El programa de elución comenzó con 100 % A (flujo 1 ml s-1) durante 55 min; luego, por 2 min, 20 % A y 80 % B (flujo 1,2 ml s-1); por 33 min 10 % A y 90 % B (flujo 1,2 ml s-1); finalmente, 100 % C por 2 min (flujo 1,2 ml s-1). La longitud de onda de detección fue de 280nm, y el volumen de inyección, de 30 µL.
Los estándares empleados para las curvas de calibración fueron ácidos: cafeico, clorogénico, elágico, ferúlico, gálico, protocatéquico, vainillínico; (+)-catequina; (-)-epicatequina; quercetina; aldehído vainillínico; trans-resveratrol, obtenidos de Sigma-Aldrich, 99,5 % de pureza. Los análisis se realizaron con tres repeticiones, correspondientes a tres árboles elegidos en las localidades de muestreo.
Preparación de muestras y extracción
Las muestras fueron procesadas separando ramas y hojas, las que fueron secadas a temperatura ambiente y almacenadas en bolsas de papel en un lugar fresco y en oscuridad. Hasta el momento del análisis, las hojas presentaron contenido de humedad entre el 12 y 15 %. De cada muestra se molieron separadamente 5 g de hojas secas y 10 g de ramillas secas. Estas fueron maceradas en 100 ml de una solución de metanol: agua 80:20 (v/v) durante 2 horas. Posteriormente, se centrifugaron las muestras a 3.500 rpm durante 30 minutos y luego fueron filtradas en vacío usando una membrana de 0,45 µm. El extracto obtenido se utilizó para todos los análisis descritos a continuación:
Análisis de compuestos fenólicos
El análisis de fenoles totales se obtuvo por la medición de la densidad óptica a 280 nm. Las lecturas espectrofotométricas se realizaron en un espectrofotómetro UV-VIS PharmaSpec, modelo UV-1700. Los resultados promedio de las lecturas se expresaron en mg equivalentes de ácido gálico por gramo de muestra (mgEAG g-1) (Zoecklein et al., 2001).
Los taninos condensados fueron medidos mediante la reacción de Bate-Smith, que consiste en la transformación de los taninos proantocianídicos en antocianidinas por calentamiento a 95°C por 2 horas con una solución 5 % de butanol en HCl (Bate-Smith, 1981). Los resultados fueron reportados como mg equivalentes de catequina por g de extracto (mgEC g-1).
Para la extracción de los fenoles de bajo peso molecular se tomaron 50 ml del extracto obtenido de cada muestra, para luego llevarla a un rotavapor a 35° C hasta evaporar el 80 % del volumen, para eliminar metanol. Después de completar el volumen con agua destilada hasta 50 ml, fue sometida a 3 extracciones con 20 ml de acetato de etilo y luego 3 extracciones con 20 ml éter etílico. Al extracto orgánico obtenido se agregó una sal de sulfato de sodio anhidro por 30 minutos y luego se filtró en papel, concentrándose a sequedad en un rotavapor a 35° C (Peña-Neira et al., 1999). La lámina obtenida en el matraz corazón, una vez secada la muestra, fue recuperada con 2 ml de una solución de metanol: agua (50:50; v/v), para su posterior análisis por HPLCDAD, previa filtración (0,45 µm).
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño del experimento fue de tipo factorial, considerando como factores la localidad y la estación del año. La unidad experimental correspondió, en el caso de las hojas, a 100, y en el caso de las ramillas, a 5. A todas las variables obtenidas se realizó análisis de varianza (ANDEVA). De existir diferencias significativas, se les aplicó el Test de Rango Múltiple de Duncan con un nivel de confianza del 95 %.
RESULTADOS
Composición fenólica en hojas: fenoles totales y taninos condensados
Para los fenoles totales (FT) (Figura 2)ase observó una variación en la concentración de 9,83 ± 0,05 mgEAG g-1 a 29,85 ± 4,39 mgEAG g-1 entre las estaciones de invierno a primavera, presentándose los contenidos mayores en la localidad de Til Til (alto) en ambas estaciones. Las concentraciones de FT fueron significativamente mayores en invierno, aumentando un 40 % en promedio. En invierno se observó mayor variabilidad de FT entre las localidades, mientras que en primavera y verano el contenido de FT no presentó diferencias significativas entre ellas.
Los taninos condensados (TC) (Figura 2)b, en general, presentaron un rango de concentración entre 7,06 ± 1,36 mgEC g-1 y 32,00 ± 3,46 mgEC g-1, mostrando el mínimo valor en la localidad de Alhué (verano) y el máximo, en Casablanca (invierno). Para TC, también se presentaron las concentraciones mayores en invierno. Los resultados mostraron que el factor geográfico o localidad afecta el contenido de compuestos fenólicos significativamente, en las tres estaciones del año.
Composición fenólica en hojas: fenoles de bajo peso molecular
No flavonoides. Todos estos compuestos aumentaron su concentración durante la primavera, y en la mayoría de éstos disminuyó su concentración o no fueron identificados durante el verano (Figura 3). Las localidades de Casablanca y Til Til (alto), en promedio, presentaron las concentraciones más altas de este grupo de compuestos. Para el ácido cis-clorogénico, se observaron concentraciones que van de 3,26 ±1,85 µg g-1 a 34,22 ± 6,61 µg g-1 durante invierno y primavera, no siendo identificado en verano (Figura 3)a. Para el ácido trans-clorogénico (Figura 3)b se detectaron concentraciones entre 0,43 ± 0,12 mg g-1 y 13,21 ± 6,23 mg g-1, con la concentración más alta en la localidad de Casablanca, durante la primavera. Para el ácido cafeico, se obtuvo la máxima concentración de 14,59 ± 4,71 µg g-1 en la localidad de Til Til (bajo), durante la primavera, y en esta misma localidad, este compuesto no pudo ser detectado en verano. Los resultados muestran que existe interacción entre los factores analizados, observándose diferencias significativas entre las estaciones del año y entre las localidades, siendo la primavera, el momento en que presentan mayores concentraciones (Figura 3)c. En la Figura 3d, se aprecia el contenido de ácido ferúlico, con concentraciones similares a los observados para el ácido cafeico. En primavera se observó la mayor concentración promedio respecto al invierno. También existe interacción entre los factores analizados para la concentración del éster del ácido cafeico, mostrando diferencias significativas entre estaciones y entre localidades. Las diferencias entre las localidades están presentes en primavera y verano (Figura 3)e. Para el caso del éster del ácido ferúlico, se obtuvieron concentraciones entre 3,25 ± 2,95 µg g-1 y 42,76 ± 13,92 µg g-1 entre las estaciones y localidades analizadas. Se aprecia interacción entre los factores estudiados y diferencias significativas entre las estaciones (Figura 3)f. El ácido protocatéquico (Figura 3)g, presenta rangos de concentración entre 0 µg g-1 y 9,5 µg g-1 entre las estaciones y localidades analizadas, presentando concentraciones significativamente mayores en primavera.
Letras mayúsculas indican diferencias significativas entre estaciones y letras minúsculas entre localidades analizadas (n=3).Fig. 3 - Compuestos fenólicos no flavonoides (ácido cis-clorogénico (a), ácido trans-clorogénico (b), ácido cafeico (c), ácido ferúlico (d), éster del ácido cafeico (e), éster del ácido ferúlico (f), ácido protocatéquico (g)) presentes en hojas de Cryptocarya alba, según localidad y estación del año
Flavonoides. Se observó la misma tendencia que los compuestos no flavonoides, mostrando mayores concentraciones en primavera (Figura 4). También las localidades de Casablanca y Til Til (alto) presentaron las concentraciones más altas.
Letras mayúsculas indican diferencias significativas entre estaciones y letras minúsculas entre localidades analizadas (n=3).Fig. 4 - Compuestos fenólicos flavonoides (flavonoles (a), procianidinas (b), (+)-catequina (c), (-)-epicatequina (d)) presentes en hojas de Cryptocarya alba, según localidad y estación del año
Para los flavonoles (correspondientes a la suma de todos los flavonoles identificados), se observaron concentraciones promedio entre 0,49 ±0,05 mg g-1 y 5,7 ±0,99 mg g-1, donde el valor mínimo correspondió a la localidad de Alhué en verano, mientras que el máximo se registró en la localidad de Til Til (alto) en primavera. En primavera se encontraron las concentraciones significativamente mayores, con respecto a las otras estaciones (Figura 4)a.
Las procianidinas presentan concentraciones entre 0,58 ±0,06 mg g-1y 4,47 ±0,88 mg g-1. Se observó interacción entre estación del año y localidad, y diferencias significativas entre las estaciones, pues en primavera, se obtuvieron concentraciones promedio significativamente mayores (Figura 4)b. Resultaron concentraciones entre 13,3 ± 2,6 µg g-1 y 415 ± 56,34 µg g-1 para la (+)-catequina, con el mínimo valor correspondiente a la localidad de Rengo, en verano, y el máximo, para la localidad de Til Til, en primavera (Figura 4)c. En la Figura 4d, se observan concentraciones entre 0 µg g-1 y 169,92 ± 57,59 µg g-1 para (-)-epicatequina. Existe relación entre las estaciones del año, las localidades y el contenido de (+)-catequina y (-)-epicatequina, observándose diferencias significativas entre las estaciones, siendo en primavera donde se encuentran las concentraciones significativamente mayores para ambos compuestos, al compararla con las otras estaciones del año (70 % para (+)-catequina y 84 % para (-)-epicatequina. La estación de verano es la que presenta la menor concentración. Entre las localidades existen diferencias significativas en las tres estaciones, para ambos compuestos. En invierno, se observa que las concentraciones promedio más altas, están presentes en la localidad Casablanca y Til Til (alto), y en primavera, en la localidad de Til Til (alto).
Composición fenólica en ramas jóvenes: fenoles totales y taninos condensados
En las ramas jóvenes de C. alba se observaron concentraciones entre 0,68 ± 0,55 mgEAG g-1 y 1,61 ± 0,6 mgEAG g-1 para FT; el valor mínimo correspondió a Peralillo, en primavera y el máximo a Til Til (bajo), en invierno (Figura 5)a. Por otra parte, se encontraron concentraciones entre 1,23 ± 0,15 mgEC g-1 y 2,53 ± 0,41 mgEC g-1 para TC. El valor mínimo correspondió a Rengo, en verano, y el máximo a Til Til (alto), en primavera (Figura 5)b. Se encontraron diferencias significativas entre las localidades, para ambos compuestos, las cuales se presentaron en primavera y verano, para los FT, y solo en verano, para los TC.
Letras mayúsculas indican diferencias significativas entre estaciones y letras minúsculas entre localidades analizadas (Concentraciones promedio ± desviación estándar con n=3).Fig. 5 - Fenoles totales (a) y taninos condensados (b) presentes en ramas jóvenes de Cryptocarya alba, según localidad y estación del año
Composición fenólica en ramas jóvenes: fenoles de bajo peso molecular
No Flavonoides. Los compuestos no flavonoides identificados en ramas de C. alba fueron tres: ácido protocatéquico, ácido cafeico y ácido vainillínico (Figura 6). Particularmente no se encontró presencia de ácido vainillínico en el período de verano, en ninguna localidad. La concentración de ácido cafeico tendió a aumentar hacia el verano y solo en Rengo no se detectó el compuesto en ningún período.
Letras mayúsculas indican diferencias significativas entre estaciones y letras minúsculas entre localidades analizadas (n=3).Fig. 6 - Compuestos fenólicos no flavonoides (ácido protocatéquico (a), ácido cafeico (b), ácido vainillínico (c)) presentes en ramas jóvenes de Cryptocarya alba, según localidad y estación
Flavonoides. Los compuestos flavonoides encontrados en ramas jóvenes de C. alba son los mismos compuestos que se presentan en las hojas (Figura 4 y Figura 7), pero la concentración es 90 % menor.
Letras mayúsculas indican diferencias significativas entre estaciones, y letras minúsculas, entre localidades analizadas (n=3).Fig. 7 Compuestos fenólicos flavonoides (flavonoles (a), procianidinas (b), (+)-catequina (c), (-)-epicatequina (d)) presentes en ramas jóvenes de Cryptocarya alba, según localidad y estación del año
DISCUSIÓN
La composición y concentración de compuestos fenólicos presentes en hojas de C. alba variaron con la localidad y la estación del año, tal como se ha informado en otras especies vegetales. En bosques boreales se observaron que las hojas de Betula pubescens Ehrh. (Abedul de montaña), presentan una amplia diferencia en la acumulación de compuestos fenólicos dependiendo de la estación del año, encontrando que las concentraciones de proantocianidinas aumentan a medida que avanza la temporada de verano. Sin embargo, procianidinas unidas a la pared celular, galotaninos y flavonoides glicosilados, bajan su concentración luego de un incremento inicial, en hojas jóvenes (Wam et al., 2017). En el caso de las hojas de Quercus robur L. (roble), se encontró también una variación estacional de los compuestos fenólicos, además de que las proantocianidinas totales aumentan a lo largo de la temporada estival y otros compuestos como taninos hidrolizables totales, flavonoides glicosilados, glicósidos de quercetina y glicósidos de kaempferol decrecen en su concentración en el mismo periodo (Salminen et al., 2004; Burlacu et al., 2020). El lugar geográfico también es un factor en la acumulación de los compuestos fenólicos en las plantas, pues las condiciones climáticas y nutricionales inciden en la actividad de la Fenilalanina amonioliasa (Kováèika et al., 2007; Sharma et al., 2019).
Aunque en los últimos años el cambio climático global ha modificado tanto las temperaturas como la cantidad de precipitaciones en el área de estudio (mostrando una razón de incremento de 0,13°C por década y acentuando los episodios de sequía), estos cambios han afectado en forma similar a toda la zona central de Chile (Villarroel et al., 2020). La constatación de los resultados presentados se refuerza por el trabajo de Giordano et al., (2019), quienes también indicaron que la localidad de Til Til (Cuesta La Dormida) presentó los contenidos más altos de compuestos fenólicos de la parte aérea de árboles C. alba.
En el caso de ramas jóvenes de C. alba, la concentración fue menor que la mostrada en las hojas, mas no se observaron diferencias significativas para FT y TC entre estaciones del año. Por lo tanto, para continuar con este tipo de estudio y determinar la época adecuada de extracción de estos compuestos, es mejor utilizar hojas. Especies como Vaccinium angustifolium Aiton y Vaccinium myrtillus L. también presentan una mayor concentración de compuestos fenólicos en sus hojas que en sus ramas, raíces y frutos (Harris et al., 2007; Witzell et al., 2003; Stefãnescu et al., 2019).
Se observó una variación en la composición y concentración de fenoles no flavonoides en hojas y ramas de C. alba, y entre localidades y estaciones del año. El ácido trans-clorogénico fue el compuesto mayoritario identificado en extractos de hojas de C. alba. La máxima concentración encontrada de ácido trans-clorogénico (13 mg g-1) fue baja comparada a otras especies vegetales, como es el caso de Ilex paraguariensis A.St.-Hil. (hierba mate), con concentraciones de 97 mg g-1(Marques y Farah, 2009; Meinhart et al., 2019), y Coffea canephora Pierre ex A. Froehner (café), con concentraciones de 95 mg g-1(Farah y Donangelo, 2006; Pérez-Hernández et al., 2013).
En hojas de C. alba, el ácido cis-clorogénico y ácido ferúlico disminuyeron totalmente su concentración en verano y en todas las localidades. Esto sugiere un comportamiento propio de C. alba, asociado a la reducción de humedad en el suelo, elevada radiación solar y altas temperaturas. Para ramas jóvenes también se observó un comportamiento atribuido a la especie, conque se redujo totalmente la concentración de ácido vainillínico en verano, y en todas las localidades. Un comportamiento similar ha sido descrito para ramas de nogal (Juglans regia L.) con una disminución de primavera a verano para compuestos no flavonoides como los ácidos clorogénico y vainillínico (Solar et al., 2006; Binbin et al., 2017). La disminución hacia el final de la estación de crecimiento en el contenido de compuestos fenólicos no flavonoides, puede resultar de tres causas principales: (1) tasa decreciente de su biosíntesis, (2) conversión en componentes insolubles unidos a la pared celular y (3) transformación activa en compuestos oligo- y poliméricos; por ejemplo, taninos o ligninas. Además, estas consecuencias pueden estar dadas, en parte, a un efecto de dilución por un contenido relativo creciente de componentes de la pared celular, en la hoja y ramas como celulosa, hemicelulosa, pectina y lignina (Nurmi et al., 1996; Vanholme et al., 2019).
Uno de los mecanismos de adaptación a radiación UV-B más documentado es el aumento de la producción de metabolitos secundarios tales como fenoles y flavonoides, los que se acumulan en las células de la epidermis de diversas especies vegetales y por ser compuestos que absorben radiación entre los 280-360 nm, reducen el efecto deletéreo de la luz UV-B sobre los distintos componentes celulares (Rozema et al., 2002; Klein et al., 2018). Los flavonoides cumplen funciones asociadas a la respuesta de la planta a la luz y controlan los niveles de las auxinas reguladoras del crecimiento y diferenciación de las plantas y, además, se han detectado papeles antifúngico y bactericida (Martínez-Florez et al., 2002; Saxena et al., 2012).
En ramas de algunos cultivares de nogal Solar et al., (2006) y Binbin et al., (2017) observaron para flavanoles como la (+)-catequina y flavonoles como la miricetina, una mayor concentración en primavera respecto a las otras estaciones del año, lo que concuerda con las diferencias entre las estaciones del año para estos grupos de compuestos en C.alba.
CONCLUSIONES
La composición y la concentración de compuestos fenólicos varían con la localidad y estación del año, en hojas y ramas jóvenes de C. alba. Las hojas poseen concentraciones mayores de compuestos fenólicos a las encontradas en las ramas. Específicamente, las máximas concentraciones de fenoles y taninos totales, en hojas, se observan en la estación de invierno. Para el caso de las ramas, la concentración se mantiene constante. El compuesto fenólico mayoritario identificado en esta especie fue el ácido trans-clorogénico, seguido de procianidinas y flavonoles. Respecto a los compuestos fenólicos de bajo peso molecular en hojas de C. alba, estos aumentan su concentración en la estación de primavera, y la mayoría, bajan su concentración, o no son identificados, durante el verano. Por lo tanto, es necesario identificar los posibles usos de las hojas con el momento de cosecha. La mejor época para extraer compuestos fenólicos en hojas de C. alba sería la temporada de invierno-primavera. Y los mejores sectores fueron Til Til (alto) y Casablanca. Las mayores concentraciones de fenoles totales y taninos condensados encontrados en las hojas de C. alba permiten suponer un buen potencial para ser usadas en la industria alimentaria, farmacológica y cosmética.
Agradecimientos
A la Ingeniera Forestal Marie Claire Aravena por su apoyo en la elaboración de la imagen. Este estudio ha sido realizado gracias al proyecto "Propuestas de modelos de gestión y conservación de la biodiversidad en bosques mediterráneos. Programa Domeyko Biodiversidad, Vicerrectoría de Investigación y Desarrollo, Universidad de Chile.
