Introducción
La pérdida del equilibrio de las diferentes condiciones fisicoquímicas, nutricionales y ambientales de la cavidad bucal favorecen la aparición de microsistemas bacterianos.1 La dinámica de la infección de los conductos radiculares constituye un ambiente especial en el cual los mecanismos selectivos ocurren y ciertas bacterias sobreviven y se multiplican con más facilidad.2 El Enterococcus faecalis (E. faecalis) es considerado el microrganismo más resistente que sobrevive después de los tratamientos de los conductos radiculares. También es la principal bacteria asociada a las lesiones perirradiculares persistentes, pues resiste a las sustancias irrigadoras y medicamentos intracanales; con una prevalencia del 80-90 % en estos casos.3E. faecalis es un anaerobio facultativo, que tiene la capacidad de adherirse a la dentina e invadir los túbulos dentinarios siendo capaz de formar una biopelícula resistente a las soluciones de irrigación, así como a los medicamentos intracanales.2
La medicina tradicional a base plantas medicinales se ha convertido en una alternativa terapéutica con gran potencial para el desarrollo de nuevos fármacos y productos capaces de controlar procesos infecciosos, inclusive en el campo de la odontología.4 Por mostrar estas propiedades, diversas plantas, tanto las originarias como las de uso cotidiano, han sido propuestas como tratamiento. El Origanum vulgare L. pertenece a la familia Lamiaceae y es cosechada a gran escala en la región sur del Perú. Este es uno de los productos con mayor valor de exportación, principalmente por su uso culinario, aunque tradicionalmente sus hojas han sido empleadas por sus propiedades diuréticas, antiespasmódicas y antisépticas.5 Subproductos como los aceites esenciales (AE) han demostrado poseer una gran actividad antibacteriana frente a diversos grupos bacterianos. Los AE constituyen mezclas complejas compuestas por monoterpenos, sesquiterpenos, flavonoides y derivados; y sus constituyentes dependen de diversos factores como el origen de la planta, las condiciones climáticas y los métodos de extracción.6 El AE del Origanun vulgare L. ha demostrado poseer actividad importante contra bacterias gram negativas como Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, y gram positivas como Staphylococcus epidermidis y Propionibacterium acnés.7,8 Estas propiedades se atribuyen a los diversos componentes aislados del AE como los fenoles, ácidos fenólicos, flavonoides carvacrol y timol.9
El uso de derivados fitoquímicos de plantas ha sido propuesto para el manejo de las infecciones de orden endodóntico. Así, por ejemplo, Prabhakar y otros10 demostraron que el uso de derivados de Triphala y polifenoles de té verde presentaron efectos positivos, aunque menores para el control de biofilm de E. Faecalis formado en substrato dentario (halos de inhibición de 24 mm y 22 mm) al compararlo con hipoclorito de sodio al 5 % (NaOCl) (36 mm). Mathew y otros11 indicaron el efecto antimicrobiano de un extracto herbal experimental a base de Syzium aromaticum, Eucalyptus globulus, Cinnamomim zeylanicum y Mentha piperita como irrigante endodóntico similar al NaOCl al 5,25 %, pero menor a la clorhexidina al 2 % (halos de inhibición de 9 mm, 8 mm y 14 mm). Datos similares fueron reportados por Benbelaid y otros,12 para el control de biofilm radicular de E. Faecalis y Candida albicans empleando una solución irrigadora a base de AE de cinnamomum cassia al 1,25%.
Borzini y otros 5) realizaron una revisión de la literatura publicada entre 1982 y 2015, exponiendo que la fitoterapia como quimioterapéutico para el uso de irrigantes de conductos radiculares han demostrado un resultado promisorio en estudios in vitro. Recientemente, Tiwari y otros,13) manifestaron que el uso sinérgico del AE de Origanum vulgare e hidróxido de calcio frente a E. Faecalis en un modelo in vitro fue efectivo como medicamento intracanal al compararlo con pasta triple antibiótica (halos de inhibición de 25,0 mm y 27,4 mm).
Estos estudios denotan el interés por el empleo de compuestos químicos derivados de productos naturales, como las plantas aromáticas, que permitan el control bacteriano de diversas especies. Se sabe que la actividad antibacteriana del AE de Origanun vulgare L. y de sus principales constituyentes está relacionada con la interferencia del gradiente de pH del medio e inhibe la actividad de la ATPasa frente al patógeno (E. Faecalis), lo que disminuye su producción energética celular, además, altera la actividad de los canales de calcio a nivel de su membrana celular, aumentando su permeabilidad y, consecuentemente, contribuyendo a su lisis celular.14,15
Entonces, el objetivo del presente estudio fue identificar la composición química Origanum vulgare L. (orégano) y evaluar su actividad antibacteriana frente a E. faecalis ATCC 29212.
Métodos
Se llevó a cabo una investigación de tipo experimental in vitro, prospectiva, de corte transversal y analítica. La muestra requerida para este estudio fue calculada empleando el programa EPi infoTM al comparar las medias de estudios previos, el número mínimo de repeticiones fue ocho para el ensayo de difusión de disco. Este estudio fue aprobado por la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Privada de Tacna (registro No. 560-2019-UPT/FACSA-D).
Obtención de los aceites esenciales
Se recolectaron 2 kg de plantas frescas de orégano en la provincia de Tarata de la región de Tacna, Perú, durante el mes de enero de 2019. Las muestras fueron identificadas taxonómicamente como Origanum vulgare L. en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann bajo el registro No. 5278. Las hojas fueron desecadas a temperatura ambiente antes de su uso. La obtención del AE se realizó en un aparato de destilación tipo Soxhlet por arrastre de vapor de agua durante dos horas. La concentración del AE obtenido a partir de Origanum vulgare L. se determinó a través del cálculo de la densidad. El AE fue almacenado en un vial ámbar y refrigerado a 4 °C hasta su uso.
Caracterización química del aceite esencial
La identificación de los componentes químicos del AE se realizó con el método de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-EM), empleando un cromatógrafo QP2010 Ultra Shimazu equipado con una columna DB-5 MS. Se empleó helio como gas de carga con un flujo constante de 1 mL/min, el volumen de inyección del AE fue de 1,0 µL diluido al 5 % en diclorometano a un ratio de 1:75. Los componentes químicos se identificaron a través del índice de retención y el espectro de masas se reflejó por el número de picos registrados en el cromatograma al compararlos con la librería NIST 08.
Difusión de disco para la actividad antibacteriana del aceite esencial
Se empleó la cepa de E. Faecalis ATCC 29212 correspondiente a la American Type Culture Collection, que fue reactivada en Agar cerebro-corazón (BHA, Liofilchem®, Italia) e incubada por 24 horas a 37 °C. Posteriormente se realizó una tinción gram para la identificación morfológica del cultivo, enseguida cinco colonias fueron transferidas a un tubo de ensayo conteniendo 5 mL de medio cerebro-corazón (BHI, Liofilchem®, Italia) que fue incubado por 7 horas a 37 °C, hasta alcanzar el crecimiento logarítmico de la cepa. El crecimiento bacteriano se ajustó a la escala McFarland de 0,5 equivalente a una concentración de 1,5 x 108 UFC/mL y 200 µL fueron transferidos a placas Petri con Agar Müller Hinton (Detroit, Michigan, EE. UU.). Se calcularon distintos volúmenes del AE desde 2,5 µL hasta 30 µL; las respectivas concentraciones se muestran en la tabla 1.
No. | Volumen (µL) | Concentración (mg/µL) |
---|---|---|
1 | 2,5 | 2,261 |
2 | 5,0 | 4,522 |
3 | 7,5 | 6,783 |
4 | 10,0 | 9,044 |
5 | 12,5 | 11,305 |
6 | 15,5 | 13,566 |
7 | 17,5 | 15,827 |
8 | 20,0 | 18,088 |
9 | 22,5 | 20,349 |
10 | 25,0 | 22,610 |
11 | 27,5 | 24,871 |
12 | 30,0 | 27,132 |
Se emplearon 8 discos de papel Whatman No. 3 de 6 mm de diámetro cargados con cada uno de los volúmenes del AE. Se empleó clorhexidina al 0,12 % y agua destilada como control positivo y negativo, respectivamente. Los discos fueron colocados sobre las placas inoculadas con la cepa de E. faecalis y fueron incubados por 48 h a 37 °C en condiciones de microaerofilia. Por último, las zonas de inhibición de crecimiento bacteriano fueron medidas en milímetros con un compás Vernier digital (Ubermann©). Para evaluar la sensibilidad se empleó las pautas resumidas de Duraffourd y Lapraz,16 valores de halos de inhibición menores de 8 mm son considerados como: sin sensibilidad (-); entre 9-14 mm, sensible (+); de 15-19 mm, muy sensible (++); y mayores que 20 mm, sumamente sensible (+++).
Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida
La concentración mínima inhibitoria (CMI) se determinó a partir de las concentraciones en las que se observaron halos de inhibición considerados como muy sensibles, empleando el método de dilución en tubo. Se preparó una solución madre de 20 mL conteniendo 1 mL de aceite esencial y 1 mL de dimetilsulfoxido al 10 %. A cada tubo conteniendo como medio cerebro-corazón (BHI) se le agregó solución madre y 100 µl de un inóculo de E. faecalis ajustado a la escala 0,5 de McFarland, calculando las concentraciones para un volumen final de 3 mL por tubo. Los tubos fueron incubados por 24 h a 37 °C. La CMI se determinó como la mínima concentración en donde se observó la ausencia de turbidez en los tubos. Para evaluar la concentración mínima bactericida (CMB) se realizaron subcultivos en Agar Müller Hinton de alícuotas de 10 µL de las diluciones correspondientes a la CMI y las dos anteriores. Las placas Petri fueron incubadas por 24 h a 37 °C. La CMB se consideró como la menor concentración de las diluciones de los aceites esenciales que impidió el crecimiento visible de unidades formadoras de colonia (UFC/mL).
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados descriptivamente para evaluar el comportamiento de la media y la desviación estándar. Adicionalmente, los datos correspondientes a los halos de inhibición fueron sometidos a la prueba de análisis de la varianza (ANOVA) empleando el software SPSS v.22.0 para Mac Os (SPSS Inc., Chicago Illinois). Se adoptó un nivel de significancia de p < 0,05.
Resultados
Se obtuvieron 10 mL de AE, lo que representó un rendimiento de 0,5 % (v/p) con una densidad de 904,4 mg/mL. La CG-EM identificó 20 constituyentes del AE de Origanum vulgare L. De ellos, los principales compuestos fueron alpha.-pinene (24,44 %) y 1,6-Ocatien-3-ol,3,7,7dimethyl (12,52 %). El porcentaje del resto de compuestos y los tiempos de retención se presentan en la tabla 2.
Pico | Compuesto | Área % | Tiempo de retención (min) |
---|---|---|---|
1 | .beta._Myrcene | 5,53 | 8,487 |
2 | (+)-4-Carene | 10,6 | 9,250 |
3 | Benzene,1-methyl-4-(1-methyl | 6,21 | 9,414 |
4 | 1S-.alpha.-Pinene | 1,78 | 9,861 |
5 | .alpha.-Pinene | 24,44 | 10,221 |
6 | Cis-.beta.-Terpineol | 4,82 | 10,478 |
7 | Bicyclo[4.1.0]hept-2-ene,3,7,7 | 3,83 | 10,826 |
8 | 1,6-Octadien-3-ol,3,7-dimethy | 1,6 | 11,067 |
9 | Cis-.beta.-Terpineol | 13,37 | 11,178 |
10 | 2-Cyclohexen-1-ol,1-methyl-4 | 1,63 | 11,667 |
11 | Terpineol,cis.-beta.- | 0,58 | 12,025 |
12 | Benzene,2-methyoxy-4-methyl- | 1,26 | 13,601 |
13 | 1,6-Ocatien-3-ol,3,7dimethy | 12,52 | 13,904 |
14 | Thymol | 5,34 | 14,661 |
15 | Benzenemethanol,4-(1-methyl | 0,58 | 14,809 |
16 | 1,3,6-Heptatriene,2,5,6.trimet | 0,49 | 15,451 |
17 | 2,6-Ocatiend-1-ol,3,7-dimethy | 0,2 | 15,946 |
18 | Caryophyllene | 3,68 | 16,893 |
19 | .alpha.-Caryophyllene | 0,39 | 17,409 |
20 | 1,3,6-Heptatriene,2,5,6-trimet | 1,14 | 17,955 |
Las medias de los halos de inhibición presentados por las distintas concentraciones del AE Origanum vulgare L. frente a E. Faecalis se resumen en la tabla 3. Los resultados mostraron que existieron diferencias estadísticamente significativas entre todas las concentraciones de Origanum vulgare L. probadas (p = 0,000). Las concentraciones mayores de 13,566 mg/µL fueron muy sensibles según la escala de Durafford y Lapraz con halos de inhibición entre 13,093 ± 0,844 y 21,611 ± 4,299 mm.
Agente | Volumen | Concentración mg/µL | n | Media | DE | |
---|---|---|---|---|---|---|
Aceite esencial de |
2,5 | 2,261 | 8 | 7,956 | 1,256 | 0,000 |
5,0 | 4,522 | 8 | 10,475 | 1,100 | ||
7,5 | 6,783 | 8 | 11,568 | 1,034 | ||
10,0 | 9,044 | 8 | 12,085 | 0,470 | ||
12,5 | 11,305 | 8 | 12,621 | 0,862 | ||
15,0 | 13,566 | 8 | 13,093 | 0,844 | ||
17,5 | 15,827 | 8 | 15,170 | 0,572 | ||
20,0 | 18,088 | 8 | 15,953 | 1,313 | ||
22,5 | 20,349 | 8 | 17,593 | 1,556 | ||
25,0 | 22,61 | 8 | 17,319 | 1,507 | ||
27,5 | 24,871 | 8 | 19,264 | 1,486 | ||
30.0 | 27,132 | 8 | 21,611 | 4,299 | ||
Clorhexidina | 20,0 | 0,12% | 8 | 19,345 | 1,345 | |
Agua destilada | 20,0 | - | 8 | 0,00 | 0,00 |
En la tabla 4 se presentan la CMI y CMB del AE de Origanum vulgare L. frente a E. faecalis. Todas las concentraciones inhibieron el crecimiento bacteriano, mientras que las concentraciones mayores de 14,018 mg/µL fueron bactericidas (Fig. 1).
No. | Concentración (mg/µL) | CMI | CMB (UFC) |
---|---|---|---|
1 | 15,827 | Negativo | 0 |
2 | 15,600 | Negativo | 0 |
3 | 15,374 | Negativo | 0 |
4 | 15,148 | Negativo | 0 |
5 | 14,922 | Negativo | 0 |
6 | 14,692 | Negativo | 0 |
7 | 14,470 | Negativo | 0 |
8 | 14,244 | Negativo | 0 |
9 | 14,018 | Negativo | 0 |
10 | 13,792 | Negativo | 2 |
11 | 13,566 | Negativo | 4 |
Discusión
En los últimos años existe un gran interés en investigar las propiedades biológicas de los productos naturales. Estudios recientes se han centrado en los beneficios de los aceites esenciales debido a sus comprobados efectos antimicrobianos frente a diversos agentes patógenos.7,8,17 En nuestro estudio, los principales compuestos aislados del AE fueron terpenos, entre ellos, .alpha.-Pinene (24,44 %), Cis-.beta.-Terpineol (13,37 %) y 1,6-Ocatien-3-ol,3,7dimethyl (12,52 %). Estos resultados difieren de los de Cleff y otros,18) para quienes 4-terpineol (47,95 %), carvacrol (9,44 %) y timol (8,42 %) fueron los compuestos más representativos. Coccimiglio y otros,9 encontraron como principales componentes del AE de Origanum vulgare recolectado en Kynouria (Peloponeso) analizado por CG-EM, carvacrol (59,46 %) y timol (25,00 %). Asimismo, en una muestra analizada de Origanum vulgare oriunda de Arabia Saudita se detectaron 153 constituyentes a través de CG-EM y detección de ionización de flama en las hojas y tallos de esta planta, el timol fue el mayor compuesto encontrado (68,7 %).19 Estas diferencias pueden estar suscitadas por factores como el origen de cosecha de la planta, la temporalidad, las condiciones ambientales y los métodos de extracción y análisis químico.5
Respecto al uso del AE de Origanum vulgare y sus principales constituyentes en el campo de la odontología, Nosrat y otros,14 demostraron que el uso de carvacrol al 0,6 %, uno de los principales constituyentes de Origanum vulgare, como un irrigante radicular tuvo un efecto positivo sobre la desinfección de conductos radiculares, específicamente sobre E. Faecalis, y que, además, posee propiedades antiinflamatorias, por cuanto restringe la enzima elastasa neutrofílica y suprime la producción de prostaglandinas que contribuyen al desarrollo de la inflamación. Respecto a la citotoxicidad, el reporte de Ok y otros,20 señaló que el extracto de orégano en concentraciones de 0,5-4,5 % mostró menor citotoxicidad que el NaOCl al 5,25 %; estos resultados podrían respaldar su uso como alternativa a la irrigación de conductos radiculares con NaOCl.
Nuestros resultados demostraron que el AE de Origanum vulgare L. presenta una importante actividad antibacteriana frente a E. Faecalis ATCC 29212. En concentraciones desde 2,261-27,132 mg/µL genera halos de inhibición de 7,956-21,611 mm, considerándose entre muy sensible (++) y sumamente sensible (+++). Este efecto puede ser atribuido a los principales constituyentes encontrados en el AE, entre ellos, .alpha.-Pinene (24,44 %), Cis-.beta.-Terpineol (13,37 %) y 1,6-Ocatien-3-ol,3,7dimethyl (12,52 %). No fue objetivo del presente estudio aislar los componentes del AE de Origanum vulgare L. sino evaluar su sinergismo. Sin embargo, es necesario realizar futuros procedimientos de fraccionamiento del AE para poder aislar cada uno de los constituyentes y evaluar sus propiedades antibacterianas.
Algunos estudios han sugerido que la actividad antibacteriana de los terpenoides, que fueron los principales constituyentes del AE estudiado, está relacionada con el efecto que poseen estos sobre la estructura de la membrana celular bacteriana, ya que bloquean la actividad de los canales de calcio y disminuyen la producción energética y de síntesis estructural de la membrana de las bacterias.14,15Tiwari y otros13 expusieron que la asociación entre el AE de Origanum vulgare y el hidróxido de calcio generó zonas de inhibición sobre Agar Müller Hinton de 25,0 ± 1,0 mm, mientras que una pasta triple de antibióticos (ciplrofloxacino + metronidazol + mycociclina) produjo zonas de inhibición 27,4 ± 4,1,5 mm frente a E. Faecalis. Sus resultados sugieren que la combinación entre el AE de Origanum vulgare y el hidróxido de calcio pueden ser usados como una alternativa a los medicamentos intracanales convencionales. En otro estudio realizado por Benbelaïd y otros,21 el efecto del AE la variedad Origanum vulgare glandulosum sobre diversas cepas de E. Faecalis, encontrando halos de inhibición de 28 ± 1 mm.
En cuanto a la CMI, nuestros resultados demostraron que concentraciones mayores a 13,566 µg/mL inhibieron el crecimiento de E. Faecalis. Benbelaïd y otros21) encontraron una concentración mínima inhibitoria de 0,063 µg/mL del AE de Origanum vulgare glandulosum frente a E. faecalis. En nuestro estudio se realizaron diluciones con concentraciones de 15,827-13,566 µg/mL, siendo en todos los casos negativo. Estos datos sugieren que es posible conseguir concentraciones inhibitorias mínimas con diluciones menores del AE de Origanum vulgare L. proveniente de la región Tacna, aunque aún son necesarios ensayos adicionales.
En conclusión, y considerando las limitaciones del estudio in vitro, los resultados mostraron que los principales constituyentes del aceite esencial de Origanum vulgare L. proveniente de la región Tacna, en Perú, fueron .alpha.-Pinene y Cis-.beta.-Terpineol. También se demostró un importante efecto antibacteriano de Origanum vulgare L. frente a una cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212. Son necesarios estudios adicionales para evaluar la citotoxicidad del aceite esencial, las propiedades biológicas de los constituyentes aislados del aceite esencial, la formulación de posibles productos derivados y el estudio de sus propiedades en modelos in vivo, considerando su potencial uso en infecciones endodónticas persistentes.