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Introducción
La preeclampsia (PE) es uno de los síndromes en mujeres embarazadas de mayor interés en todo el mundo, que afecta al 3-8 % de todos los embarazos.1 Es un trastorno multisistémico caracterizado por hipertensión, proteinuria y edema, que se cree sea resultado de una activación y disfunción endotelial difusa. Aunque se desconoce su etiología exacta, se piensa que los síntomas maternos son secundarios a la disfunción de las células endoteliales.2 Varios estudios han informado que existe un desequilibrio entre los peróxidos de lípidos (LPO) y los antioxidantes en la preeclampsia y sugieren que este factor puede contribuir al daño del endotelio.3 Se ha observado que los marcadores de la peroxidación lipídica aumentan en el plasma de las mujeres con preeclampsia.4
La enfermedad se diagnostica tardíamente porque los síntomas surgen cuando el daño se hace evidente. Recientemente, se han desarrollado algunos modelos predictivos, basados en métodos estadísticos para detectar el diagnóstico precoz de la PE. Este es el caso de Akolekar,5 que desarrolló un modelo para su predicción y obtuvo una correlación lineal entre la proteína A de plasma (PAPP-A) y el factor de crecimiento placentario (PLGF) con edad gestacional en el momento del parto y, por lo tanto, la desviación de lo normal fue mayor para el inicio temprano de la PE en los biomarcadores.
Los métodos multivariados analizan simultáneamente múltiples medidas de cada individuo investigado para la toma de decisiones óptimas. Entre sus variantes, el Análisis Discriminante podría usarse como un método de clasificación y atribución de nuevas observaciones en grupos predefinidos utilizando para esos fines las funciones discriminantes.
El objetivo del Análisis Discriminante Lineal (LDA) es separar varias observaciones en clases conocidas.6,7 El Análisis Discriminante Lineal de Fisher (FLDA) es una combinación lineal de marcadores observados o medidos que describen las separaciones entre grupos conocidos de observaciones. Esta función expresa la combinación lineal de las variables independientes canónicas que maximizan las diferencias entre los grupos y permiten el desarrollo de un modelo predictivo que clasifica a los nuevos individuos según su grupo de pertenencia. En este sentido, Gunay y otros8 analizaron los espectros medidos con análisis de componentes de banda y aplicaron análisis de componentes principales- análisis discriminante lineal (PCA-LDA) a los datos de espectroscopia en muestras de suero de mujeres preeclámpticas y sanas.
El presente artículo ha tenido como objetivo desarrollar un modelo predictivo de preeclampsia a partir del estado redox en embarazadas, que clasifique a las mujeres pertenecientes a los grupos de gestantes preeclámpticas y gestantes sanas.
Métodos
Se realizó un estudio transversal de enero a diciembre de 2017. Un total de 51 embarazadas (12 preeclámpticas y 39 aparentemente normales), con edades en el rango de 21-35 años, se incluyeron en el estudio después de obtener el consentimiento informado por escrito. Las gestantes fueron ingresadas en dos hospitales maternos de la provincia Santiago de Cuba. El diagnóstico de la PE en el momento de la admisión fue definido por los criterios de expertos ginecólogos. El consentimiento ético para el estudio se obtuvo del Comité de Ética institucional.
El diagnóstico de la PE fue basado en el criterio del Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología (ACOG): presión arterial sistólica = 140 mmHg y / o presión diastólica = 90 mmHg, tomada en intervalos de dos veces en 6 horas; proteinuria = 300 mg en 24 horas en pacientes embarazadas de al menos 20 semanas y edema persistente después de 12h de reposo en cama. Los criterios de exclusión para el grupo de preeclampsia incluyeron nefropatías, hipertensión crónica, enfermedades autoinmunes, trombofilia, diabetes mellitus, enfermedades de células falciformes y algunas condiciones obstétricas (embarazos múltiples, mola hidratiforme, eritroblastosis fetal y polihidramnios).
Los datos demográficos y clínicos se recopilaron a partir de entrevistas y registros clínicos. Las variables incluidas fueron edad, etnia, índice de masa corporal, número de abortos espontáneos, hábitos tóxicos, ingesta de nutrientes, antecedentes patológicos familiares (APF) de PE y la ganancia de peso. Se consideró un aumento de peso exagerado cuando superaba los 0,75 kg/semana.1 La presencia de edema y proteinuria fue evaluada cualitativamente.
Las variables metabólicas incluidas en este estudio fueron glutatión reducido (GSH), catalasa (CAT), malondialdehído (MDA), transaminasa glutámico pirúvica (ALAT), proteínas totales (PT), bilirrubina total (BT), ácido úrico (AU), lactato deshidrogenasa (LDH), colesterol (COL) y triglicéridos (TG). GSH y CAT se incluyeron como indicativos de una protección antioxidante adecuada y MDA ha sido reportado como un marcador de daño oxidativo de lípidos.9
Se tomaron 5 ml de sangre completa y se transfirieron inmediatamente a tubos estándar de 10 ml. Previo a las pruebas bioquímicas, se realizó un protocolo de centrifugación estándar para obtener el suero sanguíneo. En orden de prevenir la auto-oxidación, el suero se conservó a -86 ° C cuando las determinaciones metabólicas se retrasaron.
La concentración de metabolitos se adquirió en un analizador químico HITACHI R902 (Hitachi, Japón) en el laboratorio clínico del Hospital General ¨ Dr. Juan Bruno Zayas Alfonso¨ en Santiago de Cuba. La concentración de GSH se determinó utilizando un método colorimétrico DTNB estándar a 412 nm.10 La concentración de CAT (U/ml /min) se determinó mediante la técnica colorimétrica basada en el consumo de peróxido de hidrógeno, medido a 240 nm.11 El MDA se ensayó a 586 nm por reacción con el reactivo cromogénico N-metil-2-fenilindol a 45 oC.12 Las curvas de calibración para GSH y MDA se obtuvieron usando soluciones estándar (10,54 nm de solución inicial para GSH y 101.0μM para MDA). Se utilizó un espectrofotómetro UV-T60 (Kaia Business International S.A, Alemania) para todas las mediciones.
Las variables cualitativas y cuantitativas se organizaron en un conjunto de datos de dimensiones 51 x 17. El análisis estadístico multivariante de las variables se realizó mediante GNU PSPP 1.0.1 (GNU General Licencia Pública, Fundación de Software Libre). Cuando fue relevante, se consideró un nivel significativo en p < 0,05. El análisis de componentes principales (PCA) se realizó a partir de los datos de media centrada para evaluar la dimensionalidad adecuada de las variables. El análisis discriminante fue aplicado al conjunto de datos utilizando el criterio de Fisher (FLDA) como una regla de decisión bayesiana.13 La Lambda de Wilks permitió evaluar el poder discriminante del modelo resultante.
El modelo fue formulado como una combinación lineal de los valores de esas variables con una elevada contribución a la diferenciación de los grupos. La validación cruzada de Leave-one-out (LOOCV)14) se utilizó para evaluar el rendimiento y potencia clasificatoria del modelo FLDA. En este estudio, el modelo FLDA fue construido a partir de un set de datos de N -1 mujeres y la mujer excluida se clasificó utilizando el modelo. Por lo tanto, 51 pruebas fueron utilizadas para evaluar la consistencia de la clasificación.
Resultados
Un total de 51 mujeres fueron incluidas en este estudio. El análisis cualitativo de PCA reveló que la combinación de variables clínicas y de laboratorio proporciona un espacio de separación para ambos grupos y este hecho es claramente visible desde el gráfico PCA de los dos primeros componentes. Los vectores mostraron que las principales fuentes de diferenciación entre los dos grupos estudiados fueron aportadas principalmente por el MDA, la proteinuria y el edema. Sorprendentemente, GSH y CAT no contribuyeron a la aglutinación de sujetos en los grupos, sin embargo, contribuyeron a la diferenciación intra-grupo. En menor medida, otras fuentes de diferenciación provinieron de PT, LDH, TG, WG y UA.
El plotscatter de las dimensiones 1 y 2 en la matrix score fue calculada por el PCA, mostrando un espectro que fue usado para la elaboración del modelo FDA. Los círculos rojos representan el espectro para las gestantes sanas y los verdes para el grupo de PE respectivamente (Fig. 1).
El análisis discriminante identificó 5 de los 17 parámetros como discriminadores significativos de preeclampsia (p < 0,001): MDA, LDH, GSH, TP y TG. Este resultado está en concordancia con el del PCA. La función discriminante canónica obtenida de fue:
D = 1,702 - 0,706 (GSH) + 0,454 (MDA) + 0,389 (TG) - 0,093 (PT) + 0,007 (LDH)
Donde (X) representa la concentración del metabolito correspondiente. La tabla 1 muestra los resultados de la FLDA.
La matriz de confusión mostró que el 100 % de los casos originalmente agrupados se clasificaron correctamente, mostrando una especificidad y sensibilidad del 100 %. El alto valor de la correlación canónica (95,8 %) también indica la membresía adecuada de las mujeres embarazadas en los grupos establecidos a priori por criterios de expertos. El elevado autovalor asociado a la función discriminante (11,047) explica el 100 % de la varianza en el conjunto de datos (Tabla 2).
Tabla 2 Autovalor asociado a la función discriminante
| Función | Autovalor | % de varianza | % acumulado | Correlación canónica |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 11,047a | 100,0 | 100,0 | 0 ,958 |
Nota: Se ha empleado la primera función discriminante canónica en el análisis
Indicador ŋ2 de bondad de ajuste a los datos del modelo obtenido (ŋ2: coeficiente de correlación obtenida de la regresión entre la variable de dicotomía) que indica la pertenencia al grupo y las puntuaciones discriminantes.
Los centroides, como punto medio de la distribución de las puntuaciones individuales de los grupos, resumen la mejor clasificación. En nuestra función discriminante los centroides de los grupos mostraron valores distantes entre embarazadas sanas (-1,807) y preeclámpticas (5,873). Esto demostró la contribución en mayor medida al poder discriminante de la función. El CV mostró que todos los casos fueron correctamente clasificados. La figura 2 muestra la distribución de los índices discriminantes (ID) obtenidos para cada análisis de LOOCV alrededor de los centroides, representando a cada clase. La dispersión alrededor de los centroides es menor en mujeres embarazadas sanas que en las de PE y la mayoría de los sujetos se encuentran en el intervalo de 1SD. Un comportamiento similar a fue obtenido a partir del modelo FLDA en todo el conjunto de datos para cada ejecución de LOOCV (Fig. 2).
Discusión
La MDA resultó el componente metabólico de mayor importancia, contribuyendo sustancialmente a la diferenciación entre grupos. Su papel ha sido demostrado tanto en PCA como en análisis discriminante. Varios autores15,16) han destacado la utilidad de este metabolito como marcador de la peroxidación lipídica. Su contribución a la varianza en PCA y la inclusión en el modelo tiene un significado valioso en la utilidad del modelo. El análisis FLDA también incluye a los TG en la función discriminante. El alto valor de los coeficientes obtenidos para el modelo FLDA refuerzan el papel de GSH, MDA y TG en la clasificación. Está, por tanto, en correspondencia con los resultados obtenidos por estos investigadores en relación con la influencia del proceso de peroxidación lipídica en esta entidad.
El GSH es más afectado por metabolismo inherente a los cambios que se producen durante la gestación que los de la PE, tal como lo demuestra el PCA. Sin embargo, resulta un valioso parámetro como indicador de estrés oxidativo en mujeres embarazadas y podría ayudar a prevenir el sobreajuste de FLDA. La combinación del GSH con el MDA en la función discriminante descubre la relación oculta de la variabilidad de los datos y estos metabolitos, reforzando la hipótesis del papel que juega el estrés oxidativo en la patogenia de la PE.
La LDH, a pesar de estar incluida en la función discriminante, muestra un pequeño coeficiente (0,007). Desde el punto de vista biológico, esta es una enzima que está relacionada con el metabolismo de la glucosa. Tal vez los cambios en su actividad o concentración podrían estar correlacionados con un desequilibrio energético u otras complicaciones (daño microangiopático) en lugar de un desequilibrio redox en los grupos estudiados.
El PCA resultó un valioso método para la exploración de datos iniciales, al aportar la contribución de cada variable. Este trabajo complementa la investigación previa de los autores utilizando PCA.17 La disminución del valor de Lambda de Wilks (0,083) aseguró que la matriz de covarianza es una buena representación de las variables que contribuyen a la discriminación de los grupos y muestra que las funciones del modelo tienen una buena correlación con ellas.
El uso de métodos estadísticos multivariantes ayuda a descubrir información subyacente útil para procesos de modelado y efectos, por ejemplo, la clasificación de muestras y cuáles variables varían en los estados de enfermedad en comparación con el estado saludable. Además, el FLDA usando un conjunto reducido de las variables de PCA, dan como resultado un modelo que separa claramente los estados de preeclampsia y el grupo control. En este sentido, el PCA ayuda en la búsqueda de las variables más influyentes del conjunto de características maternas reflejadas en entrevistas y registros clínicos, así como los marcadores moleculares que podrían incluirse como indicadores predictivos en estudios posteriores. Malihe18 mostró un estudio para predecir la preeclampsia solo por los perfiles de hemoglobina a través de análisis discriminante longitudinales y concluyó que los niveles de hemoglobina pueden usarse para predecir preeclampsia. Otro estudio19fue dirigido a determinar si las mujeres preeclámpticas desarrollaban anomalías en hemoglobinas menores, enzimas glucolíticas u otros componentes de la sangre. Estos autores incluyen dentro de la función discriminante el LDL. Se conoce que estas lipoproteínas son más susceptibles a los ataques oxidativos, por lo que podría ser un buen candidato como predictor de la PE.
El método LOOCV contribuyó con una valiosa fuente de información al proporcionar a cada muestra un peso estadístico equivalente en el análisis discriminatorio, sin necesidad de proporcionar un test y la validación de casos. También asegura optimizar el modelo para reducir la necesidad de muestras disponibles de un gran número de muestras. En este sentido, las ejecuciones muestran que el efecto de excluir cada embarazada no está afectando el comportamiento del modelo. La mayoría de los casos restantes en el intervalo 1 de desviación estándar (DS) señala la robustez del poder clasificatorio del mismo.
Es importante resaltar que una región de riesgo podría definirse entre los dos centroides. Estudios prospectivos actuales se están llevando a cabo para probar la correlación con la información clínica. El modelo predictivo resultante muestra una alta sensibilidad y especificidad (ninguna gestante con PE fue clasificada como saludable).
El diagnóstico de laboratorio de la PE ha revolucionado en los últimos años, con métodos que evalúan el daño placentario20 y molecular.21 Estos métodos utilizan biomarcadores placentarios como: proteína plasmática A asociada al embarazo (PAPP-A) y estudios de asociación genética (Gen: G-A 506). Aunque estos marcadores son los elegidos por su alta especificidad y sensibilidad, los marcadores metabólicos que se proponen podrían brindar una ayuda precisa e inmediata en el diagnóstico, tal como se ha demostrado en este trabajo. El uso de estas pruebas de laboratorio convencionales en la salud primaria y secundaria, combinados con análisis de tipo multivariado podrían proporcionar valiosas herramientas que ayuden a los expertos en la evaluación de gestantes desde la captación. Este estudio destaca la relevancia del modelo propuesto, reforzando la hipótesis de que estos metabolitos, determinados de forma rutinaria, podrían utilizarse para detectar la aparición o el riesgo de PE. Se realizan estudios actuales para validar esta hipótesis, basados en la sensibilidad y efectividad del modelo, los cuales serán posteriormente publicados.
Conclusiones
La contribución y relación de algunas variables en la fisiopatología de la preeclampsia es mejorada en gran medida con el empleo de métodos multivariados. La inclusión de la MDA y GSH en el modelo discriminante proporciona una herramienta para probar la implicación del estrés oxidativo en su fisiopatología.
El modelo propuesto puede considerarse apropiado para clasificar los casos de preeclampsia en nuestras condiciones y mostrar a los biomarcadores como buenos candidatos para la clasificación y como potenciales indicadores predictivos de preeclampsia.
