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INTRODUCCIÓN
El ovocito se considera como único, al poseer cualidades que lo hacen diferente de las demás células del cuerpo; sin embargo, su cualidad más importante es la de ser la célula gestora del desarrollo embrionario preimplantacional. Actualmente ha sido materia de intensa investigación por ser el componente más importante en el potencial del desarrollo embrionario, por lo que se ha llegado a considerar que el éxito clínico de las técnicas de reproducción asistida se sustenta en la calidad ovocitaria (1).
La evaluación morfológica es una de las técnicas más utilizadas para determinar, de forma inmediata, la calidad del ovocito. En humanos, cerca del 60 % al 70 % de los ovocitos exhiben una o más características anormales, por lo que, al presentar estas alteraciones morfológicas o dimorfismos, permiten establecer parámetros puntuales de evaluación (2).
Algunas características morfológicas anormales del ovocito, a nivel citoplasmático y extracitoplasmático, pueden influir en los procesos de la reproducción animal asistida, como son: la fecundación, la formación y la morfología de los pronúcleos, la división embrionaria, el desarrollo embrionario, la calidad embrionaria, la formación del blastocito, la implantación, el embarazo bioquímico (embarazo no confirmado por la visualización de un embrión en ultrasonido) y la formación de aneuplodías (2).
Actualmente, la mayoría de los estudios de evaluación ovocitaria se realizan en humanos, debido al gran avance en las clínicas de reproducción asistida con técnicas como la fertilización in vitro (FIV) y la Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) (3), mientras que en animales no se han descrito anormalidades, especialmente en ovinos domésticos. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue describir la frecuencia de las alteraciones morfológicas presentes en ovocitos de ovino doméstico madurados in vitro (MIV).
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta de ovarios
Se colectaron ovarios de ovejas domésticas (Ovis aries) tipo criollo, sacrificadas en un rastro del Estado de México. Los ovarios se transportaron al laboratorio en un termo con solución salina fisiológica (NaCl 0,9 % y 1 % de antibiótico y antimicótico), a una temperatura de 30-35 °C, en un tiempo máximo de una hora (4).
Obtención y selección de Complejos Ovocito Cúmulo (COC)
En el laboratorio, los ovarios se lavaron tres veces consecutivas con solución salina fisiológica isotérmica. Los Complejos Ovocito Cúmulo (COC) se obtuvieron por aspiración de folículos ováricos de 2-5 mm de diámetro, utilizando una aguja hipodérmica de calibre 20G x 32 mm y una jeringa de 10 mL. Para ello se empleó medio de cultivo de tejidos 199 (TCM-199) con Hepes suplementado con 100 UI/mL de Sal de Sodio de Heparina (5).
Los COC recuperados se contabilizaron para calcular la tasa de obtención y, posteriormente, se colocaron en placas Petri de 55 mm de diámetro, para clasificarlos usando un microscopio estereoscópico (Olympus, SZ61). La clasificación de los COC se realizó por el número de capas de células de la granulosa sobre la base de los criterios de Kakkassery et al. (6):
Maduración in vitro de ovocitos
Una vez seleccionados los COC de Clase A-B, se lavaron dos veces consecutivas en 1 mL de medio con heparina. Para la maduración in vitro (MIV) se usaron placas estériles de cuatro pozos (Thermo-Scientific Nunc, Rochester NY), colocando 50 COC en cada pozo con 500 µL de medio de maduración a base de TCM-199 sin Hepes suplementado con Cisteína (0,57 mM), D- glucosa (3,05 mM), Alcohol polivinílico (0,1 %), Piruvato de sodio (0,91 mM), 10 % de Suero Fetal Bovino (SFB), Hormona Coriónica Humana (hCG, 5 UI/mL), Hormona Folículo Estimulante (FSH, 1.3 µL/mL), Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) (10 µg/mL) y Antibiótico-antimicótico 100X (2 %); los pozos se cubrieron con aceite mineral. Los COC se incubaron durante 21 horas a 38 °C, 5 % de CO2 en aire y 60 % de humedad relativa (7).
Denudación de los Complejos Ovocito Cúmulo
De acuerdo a la metodología de Kragh et al. (8), después del periodo de MIV los ovocitos fueron desprovistos de sus células del cúmulo; para ello, todos los COC se recuperaron de la caja de cultivo y se colocaron en un vial que contenía 500 µL de hialuronidasa (0,5 mg/mL). Durante cinco minutos se realizó pipeteo constante; luego, el contenido del vial se vació en una placa Petri que contenía TCM-199 con Hepes suplementado con 2 % de SFB para inactivar la reacción enzimática. Los ovocitos se clasificaron en dos grupos: de morfología normal y ovocitos dañados. Estos últimos, a su vez, se evaluaron de acuerdo a los criterios de ASEBIR (2) para identificar el tipo y la frecuencia de las siguientes alteraciones:
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se realizaron 10 repeticiones y se colectaron 567 ovarios, de los cuales se obtuvieron 2 374 ovocitos, con una tasa de 4,2 ovocitos por ovario. De los ovocitos obtenidos, 798 (33,6 %) se clasificaron con morfología normal y 1 576 con alteraciones morfológicas (66,4 %) (Tabla 1). En la Tabla 2 se enumeran las alteraciones morfológicas citoplasmáticas identificadas en ovocitos de ovino madurados in vitro.
TABLA 1 Obtención de ovocitos con morfología normal y alterada. / Obtaining oocytes with normal and altered morphology.
| Ovarios | Tasa de obtención | Ovocitos | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Morfología normal n(%) | Alteración morfológica n(%) | ||||
| Total | 567 | 4,2* | 2 374 | 798(33,6)a | 1 576(66,4)b |
a,b Letras diferentes indican diferencia significativa (p<0,05).
*Promedio de ovocitos obtenidos por ovario.
La presencia de alteraciones morfológicas en el ovocito compromete el desarrollo y la calidad del futuro embrión; sin embargo, la causa de estas alteraciones, en muchos casos, no ha sido esclarecida, tampoco la relación que existe con las características intrínsecas del propio ovocito (9). Actualmente, los reportes en esta temática solo se encuentran descritos para la especie humana, por lo que no hay datos documentados y comparables en la especie ovina.
Faramarzi et al. (10) clasificaron ovocitos de humanos y reportaron tan solo 23 % de ovocitos con morfología normal y 77 % de ovocitos que presentaron alguna alteración morfológica, lo que es similar a lo reportado en este trabajo (34 y 66 %, respectivamente).
TABLA 2 Principales alteraciones morfológicas en ovocitos de ovino madurados in vitro. / Main morphological alterations in sheep oocytes matured in vitro.
| Alteraciones | Categorías | Total n(%) |
|---|---|---|
| Citoplasmáticas | Citoplasma granuloso | 513(32,6) |
| Citoplasma incompleto | 333(21,1) | |
| Presencia de vacuolas | 183(11,6) | |
| Ovocitos degenerados | 141(8.9) | |
| Extracitoplasmáticas | Espacio perivitelino aumentado | 184(11,7) |
| Alteración de la zona pelúcida | 111(7,0) | |
| Exudados citoplasmáticos | 74(4,7) | |
| Dimorfismo del cuerpo polar | 4(0,3) | |
| Por técnica | Sin zona pelúcida | 33(2,1) |
Considerando que el ovino es una especie monovular como los humanos, lo que representa un modelo animal óptimo por su cercanía con la fisiología reproductiva, la humana (11), una de las anomalías que con mayor frecuencia presentan los ovocitos de humanos es el citoplasma granuloso. Este puede deberse al colapso de algunos organelos celulares, como el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi (9). Esta anomalía se encontró en el 32,6 % de los ovocitos de ovino evaluados.
El citoplasma incompleto fue la segunda anomalía más frecuente en los ovocitos ovinos (21,1 %) y, aunque se desconoce la causa de esta anomalía, se ha relacionado con los procesos apoptóticos que desencadenan la condensación del citoplasma (12).
La presencia de numerosas vacuolas es común en ovocitos de ovino (11) y se describen como lagunas de absorción de líquido del espacio perivitelino, consecuencia de una posible dilatación del retículo endoplásmico liso y del aparato de Golgi (13). Su frecuencia en humanos va desde 3 % (10), 3,9 % (14) y 5-12 % (15); datos similares a lo encontrado en el presente estudio en ovocitos de ovino (11,6 %). Por otro lado, la disminución en el número de vacuolas se relaciona con el proceso de maduración y con la edad en ovinos, disminuye su número durante la maduración y su presencia es menor en animales prepúberes. Se desconoce el contenido de las vacuolas, aunque se supone que son ricas en lípidos saturados como el ácido palmítico y esteárico, los mismos que componen los triglicéridos de los ovocitos de ovino, bovino y porcino (16).
Otzuki et al. (17) mencionan la presencia de grupos, o agregados de retículo endoplásmico liso, como una de las anomalías presentes en ovocitos humanos que pueden causar alteraciones en el trofoectodermo afectan la masa celular interna del blastocisto y causan anomalías en él. Stigliani et al. (18) observaron que estos agregados semejan vacuolas y se derivan de alteraciones en el citoesqueleto. También señalan que se presentan en ovocitos en MII y que afectan la competencia del ovocito debido a una señalización anormal del calcio durante su activación, una actividad respiratoria anormal de las mitocondrias, los errores cromosómicos y la citocinesis anormal.
El espacio perivitelino aumentado se relaciona con una sobremaduración del ovocito y su frecuencia va de 15 % (14) a 22 % en humanos (10), lo cual se encuentra por encima de lo observado en este estudio (11,7 %).
En cuanto a las alteraciones de la zona pelúcida (engrosamiento, oscuridad, deformación, etc.), se relacionan con la foliculogénesis cuando esta capa de glicoproteínas se sintetiza; en humanos se presenta con una frecuencia de 15 % (14) a 16 % (10). Estos valores están por encima de lo obtenido en este trabajo (7 %).
Los exudados citoplasmáticos son causados por un deterioro de la zona pelúcida y la estimulación excesiva de gonadotropinas; su frecuencia está reportado en humanos por Faramarzi et al. (10) en 22 %, valor también por encima de lo aquí obtenido (4,7 %).
El dimorfismo del cuerpo polar (tamaño, fragmentación, etc.) se asocia con una carencia de la formación del huso meiótico y daños generados por el proceso de MIV. Sousa et al. (14) reportan 10 a 15 % de frecuencia, mientras que Faramarzi et al. (10) informan 23 %. Nuevamente, estos valores en humano superan a lo encontrado en esta especie en el presente estudio (0,3 %).
Ebner et al. (19) mencionan que algunas alteraciones involucradas con la organización del citoplasma, la concentración de ATP, la formación del huso mitótico y la distribución de los cromosomas se debe a una disminución del aporte sanguíneo al folículo que genera hipoxia en ovocitos humanos.
Se concluye que, dada la alta tasa de anormalidades morfológicas presentes en los ovocitos de oveja doméstica madurados in vitro, es importante efectuar una selección minuciosa y evaluar su calidad, basada en la morfología del ovocito y, posteriormente, implementar técnicas de evaluación de la calidad, con la finalidad de obtener mejores resultados en el desarrollo embrionario in vitro en esta especie.
