Artículo Original

Efectos beneficiosos de las células vero sobre la capacidad de desarrollo de embriones bovinos producidos in vitro

Beneficial effects of vero cells on the developmental capacity of in vitro-produced bovine embryos

0000-0003-4628-1007Boris Ramos Serrano¹  , 0000-0002-3294-4917José Ernesto Hernández-Pichardo^{1  *} 

¹Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal. Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X). Calzada del Hueso 1100, Colonia Villaquietud, Delegación Coyoacán, CP. 04960, México, D.F.

Resumen

El cocultivo de embriones es una alternativa efectiva para mejorar la capacidad de desarrollo de embriones producidos in vitro bajo condiciones subóptimas. Embriones bovinos producidos por las técnicas de fertilización in vitro (FIV) y clonación somática (CS) fueron cocultivados sobre monocapas células Vero y evaluados los porcentajes de desarrollo alcanzados. En los embriones obtenidos por FIV se observó un incrementó altamente significativo en el porcentaje de la primera división embrionaria 75,4 % (n=614/814) vs. 60,9 % (n=564/926) (p<0,0052), y la producción de blastocistos 17,8 % (n=145/814) vs. 8,1 % (p<0,0001), en ambos casos, en condiciones de cocultivo o no, con células Vero, respectivamente. En el grupo de embriones clonados se observaron diferencias significativas en la producción de blastocistos 28,9 % (n=193/668) vs 10,2 % (n=83/814) (p<0,0001) cocultivados con o sin células Vero, respectivamente. Se obtuvo un promedio de 101±61,0 núcleos/embrión (n=12 blastocistos) cuando fueron cocultivados en monocapas de células Vero. Los resultados confirman la capacidad del cocultivo con las células Vero para incrementar los porcentajes de producción de blastocistos bovinos por las técnicas de fertilización in vitro y clonación somática.

Palabras-clave: Células Vero; cocultivo de embriones; factores embriotróficos

Abstract

Embryo co-culture is an effective alternative to improve the developmental capacity of embryos produced in vitro under suboptimal conditions. Bovine embryos produced by in vitro fertilization (IVF) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) techniques were co-cultured on Vero cell monolayers and the development percentages reached were assessed. In IVF-derived embryos, a highly significant increase was observed in the percentage of first cleavage 75.4 % (n=614/814) vs. 60.9 % (n=564/926) (p<0.0052), and blastocyst production 17.8 % (n=145/814) vs. 8.1 % (p<0.0001); in both cases, under co-culture and non-culture conditions, using Vero cells, respectively. A mean of 101±61.0 nuclei/embryo (n=12 blastocysts) was obtained when co-cultured in Vero cell monolayers. The results confirm the ability of co-culture with Vero cells to increase the production percentages of bovine blastocysts by IVF and SCNT techniques.

Key words: Vero cells; embryo co-culture; embryotrophic factors

Introducción

La producción in vitro de embriones bovinos ofrece una oportunidad invaluable para el desarrollo de múltiples biotecnologías reproductivas que impactan el desarrollo económico y científico del sector ganadero (¹). Sin embargo, bajo condiciones tropicales la calidad de los gametos obtenidos está comprometida (²), limitando su uso en otras biotecnologías más avanzadas (³,⁴).

Una alternativa para el mejoramiento de la viabilidad de los embriones producidos in vitro es el uso de los sistemas de cocultivo, específicamente utilizando monocapas de células Vero (⁵). Con este método se han obtenido resultados superiores en el desarrollo in vivo e in vitro de embriones de varias especies. Se plantea que estas células ejercen sus efectos positivos principalmente por tres vías, i) secreción de factores embriotróficos, ii) por detoxificación del medio de cultivo, y iii) reducción de algunos constituyentes del medio de cultivo como la glucosa (⁶-⁸).

Es ampliamente conocido que el estrés calórico y nutricional afectan el comportamiento reproductivo y calidad de los gametos en los bovinos (⁹-¹¹). En Cuba la principal fuente para la obtención de los Complejos Cumulo-Ovocitos (CCOs) inmaduros bovinos provienen de ovarios colectados de hembras sacrificadas para el consumo humano, muchas de ellas eliminadas de los rebaños por la pérdida de la fertilidad, asociadas a causas de envejecimiento, o estrés nutricional o calórico (¹²). En este sentido, el mejoramiento de la calidad de los gametos extraídos de estas hembras permitiría abordar otras biotecnologías reproductivas.

Considerando los criterios planteados, nos propusimos evaluar si el cocultivo con células Vero incrementa el desarrollo in vitro y calidad de los embriones bovinos producidos por las técnicas de fertilización in vitro y clonación somática, utilizando ovarios de matadero como fuente de CCOs.

Materiales y métodos

Reactivos y medios de cultivo in vitro

Los medios de cultivo se elaboraron con agua ultrapura (18 MΩ, calidad Milli-Q) y reactivos químicos calidad SIGMA, Ltd. En el caso del medio de cultivo CR1aa fue elaborado en el laboratorio (¹³). Todos los medios de cultivos se esterilizaron por filtración (poro de 0,22 µm Ø, MiniSart) y se conservaron durante un período máximo de cuatro semanas a 4 °C en frascos de cristal (500 mL) sellados.

Ovarios bovinos de mataderos donantes de CCOs inmaduros

Los ovarios se adquirieron del matadero local "Manolo Rojo" (Municipio Nueva Paz, Empresa Cárnica Tauro, Mayabeque) ubicado a dos horas de viaje con respecto al laboratorio. Como donantes se aprovecharon hembras adultas mestizas (Hosltein/Cebú) con una condición corporal entre 1,5 a 2 de una escala de 5 puntos. Los ovarios colectados fueron depositados en una solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7.2) suplementada con 50 µg/mL de sulfato de gentamicina (Sigma, G4793) y transportados hasta al laboratorio a una temperatura entre los 28 y 30 °C.

Maduración in vitro de los CCOs inmaduros

Los CCOs fueron extraídos por el método de punción folicular considerando folículos con diámetros entre 3 a 5 mm. Una vez extraídos los CCOs fueron clasificados teniendo en cuenta el: i) número de capas del cumulus oophorus, ii) la compactación del c. oophorus, y iii) la homogeneidad e intensidad del color del citoplasma del óvulo. Los CCOs seleccionados fueron madurados en medio TCM 199 (Sigma, M4530) suplementado con gonadotropinas a razón de 10 µg/mL de FSHp (Sigma, F2293), 10 µg/mL de LHo (Sigma, L5269), 1 µg/mL de 17 β Estradiol (Sigma, E2758) y 10% de suero fetal bovino inactivado (Catalog No. 11550356, GIBCO, USA). Además, se le agregó 10 ng/mL del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF-hr, Lote 03IFAB864, CIGB, La Habana, Cuba), 1 mM de glutamina (Sigma, G8540), 0,2 mM de piruvato de sodio (Sigma, P4562) y 50 µg /mL de sulfato de gentamicina (Sigma, G4793). La maduración in vitro se realizó en cajas de cultivo de cuatro pocillos (Four Wells, Nunclon ™, Delta, Surface, Denmark), donde se depositaron 400 µL de medio de maduración TCM 199 por pocillo y entre 25 a 30 CCOs/ pocillo. Inmediatamente, los CCOs se incubaron por espacio de 22 h en una atmósfera compuesta por 100 % de humedad relativa, 5% de CO₂ en aire y a 38,5 °C. Se consideraron como criterios de maduración citoplasmática y nuclear: i) Expansión y grado de mucificación del c. oophorus, y ii) la extrusión del primer cuerpo polar.

Fertilización in vitro de los CCOs maduros

La capacitación y selección de los espermatozoides móviles se realizó por el principio de Swim-Up (¹⁴,¹⁵). Del nitrógeno líquido se extrajeron cuatro pastillas de semen congelado y depositaron individualmente en tubos cónicos con 1 mL de medio de capacitación TALP-SPERM [Elaborado en el laboratorio; (¹⁴)], enriquecido con 0,2 mM de piruvato de sodio (Sigma, P4562), 6 mg/mL de BSA (Sigma, A3311) y 50 µg/mL de sulfato de gentamicina (Sigma, G4793). Cada muestra se incubó a 37 °C durante 1 h. Luego, el sobrenadante de las muestras se extrajo mezclándolas suavemente en un sólo tubo. Los espermatozoides se centrifugaron dos veces (200 x g) por 10 minutos, intercalando entre ellas un cambio de medio fresco TALP-SPERM. Del precipitado formado se tomó aproximadamente 1 x 10⁶ espermatozoides, y fueron depositados en medio TALP-FERT (microgotas de fertilización de 400 µL). Este medio fue suplementado con 0,2 mM de piruvato de sodio, 6 mg/mL de BSA (Sigma, A6003), 5 mM de glucosa (Sigma, G6152), 50 µg /mL de sulfato de gentamicina (Sigma, G4793), 10 µg/mL de sulfato de heparina (Sigma, H3149) y la mezcla correspondiente de activadores 2mM D-Penicilamina (Sigma, P4875), 1 mM de hipotaurina (Sigma, H1384) y 250 µM de epinefrina (Sigma, E4250). Seguidamente, los CCOs maduros se distribuyeron en las microgotas de fertilización in vitro a razón de 30 CCOs por pocillo y se coincubaron con los espermatozoides por 48 h. Se consideró como único criterio de fertilización los cigotos divididos a las 48 horas post inseminación. Los cigotos obtenidos fueron cocultivados en microgotas de 400 µL de medio CR1aa con o sin células Vero según el diseño experimental. En general se utilizó una atmósfera de cultivo compuesta por 5% de CO₂ en aire, 100% de humedad relativa y una temperatura de 38,5 °C.

Producción in vitro de los embriones clonados

La CS se realizó por el método tradicional de Wilmut et al., 1997 (¹⁶). Ovocitos en MII (18-20 horas post maduración) fueron desnudados por pipeteo en medio de manipulación suplementado con 0,3 mg/mL de hialuronidasa (Sigma, H4272), una vez libres de célula del cúmulo se seleccionaron los ovocitos con cuerpo polar y citoplasma homogéneo. Para la enucleación éstos se incubaron durante 20 min en medio de manipulación con citocalasina B (7,5 µg/mL; Sigma, C6762), e individualmente se le extracción del plato metafásico y el primer cuerpo polar a cada óvulo maduro. Seguidamente, los citoplastos fueron reconstruidos con fibroblastos fetales, e inducida la fusión celular en una solución de Manitol 0,3 M (Sigma, M1902), aplicando dos pulsos eléctricos 2,2 kV/cm² de una duración de 30 µs (CELLFUSION, CF150/B, BLS®, Hungría). Los complejos fundidos fueron reprogramados en medio TCM 199 que contenía cicloheximida (10 µg/mL; Sigma, C4859) y citocalasina B (5 µg/mL) más 10% suero fetal bovino. Los embriones clonados fueron cultivados en microgotas de 400 µL de medio CR1aa en la presencia o no de las células Vero según el diseño experimental.

Cultivo in vitro de las células Vero y elaboración de las monocapas para el cultivo de los embriones

Para el establecimiento de las monocapas celulares se extrajo del nitrógeno líquido un vial de células Vero (Subpase 7, concentración celular de 2,5 x 10⁶ células/ mL), e inmediatamente fue descongelado a 37 °C. El contenido del vial se diluyó en 10 mL de medio CR1aa suplementado con 2% de suero fetal bovino, y dicho volumen centrífugado a 120 x g/ 10 min. Seguidamente, el precipitado fue extraído y diluido en 10 mL de medio CR1aa a razón de 1 x 10⁵ células/mL. A partir de esta dilución se extrajo 1 mL y se depositó en cada pocillo de las placas de cultivo (4-Wells, Nunclon ™, Delta, Surface, Denmark). Las células Vero fueron cultivadas por 24 h hasta observar la formación de la monocapa, pasado ese tiempo se le retiró el 100% del medio de cultivo y añadió medio fresco CR1aa suplementado con 2% de suero fetal bovino y 12,5 µM de 2β-Mercaptoetanol (Sigma, M7522), quedando lista la monocapa para el cultivo de los embriones bovinos.

Diseño experimental

Cocultivo de los embriones producidos por las técnicas de FIV y CS

Como grupos experimentales se utilizaron los cigotos obtenidos por las técnicas de fertilización in vitro y CS. Los embriones producidos por ambas técnicas fueron divididos y cocultivados in vitro en dos condiciones sobre una monocapa de células Vero (Grupo con Vero) y grupo sin monocapa de células Vero (Grupo Control). El cultivo in vitro se realizó en placas de cuatro pocillos (Nunclon ™, Delta, Surface, Denmark). En cada pocillo se depositó 400 µL de medio CR1aa suplementado con 2% de suero fetal bovino y 12,5 µM de 2β-Mercaptoetanol. Los pocillos no se cubrieron con aceite de parafina y como máximo se depositaron 30 embriones/pocillo, finalmente los embriones se cultivaron en una atmósfera compuesta por 5% de CO₂ en aire, 100% de humedad relativa a 38,5 °C. Como principales criterios de desarrollo in vitro se evaluaron los porcentajes de la primera división embrionaria, el desarrollo de los embriones hasta estadio blastocistos (7 a 9 d post inseminación) y, en el caso de los blastocistos clonados obtenidos se realizó el conteo total de núcleos por embrión.

Análisis estadístico

Para los análisis estadísticos fue utilizada la prueba de Chi-cuadradro (²) con un nivel de significación de p< 0,05, empleando el programa GraphPad Prism version 6.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com).

Resultados y discusión

Desarrollo in vitro de los embriones producidos por FIV y cocultivados en monocapas de células Vero

Las células Vero, con características epiteliales y un origen común al tracto reproductivo (mesodermo; ver figura 1A y B), han demostrado su capacidad para estimular el desarrollo embrionario in vitro (⁵,¹⁷), en particular en condiciones subóptimas de cultivo (⁶) y en embriones micromanipulados (¹⁸). En nuestro experimento se observaron diferencias altamente significativas (Gráfico 1) en los porcentajes de embriones que alcanzaron la primera división embrionaria 75,4% vs 60,9% (p<0,0052), y el estadio de blastocisto 17,8% vs 8,1%; (p<0,0001) cuando fueron cocultivados o no, sobre células Vero. Estudios relacionados demuestran el efecto positivo que ejerce las células Vero sobre el desarrollo embrionario en bovinos, con incrementos significativos en la producción de blastocisto, de 26,5% vs 0,7% (p<0,001) (¹⁹) y 14,7% vs 2.8% (p<0,01) (²⁰), en condiciones de cocultivo o no con células Vero, respectivamente. En bovinos, los resultados publicados hasta la fecha demuestran el gran potencial de las células Vero para incrementar el desarrollo de blastocitos in vitro con valores entre un 15,7% (²¹) y 36,3% (²²). También, en humanos se ha demostrado la utilidad de los cocultivos con células Vero para la producción de blastocitos in vitro (57,0% vs 17,0%; p<0,05) (²³), y el número de blastómeros por embrión (²⁴).

Figura 1 Patrón de crecimiento de células Vero cultivadas en microgotas: A) Anclaje y estiramiento inmediato post siembra; B) Establecimiento de un clon celular (≈ 130±3 células), ≈ 24 h post siembra; C) Conformación de un parche celular listo para el cocultivo de embriones, >48 h post siembra. Morfología epitelial. / Growth pattern of Vero cells cultured in microdroplets: A) Immediate post-seeding anchorage and stretching; B) Establishment of a cell clone (≈ 130±3 cells), ≈ 24 h post-seeding; C) Formation of a cell patch ready for embryo co-culture, >48 h post-seeding. Epithelial morphology. 

Gráfico 1 Desarrollo in vitro de embriones bovinos producidos por fertilización in vitro y cocultivados en monocapas de células Vero. (Efecto del tratamiento: ** p<0,01; **** p<0,001. Prueba de Chi-cuadradro). / In vitro-produced bovine embryo fertilization and co-cultured in Vero cell monolayers (Treatment effect: ** p<0.01; **** p<0.001. Chi-square test). 

El cocultivo es una relación tripartita entre "Medio de cultivo-Células-Embrión" generándose efectos beneficiosos que favorecen el desarrollo embrionario. Entre estos, la detoxificación del medio, regulación de concentraciones de gases y metabolitos; así como la secreción de factores proteicos son los más importantes. Este último, es conocido como "sistema embriotrófico autocrino" (⁸), identificándose en cultivo de células Vero polipéptidos con pesos moleculares que oscilan entre 6,5 a 35,9 kDa, y concentraciones en el orden de 2-4 µg de proteínas/mL (²⁵).

También es interesante el uso de medios condicionados, proceso en el cual los medios de cultivos son expuestos a las células Vero durante 48h a 72h, y enriqueciendo el medio de cultivo con proteínas como: el factor de crecimiento epidérmico, factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento transformador-β, e interleucina 6, entre otros (⁶,²⁶). Se ha comprobado en otros cocultivos como las células epiteliales obtenidas de oviducto bovino (BOEC, por sus siglas en inglés) secretan proteínas en el orden de 32 - 37 µg/mL (²⁷) y células de granulosa bovina en el orden de 40 µg de proteínas/mL (²⁸). Estas proteínas, una vez purificadas e incluidas en el cultivo de embriones, a razón de 0,8-1,6 µg/µL, incrementan los porcentajes de blastocistos eclosionados (21,6% vs 1,4%; p<0.05), demostrándose su papel embriotrófico (²⁵). En bovinos se ha observado un incremento significativo en la producción de blastocistos, con diferencias de 14,7% vs 2,8% (p<0,01) (20) y 14,6% vs 0,7% (p<0,001) (¹⁹), cuando fueron utilizados medios condicionado y no condicionado, respectivamente. Este efecto también ha sido comprobado con la adición de factores de crecimiento “puros” en los medios de cultivos in vitro de embriones, reflejándose en un incremento en la tasa de desarrollo de blastocistos, así como un número superior de blastómeros por embrión, y una reducción significativa de blastómeros en apoptosis (²⁹-³¹).

Si bien las células Vero han sido una de las líneas celulares de mayor uso para el cocultivo de embriones en diferentes especies, otras líneas celulares han demostrado su capacidad de promover el desarrollo embrionario en condiciones in vitro como, por ejemplo: las células de hígado de ratas búfalo (BRL, por sus siglas en inglés) (²²), las células de riñón bovino Madin-Darby (MDBR, por sus siglas en inglés) (²⁰); y células de la granulosa, y células mesenquimales derivadas de tejido adiposo (³²).

En nuestras condiciones se extrajeron un promedio 2,4 CCOs/ovario (n=2105 CCOs/ 888 ovarios bovinos) en 17 réplicas experimentales (Resultados no publicados), con la particularidad que estos gametos provienen de hembras con baja condición corporal, como consecuencia de estrés nutricional. Si bien la viabilidad de estos gametos está comprometida por esta condición (⁹), en nuestro caso el uso del cocultivo jugó un papel beneficioso en los embriones producidos. Este resultado ofrece una opción práctica aquellos grupos que sólo cuentan con ovarios de matadero proveniente de hembras de desecho, y requieren grandes cantidades de gametos. No menos importante es una alternativa más económica en comparación con otras técnicas para la extracción de CCOs inmaduros, como las técnicas de Ovum Pick-Up (OPU, por sus siglas en inglés) (³³,³⁴) o la superovulación de hembras donantes (³⁵).

Desarrollo de los embriones clonados bovinos cocultivados en monocapas de células Vero

En un segundo experimento, un total de 1482 embriones clonados fueron divididos en dos variantes de cultivo in vitro. La presencia de células Vero tuvo un efecto positivo en los embriones micromanipulados, lográndose diferencias altamente significativas, particularmente, en el desarrollo in vitro de blastocistos, de 28,9% vs 10,2% (p<0,0001), cocultivados con o sin células Vero, respectivamente (Tabla 1). La clonación somática es una técnica compleja que por su extensa micromanipulación infringe numerosos daños a los embriones (³⁶). Los principales daños son ejercidos sobre la integridad y volumen del citoplasma embrionario, la zona pelúcida, la exposición a inhibidores de la síntesis proteica, y uso de ionóforos para provocar la activación artificial del genoma embrionario (³⁷,³⁸). Por ello, es de interés permanente la búsqueda de tratamientos y vías que permitan incrementar la viabilidad de los embriones post micromanipulación. El uso del cocultivo ha sido efectivo en otras técnicas de micromanipulación que provocan daños significativos en las citoestructuras y metabolismo de óvulos y embriones (¹⁸, ³⁹). Con embriones clonados bovinos, cocultivados con células Vero, se alcanzan altos valores de producción de blastocitos, que oscilan entre un 37,4% (⁴⁰) y un 29,8% (⁴¹).

Tabla 1 Resultados del desarrollo in vitro de los embriones clonados bovinos. / Results of in vitro development of cloned bovine embryos. 

Sistema de cultivo	Criterios Evaluados
	n	Primera División	Blastocistos
Con Vero	668	459 (68,7%)	193 (28,9%)^a
Sin Vero Grupo Control	814	518 (63,6%)	83 (10,2%)^b

Efecto del tratamiento: ^a,b p<0.0001. Prueba de Chi-cuadradro.

Treatment effect: ^a,b p<0.0001. Chi-squared test.

En el aspecto citomorfológico se comprobó que los blastocistos producidos en condiciones de cocultivo poseen un botón embrionario y trofoblasto bien definidos (Figura 2 A, B). Con una edad de siete días post cultivo in vitro, estos poseen un promedio de 101±61,0 núcleos/ embrión clonado (n=12, blastocistos), en comparación con los embriones obtenidos de cultivos sin células Vero 62±28,8 núcleos/ embrión clonado (n=12, blastocistos). Los resultados obtenidos coinciden con investigaciones previas. Por ejemplo, en medio CR1aa se obtuvieron un total de 92,5±13,3 núcleos/ embrión clonado (n=11, blastocistos), y en medio complejo Menezo-B2 se lograron 103.6±6.6 núcleos/ embrión clonado (n=27, blastocistos) (⁴⁰).

Conocer el número de núcleos que contiene un embrión producido in vitro es de vital importancia, ya que existe una estrecha relación entre el número de núcleos que posee un embrión y la viabilidad embrionaria en las etapas pre y post implantatoria. Se plantea que, para establecer una preñez a partir de la transferencia de un blastocisto bovino, con una edad de siete días post fertilización in vitro, debe tener un número crítico de 117±6 núcleos totales (⁴²). Sin embargo, esta cifra puede variar entre laboratorios, e incluso desconocerse ya que no se realizan los estudios de fluorescencia nuclear necesarios para determinar la calidad de los mismos.

Figura 2 Embriones bovinos clonados producidos in vitro A) 7 días y B) 9 días post cocultivo en monocapa de células Vero. / Cloned bovine embryos produced in vitro A) 7 days, and B) 9 days after co-culture on Vero cell monolayers. 

Otro factor determinante para obtención de buenos resultados en la producción in vitro de embriones bovinos es la correcta selección del medio de cultivo. En este experimento se utilizó medio CR1aa elaborado en nuestro laboratorio. Es un medio simple diseñado específicamente para el cultivo de embriones bovinos, y puede ser elaborado con reactivos y agua de calidad apropiados (⁴³). Es significativo la supervivencia de las células Vero nueve días en medio CR1aa sin sufrir cambios visibles de muerte celular, propiedad que permite mantener los embriones en este sistema de cocultivo por el tiempo seleccionado. Según la compañía Americana de Colecciones de cultivos Celulares (ATCC®, por sus siglas en inglés), recomienda para su cultivo utilizar el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) suplementado con 10% de suero fetal bovino, y realizarle cambios de medios de 3 a 4 veces por semana.

Esta línea celular, con morfología epitelial, conserva la propiedad de inhibición de la proliferación por contacto. Por ello, para su mantenimiento es recomendable evitar que alcance la máxima confluencia, ya que en esta fase dejan de crecer y se inician los eventos de senescencia. En nuestras condiciones, las células Vero fueron sembradas a un 50% de confluencia en pocillos con un área de 1,9 cm², a una relación de ≈520 células/mm², requiriendo entre 24 a 30 h para doblar su número y conforma una monocapa al 100% de confluencia (≈1300-1500 células/mm²). Durante el periodo de cocultivo in vitro propuesto para los embriones micromanipulados (7-9 días), no se observaron en las monocapas de células Vero signos de muerte celular o cambios mayores, como por ejemplo el desprendimiento o contracción individual de las células o de las monocapas formadas. Estudios relacionados demuestran la adaptabilidad de las células Vero en cultivos libres de suero fetal (¹⁹), en nuestras condiciones la inclusión de un 2% de suero fetal bovino fue suficiente para conservar las monocapas celulares por espacio de dos semanas.

Conclusion

Los resultados obtenidos confirman la capacidad de las monocapas de células Vero para incrementar los porcentajes de producción de blastocistos bovinos por las técnicas de fertilización in vitro y clonación somática.

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Recibido: 05 de Abril de 2024; Aprobado: 09 de Julio de 2024

^*Correspondencia a: José Ernesto Hernández-Pichardo. E-mail: [e-mail].

Declaración de conflicto de intereses: Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Contribución de los autores: Conceptualización: Boris Ramos Serrano, José Ernesto Hernández Pichardo. Análisis de datos: Boris Ramos Serrano, José Ernesto Hernández Pichardo. Investigación: Boris Ramos. Escritura del Borrador original: Boris Ramos, José Ernesto Hernández Pichardo. Revisión, edición y aprobación de la revisión final del manuscrito: Boris Ramos, José Ernesto Hernández Pichardo.