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INTRODUCCIÓN
El interés de buscar opciones que fortalezcan el combate a los insectos plagas que atacan los granos almacenados ha retomado de manera sustentable la utilización de métodos alternativos; entre los que se encuentran el uso de insecticidas botánicos por no constituir peligro de contaminación al ambiente o a la salud humana. Los extractos elaborados a partir de diferentes partes de las especies botánicas, como insecticidas en el control de plagas que afectan a las plantas cultivadas y granos almacenados, han sido prácticas frecuentes del campesinado cubano (Estrada y López, 1997).
En Cuba se han evaluado especies botánicas con actividad fitoplaguicida para la síntesis de nuevos tipos de insecticidas. Entre las plantas utilizadas se encuentran representantes de las familias Asteraceae, Apiaceae, Fabacea, Clusiaceae, Meliacea, Piperacea, Lamiaceae, Lauracea, Solanacea y Myrtaceae; las cuales poseen importantes volúmenes de aceites esenciales (Pino et al., 2013). Aspectos que muestran a las Myrtaceae como una nueva alternativa viable al control de plagas, con enfoque ecológico al mezclar materiales de plantas y granos para proteger a éstos durante el almacenamiento.
Las pérdidas poscosecha en los cereales por afectación en el peso del grano, la disminución del poder germinativo de la semilla y el aumento de la temperatura debido a la densidad de población de los insectos plagas, además de ocasionar afectaciones en su valor nutritivo, sabor y olor, constituyen mundialmente un grave problema y han contribuido al aumento de los precios de los alimentos (Suleiman et al., 2015).
En el orden Coleoptera se informan Rhizoperha dominica (Fabricius), Oryzaephilus surinamensis (Linnaeus) y al igual que Sitophilus oryzae L., como plagas que causan afectaciones en granos de maíz almacenados. Dentro de estas especies mencionadas, las afectaciones por S. oryzae se han incrementado durante los últimos años al reducir el poder germinativo, el peso específico del grano y desvalorizar el valor comercial del producto. Valdés et al. (2008) y Ramos et al. (2016) identifican a S. oryzae por su preferencia en arroz, sorgo, maíz y trigo almacenado. Por lo expuesto anteriormente, el objetivo del trabajo fue evaluar el efecto in vitro de los extractos de Pimenta dioica (L.) Merr, Callistemon citrinus (Curtis) Skeels y Syzygium malaccense (L.) Merr. & L.M. Perry sobre S. oryzae.
MATERIALES Y MÉTODOS
La colecta del material vegetal fue realizada en la etapa de floración, pues según Tavares (2002) en este estado fenológico se produce la mayor concentración de compuestos químicos secundarios. Los órganos escogidos fueron hojas adultas. Se recolectaron a partir del segundo par de hojas de las ramas seleccionadas cercanas al tallo, a una altura de 2 m del suelo, y se escogieron hojas al azar, en distintas posiciones alrededor del tallo, considerando los puntos cardinales, durante el horario de 9:00 a 11:00 de la mañana.
Posteriormente, el material vegetal fue colocado en bolsas de nylon y llevado al Laboratorio de Biología de la Facultad de Ciencias Agrarias, donde fue lavado y enjuagado con agua destilada. Inmediatamente, se realizó el secado del material en una estufa (marca Boxun) a 40 ºC, para lo que se tomó el peso de las muestras, cada dos días, hasta mantener el peso constante. Una vez secas las hojas, se procedió al molinaje de las mismas en un molino C&N Junior. Durante ese proceso se obtuvieron partículas menores de 1 mm según lo recomendado por Ramírez (2005).
El polvo obtenido en el proceso de pulverizado fue utilizado inmediatamente para la obtención de los extractos a través de tres métodos de extracción (Soxhlet, extracción asistida con Ultrasonido y Maceración). Se utilizaron solventes puros para análisis de diferente polaridad en extracciones sucesivas, n-hexano (Merk, Alemania), acetato de etilo (Merk, Alemania) y metanol (Merk, Alemania), según lo recomendado por Mesa et al. (2015).
Para la obtención de los productos a evaluar a partir de cada planta se utilizaron por separado los procedimientos de maceración, extracción asistida con ultrasonido y con extractor continuo tipo Soxhlet. En todos los procesos de extracción se partió de 50 g de material vegetal.
En el trabajo en el Soxhlet se utilizaron 200 mL y 3 horas en reflujo para cada uno de los solventes. En las extracciones asistidas con ultrasonido se emplearon 200 mL y 15 minutos de exposición para cada solvente en un equipo Ultrasonic Clearner SB 120 DT de 40 KHz de frecuencia. La maceración se realizó en condiciones de completa oscuridad, a temperatura de 25 ± 3 ºC, utilizando 200 mL de solvente y un tiempo de 48 horas.
Posteriormente se llevaron a sequedad los extractos obtenidos en un rotoevaporador (Marca IKA, Modelos RV 05-ST-1, China) a 30 rpm y 40 ºC. Se obtuvieron 27 extractos a partir del procedimiento utilizado (Tabla), finalizado el proceso, se almacenaron a 4 ºC hasta su uso.
Tabla. Códigos utilizados para la identificación de los extractos
| Método de extracción | Solvente | Especies botánicas | ||
|---|---|---|---|---|
| Soxhlet | n-hexano | PSH | CSH | SSH |
| acetato de etilo | PSAE | CSAE | SSAE | |
| metanol | PSM | CSM | SSM | |
| Ultrasonido | n-hexano | PUH | CUH | SUH |
| acetato de etilo | PUAE | CUAE | SUAE | |
| metanol | PUM | CUM | SUM | |
| Maceración | n-hexano | PMH | CMH | SMH |
| acetato de etilo | PMAE | CMAE | SMAE | |
| metanol | PMM | CMM | SMM | |
Actividad biológica de los extractos
Para realizar la evaluación de la actividad biológica de los extractos obtenidos se utilizó un diseño completamente aleatorizado (cada extracto constituyó un tratamiento). Los extractos fueron disueltos en acetona según la metodología propuesta por Follett et al. (2014) con ligeras modificaciones para obtener una concentración de 6000 mg L-1, y un tratamiento control (maíz con la aplicación de acetona sin extractos). El experimento estuvo conformado con cinco repeticiones por tratamiento.
Se aplicó 1 mL de la disolución del extracto de cada tratamiento sobre el papel de filtro (Bringht, China), colocado en la base inferior interna de cada placa de Petri de Ø 12 cm, h=2 m. Seguidamente se ubicó la tapa de la misma y trascurridos cinco minutos, para evitar el efecto de la acetona sobre el insecto siguiendo lo recomendado por Jayakumar et al. (2017) correspondiéndose con el menor tiempo en que se pudiera evaporar compuestos importantes en estos extractos. Posteriormente le fueron agregados 10 g de semillas de maíz (seleccionadas para garantizar que no tuvieran afectaciones por insectos, ni estuvieran tratadas con insecticidas) y se procedió a infestar cada placa, con 10 parejas de insectos con 10 días de adultez para cada tratamiento. Las placas fueron selladas con PARAFILM “M” (Chicago, IL).
Consecutivamente, fueron colocadas en un local a 25 ± 2 ºC de temperatura y 70 ± 5 % de humedad relativa. La temperatura y humedad se midieron con un Hidrotermógrafo (marca TROTEC B 205). Se midió la variable, cantidad de insectos muertos en los tratamientos, cada 24 horas después de iniciado el experimento, hasta las 168 horas. El cálculo del porcentaje de mortalidad se realizó por la fórmula de Abbott modificada.
Mc - Mortalidad corregida
Mtr - Mortalidad en tratamiento
Mte - Mortalidad en testigo
A los 55 días, se evaluó las variables emergencia del insecto y pérdida de peso en los granos almacenados para semillas de maíz.
En la determinación de los porcentajes de emergencia de insectos adultos (F1) de la infestación se consideró la emergencia del tratamiento control como el 100 % de los insectos a emerger. Para ello se utilizó la fórmula siguiente:
Pe - Porcentaje de emergencia
Ptr - Porcentaje de emergencia en el tratamiento
Pte - Porcentaje de emergencia en el testigo
Al estimar el porcentaje de pérdida de peso se utilizó la fórmula propuesta por Adams y Schulten. La estimación fue calculada a los 55 días después de iniciado el ensayo, aunque no fue considerada la pérdida de humedad como acción del tratamiento.
Pp - Porcentaje de pérdida de peso
Ngd - Número de granos dañados
Ng - Número de granos
C = 0,125 (valor constante si el maíz es almacenado como grano)
Al determinar el rendimiento en la extracción de los extractos se utilizó la siguiente fórmula:
R - Rendimiento
We - Peso (g) obtenido del extracto
Wmv - Peso en (g) del material vegetal
Para agrupar los extractos se tuvo en cuenta el porcentaje de mortalidad, emergencia de nuevos adultos y la pérdida de peso a los granos de maíz, provocada por S. oryzae a la semilla. Con estos datos se realizó un análisis de conglomerados (Clúster) utilizando la Distancia Euclidiana Cuadrada como medida de similitud, mediante el paquete estadístico IBM SPSS v. 21 para Windows.
Efecto Repelente
La determinación del efecto de repelencia de los polvos sobre el gorgojo fue evaluada para cada extracto a la concentración de 6000 mg L-1 y un tratamiento control (maíz con la aplicación de acetona sin extractos).
En el bioensayo se utilizó un diseño formado por cinco cajas plásticas circulares de Ø 11 cm, h=6 cm. Para cada ensayo, se distribuyeron dos cajas simétricamente opuestas por tratamiento del extracto y dos del tratamiento control, conectados a una caja central mediante tubos plásticos de 10 cm de longitud en la que se liberaron 20 adultos de S. oryzae. Cada ensayo contó de tres repeticiones en el tiempo por tratamiento. Pasada 24 horas se contabilizó el número de insectos dentro de cada recipiente. Fue determinado el índice de repelencia para cada tratamiento. Se utilizó la ecuación del índice de repelencia (I.R.):
I.R. - índice de repelencia
G - Porcentaje de insectos presentes en el tratamiento con respecto a la placa central
P - Porcentaje de insectos presentes en el tratamiento control con respecto a la placa central
(IR=1) Neutro, (IR>1) Atrayente, (IR<1) Repelente
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Al utilizar los métodos Soxhlet, extracción asistida por Ultrasonido y Maceración, con los solventes n-hexano, acetato de etilo, metanol, y las especies más efectivas en polvos P. dioica, C. citrinus y S. malaccense evaluadas sobre S. oryzae fueron obtenidos 27 extractos.
El análisis de clúster permitió obtener cinco grupos. Estos grupos comenzaron la ramificación a distancias muy pequeñas, lo que indica que los mismos son compactos y la diversidad intragrupos es muy baja (Figura 1). El primer grupo, conformado por PMAE, PMM, PSAE, PUH, SMAE, SUH, SUAE, PMH representa el 28,57 % de los extractos obtenidos y en el mismo estuvieron agrupados los que redujeron las pérdidas en granos almacenados a valores cercanos a 6,5 % y lograron una emergencia de insectos inferior a 37 %.
En el segundo grupo se ubicó a CSAE, extracto con efecto similar al grupo anterior en cuanto al porciento de granos afectados y la reducción de la emergencia. Mientras que, la mortalidad de S. oryzae fue superior. PSM, PUAE, PUM, SMH, SMM, SSM, SUM, SSAE, CSM, CMH, CMAE, CMM, CUH, CUAE, CUM quienes representan el 53,57 % de los extractos, conformaron el tercer grupo. El mismo estuvo marcado por aglomerar extractos, cuya acción sobre los insectos provoca que estos tengan menor reducción en la población que los ubicados en los grupos I y II, mayor afectación a los granos y emergencia de insectos.
Los extractos PSH, SSH, CSH, que representan el 10,71 % de los obtenidos se agruparon en el grupo IV. Estos extractos logran un efecto insecticida más marcado al producir mayor mortalidad en los adultos, menor porcentaje de emergencia y menores pérdidas de peso de los granos. El quinto grupo solo estuvo conformado por el tratamiento control absoluto.
Figura 1 Dendrograma obtenido al agrupar los extractos según los efectos que ejercieron sobre S. oryzae
Los resultados obtenidos demuestran que los extractos afectan a S. oryzae, lo cual se confirma al agruparse los mismos en cuatro grupos, separados del tratamiento control. La mayor mortalidad de S. oryzae fue alcanzada con los extractos obtenidos con el solvente n-hexano a través del método de extracción Soxhlet.
Los extractos PSH, SSH y CSH presentan similitud a los obtenidos del material vegetal con n-hexano, solvente de baja polaridad, por lo cual, los metabolitos que componen estos extractos tienen estructuras químicas de baja polaridad. Resultado que coinciden con Pérez et al. (2017) al referir que los valores de rendimientos obtenidos están relacionados con las diferentes polaridades de los extractos, ya que los mismos contienen compuestos afines a las polaridades de los solventes.
Otro aspecto que los caracteriza es que los tres fueron obtenidos utilizando la extracción asistida por Soxhlet, CSH con rendimiento respecto al material vegetal de 4,16 % mayor que cuando se utiliza la Maceración 1,1 % o extracción asistida por Ultrasonido 3,96 %, sin embargo, con PSH 1,12 % y SSH 1,60 % sucede lo contrario, pues estos son los rendimientos más bajos entre los diferentes métodos utilizados.
La extracción de metabolitos mediante este procedimiento tiene como ventajas que aumenta la eficiencia del proceso, consume menor cantidad de solvente y el equipamiento utilizado es sencillo (Heleno et al., 2015). Como desventaja, se realiza a altas temperaturas, esto último implica un mayor gasto energético, pero esto se ve compensado por las ventajas antes mencionadas, todo lo cual hace que este método pueda ser utilizado para obtener los extractos promisorios a mayor escala. Por otra parte, es necesario destacar que en este caso la aplicación de calor no provoca la afectación apreciable de la actividad biológica de estos productos lo cual se constata en el hecho de que los resultados fueron mejores a los extractos obtenidos en los otros procedimientos pese a ser trabajados a temperatura ambiente.
Los resultados muestran las potencialidades de estas especies botánicas al reducir las afectaciones provocada por S. oryzae. Se puede apreciar que los efectos de los extractos sobre los insectos son similares a los alcanzados por Viglianco et al. (2008) cuando refiere que los extractos obtenidos de hojas de Larrea divaricata Cav. (Zygophyllaceae) y Capparis atamisquea Kuntze (Capparaceae) con el solvente n-hexano, mostraron un elevado efecto antialimentario y un moderado índice de repelencia sobre S. oryzae.
No obstante, los extractos obtenidos con el solvente metanol mostraron una reducción en la población del insecto. Los daños causados por estos, confirman que los metabolitos secundarios extraídos con solventes más polares también poseen efecto insecticida. Resultados similares relacionados con el uso de metanol han sido referidos por Osaigbokan et al. (2017) con extractos de Cymbopogon citratus L. sobre S. oryzae.
Al evaluar los bioensayos realizados todos los extractos registraron valores de I.R. menores a 1 para todas las concentraciones evaluadas, resultados que muestran como las tres especies botánicas evaluadas, pueden mantener alejados al insecto del grano, evitando infestaciones externas, lo que confiere un efecto preventivo a las mismas. La mayor repelencia sobre S. oryzae se alcanzó con P. dioica ultrasonido hexano (PUH) 0,32, y C. citrinus Soxhlet-hexano (CSH) 0,35 (Figura 2).
En las barras verticales se indica el error del porcentaje (5 %)Figura 2 Índice de repelencia de los extractos a la concentración de 6000 mg L-1 sobre S. oryzae
Los resultados obtenidos coinciden con los criterios de Mazzonetto y Vendramim (2003) que refieren como repelencia alta cuando el índice de repelencia oscila entre 0,26-0,50. La presencia del efecto repelente en estas especies puede estar relacionado con la concentración de terpenos, compuestos abundantes en la familia Myrtaceae. Las especies botánicas evaluadas constituyen alternativas capaces de provocar menor impacto ambiental para el control de insectos plagas de almacén.
CONCLUSIONES
Los resultados confirman el efecto in vitro sobre S. oryzae que poseen los extractos obtenidos de las especies Pimenta dioica (L.) Merr, Callistemon citrinus (Curtis) Skeels y Syzygium malaccense (L.) Merr. &L.M. Perry. Todos los extractos obtenidos mostraron efecto repelente.
Los extractos PSH, SSH, CSH presentaron los mayores efectos insecticidas, redujeron las pérdidas en granos almacenados y disminuyeron la emergencia de insectos
